阿司匹林對(duì)小鼠胚胎腭裂發(fā)生的作用研究

萬(wàn) 哲， 陳莉娜， 龔新記， 塔拉甫·托坎， 林 晨

(新疆醫(yī)科大學(xué)1附屬中醫(yī)醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830000； 2臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)2011-4班； 3臨床醫(yī)學(xué)本碩2010-2班；4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011)

腭裂動(dòng)物模型的建立在腭裂病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制及臨床治療等研究中具有重要的作用[1]。腭裂的發(fā)生主要是由于胚胎早期發(fā)育過(guò)程中腭突融合障礙所致,一般是遺傳及環(huán)境因素相互作用的結(jié)果,其中妊娠早期誤服藥物也可能是其發(fā)生原因之一。胚胎腭器官發(fā)生期是器官的形成階段, 同時(shí)又是胚胎致畸的敏感階段。阿司匹林可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致畸作用和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。以往的研究顯示，阿司匹林易通過(guò)胎盤引起動(dòng)物畸形，表現(xiàn)為露腦及腦膨出、脊椎裂、腹裂、尾部彎折、肢體外翻，其中以神經(jīng)系統(tǒng)畸形最為明顯[2]。目前阿司匹林已作為致畸實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性物使用[3]，但阿司匹林致先天性腭裂的模型尚未建立。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同劑量阿司匹林對(duì)小鼠胚胎腭裂形成的作用，確立最佳濃度，為小鼠腭裂動(dòng)物模型的建立和開展后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)用藥：阿司匹林(acetyl salicylic acid，Sigma A5376,USA,純度≥99%，規(guī)格：100 g)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/C小鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8～10周齡，體質(zhì)量均≥22 g。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng) 小鼠飼養(yǎng)在(25±2)℃和人工調(diào)控12 h晝夜循環(huán)條件下，給予充足水和食物。將未交配生育過(guò)的雌雄小鼠以5∶2的比例合籠，次日晨檢查雌鼠，有陰道栓者記為胚胎第0天(embryo 0，E0)，標(biāo)記并稱體質(zhì)量，取出單獨(dú)飼養(yǎng)。胚胎第10天(E10)時(shí)體質(zhì)量增加<2 g者判定為假孕，取出重新交配，體質(zhì)量增加≥2 g者判定為受孕，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及給藥 將50只孕鼠隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)Ⅰ～Ⅳ組，每組10只孕鼠。胚胎第10～12天(E10～E12)時(shí)，每天早上8時(shí)給予對(duì)照組孕鼠灌胃生理鹽水，實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組孕鼠分別灌胃阿司匹林180、210、240、270 mg/kg。灌胃量按10 mL/kg體質(zhì)量計(jì)算。

1.2.3 標(biāo)本收集和分析 E18時(shí)稱重孕鼠后以斷頸法處死，完整分離胚胎和子宮，稱量胚胎總重量，記錄胚胎總體質(zhì)量及孕鼠增加體質(zhì)量(E18孕鼠體質(zhì)量-胚胎總重量-E10孕鼠體質(zhì)量)，并計(jì)算每個(gè)胚胎的重量。取出的胚胎剪掉下頜和舌，在光學(xué)顯微鏡下觀察胚胎腭裂的發(fā)生情況。

1.2.4 切片與染色 制作方法: 將剪下的下頜放于梯度酒精脫水、浸蠟后常規(guī)石蠟包埋,包埋時(shí)小鼠喙部朝下。包埋好后準(zhǔn)備用于切片,切片時(shí)以麥克爾軟骨為基準(zhǔn)面, 作冠狀位連續(xù)切片,切片厚約6 μm。石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、蒸餾水洗滌、蘇木精染色、自來(lái)水洗、0.5%鹽酸酒精分化、自來(lái)水藍(lán)化、伊紅染色、脫水、透明、封片，光鏡觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)孕鼠及胎鼠體質(zhì)量變化進(jìn)行方差分析。對(duì)腭裂的發(fā)生情況進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1孕鼠體質(zhì)量的變化實(shí)驗(yàn)組E18孕鼠增加體質(zhì)量均低于對(duì)照組E18。對(duì)照組孕鼠體質(zhì)量增加最多，為(5.67±1.10) g；實(shí)驗(yàn)Ⅰ組其次，為(5.45±0.82) g；實(shí)驗(yàn)Ⅳ組孕鼠體質(zhì)量增加最少，為(2.86±1.50) g。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組孕鼠增加體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.546，P>0.05)，但實(shí)驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組孕鼠增加的體質(zhì)量低于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.421，P<0.05)。

2.2胎鼠體質(zhì)量變化分析對(duì)照組胎鼠體質(zhì)量最大，為(2.23±0.22) g，實(shí)驗(yàn)Ⅳ組胎鼠體質(zhì)量最小，為(1.98±0.50) g，隨著阿司匹林劑量增加胎鼠體質(zhì)量降低，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.597，P>0.05)。

