參 麥 注 射 液 對 早 產(chǎn) 腦 損 傷 仔 鼠 腦 組 織 GAP-43 和IL-21 表達的影響

王冬 周慧茹

參 麥 注 射 液 對 早 產(chǎn) 腦 損 傷 仔 鼠 腦 組 織 GAP-43 和IL-21 表達的影響

王冬 周慧茹

目的 從宮內(nèi)感染致早產(chǎn)的仔鼠腦組織中神經(jīng)生長相關(guān)蛋白 (GAP-43)和白介素 21(IL-21)的表達方面研究參麥的腦損傷保護機制。方法 采用孕鼠腹腔注射脂多糖造成宮內(nèi)感染模型 , 將早產(chǎn)仔鼠隨機分為 ：模型組、神經(jīng)節(jié)苷脂組、參麥組、聯(lián)合組 , 腹腔注射生理鹽水組所生仔鼠為對照組 , 每組保證成活 8 只。7 日齡時開始分組用藥 ：模型組予生理鹽水腹腔注射 , 神經(jīng)節(jié)苷脂組予申捷腹腔注射 , 參麥組予參麥注射液腹腔注射 , 聯(lián)合組予申捷聯(lián)合參麥注射液腹腔注射 , 共 14 d。21 日齡時取仔鼠腦組織 ,應(yīng)用免疫組化方法對 GAP-43 和白介素 21 進行測定。結(jié)果 用藥組仔鼠腦組織中 GAP-43 表達增多、白介素 21 表達減少 , 其中聯(lián)合組療效優(yōu)于神經(jīng)節(jié)苷脂組和參麥組 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。結(jié)論 參麥注射液對宮內(nèi)感染致早產(chǎn)腦損傷仔鼠的腦保護作用可能與其促進腦組織中 GAP-43 表達增多、抑制白介素 21表達有關(guān)。

參麥 ；宮內(nèi)感染 ；腦白質(zhì)損傷 ；神經(jīng)生長相關(guān)蛋白 ；白介素 21

腦癱是現(xiàn)代兒童致殘主要原因之一 , 隨著醫(yī)療技術(shù)的提高 , 早產(chǎn)成為腦癱最主要的致病因素。早產(chǎn)是圍產(chǎn)期諸多不良因素作用的結(jié)果 , 宮內(nèi)感染導(dǎo)致的早產(chǎn)主要是由于感染引起的炎癥反應(yīng)所致 , 諸多細胞因子參與其中 , 形成宮內(nèi)感染 -細胞因子的釋放-腦白質(zhì)損傷-腦癱鏈條。尋求有效預(yù)防或改善宮內(nèi)感染所致的腦損傷的藥物、降低腦癱的發(fā)生率是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的重要研究課題。參麥注射液可改善心、肝、腦等主要臟器的供血［1］, 目前臨床上多用于缺血性心、腦血管疾病的治療。本研究旨在研究參麥注射液對