2.3胚胎腭裂發(fā)生情況對(duì)照組胎鼠的腭裂發(fā)生數(shù)與實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.231,P>0.05；χ2=0.992,P>0.05)。對(duì)照組腭裂發(fā)生率明顯低于實(shí)驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.057，P<0.01；χ2=17.551，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)Ⅲ組腭裂發(fā)生率高于實(shí)驗(yàn)Ⅳ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.742，P<0.01)。在給予孕鼠灌胃240 mg/kg和270 mg/kg阿司匹林后，胎鼠的腭裂發(fā)生率明顯上升，見表1。

表1 各組胎鼠腭裂分布情況/只(%)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01； 與實(shí)驗(yàn)Ⅲ組比較，△P<0.01。

2.4光鏡組織學(xué)觀察結(jié)果E18時(shí)對(duì)照組可見到1只胚胎發(fā)生腭裂，其余胚胎正常腭突正常融合，可見兩側(cè)腭突延伸至鼻中隔，與鼻中隔完全相融合，將口腔和鼻腔完全分開，見圖1。實(shí)驗(yàn)Ⅲ組發(fā)生腭裂最多，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組發(fā)生數(shù)最少，發(fā)生明顯腭裂的胚鼠標(biāo)本可見兩側(cè)腭突形態(tài)小，腭部正中有一邊緣不太規(guī)整的裂隙,未能與鼻中隔完全相融合，其長(zhǎng)度、寬度不一,長(zhǎng)度一般為 1～5 mm，見圖2、3、4。

圖1 對(duì)照組小鼠腭部正常融合(HE×40)

圖2 實(shí)驗(yàn)Ⅰ組小鼠腭部未完全融合(HE×40)

圖3 實(shí)驗(yàn)Ⅱ組小鼠腭部未融合(HE×100)

圖4 實(shí)驗(yàn)Ⅲ組小鼠腭部未融合(HE×100)

3 討論

人與動(dòng)物組織胚胎學(xué)研究已證明雙側(cè)腭突的融合失敗是導(dǎo)致腭裂發(fā)生的直接原因，其發(fā)生主要是由于腭突中嵴上皮(MEE)細(xì)胞分化異常的結(jié)果[4]。腭裂的發(fā)生具有較強(qiáng)的遺傳因素，此外一些環(huán)境因素也成為唇腭裂發(fā)生的重要因素，例如孕婦在孕期吸煙、酗酒、服用藥物、接觸某些化學(xué)物質(zhì)[5]。阿司匹林能引起動(dòng)物胚胎致畸，對(duì)動(dòng)物母體也具有較強(qiáng)的生殖毒性，能夠明顯地增加死胎數(shù)、吸收胎數(shù)，降低活胎數(shù)。大劑量或長(zhǎng)期服用阿司匹林可導(dǎo)致孕婦貧血、孕期增長(zhǎng)、胎盤早剝?cè)黾覽6-7]。但致小鼠腭裂的模型和機(jī)制尚未形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量阿司匹林能減輕孕鼠體質(zhì)量；胎鼠體質(zhì)量與阿司匹林劑量呈相反趨勢(shì)；隨著阿司匹林劑量的增加，腭裂的發(fā)生率增高,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最高劑量和最低劑量均未獲得明顯的腭裂致畸效果。高濃度阿司匹林導(dǎo)致胚胎的死亡增多，獲取的腭裂小鼠數(shù)量減少；低濃度阿司匹林致胚胎存活率上升，但致畸率下降。不同劑量的阿司匹林對(duì)小鼠腭裂致畸強(qiáng)度有差異，說(shuō)明阿司匹林對(duì)小鼠腭裂的致畸存在最佳的致畸濃度。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)Ⅲ組的致畸率較高，死亡率最低，致畸效果穩(wěn)定，相對(duì)符合理想致畸物的標(biāo)準(zhǔn)。故認(rèn)為240 mg/kg為本實(shí)驗(yàn)致小鼠腭裂的最佳濃度。這可能與阿司匹林能夠抑制胚胎時(shí)期組蛋白的脫乙?；?，從而干擾了核心組蛋白的脫乙?；?，改變了染色體的結(jié)構(gòu)，發(fā)生蛋白質(zhì)異常表達(dá)，造成胚胎時(shí)期畸形有關(guān)[8]。所以阿司匹林導(dǎo)致腭裂形成機(jī)制可能是多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞的分化和增殖發(fā)生異常。

陽(yáng)性致畸物的選擇是致畸實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，目前供致畸實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性致畸物的選擇較多，但針對(duì)藥物藥理作用或作用部位的選擇一個(gè)針對(duì)性強(qiáng)、致畸率高且死亡率低的陽(yáng)性致畸物卻是一個(gè)難題。在規(guī)定劑量下以維生素A作為陽(yáng)性致畸物致畸效果也較穩(wěn)定，但對(duì)孕鼠生殖能力、胎鼠身長(zhǎng)、體質(zhì)量均無(wú)明顯影響(P>0.05)。阿司匹林不僅能影響孕鼠生殖能力，還能影響胎鼠發(fā)育，尤其對(duì)胎鼠骨骼發(fā)育影響顯著[9]，也能促進(jìn)口腔腭裂形成，這說(shuō)明阿司匹林作為致畸實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性致畸物是成功的，對(duì)研究胚胎腭裂的動(dòng)物模型建立有一定的價(jià)值和意義。

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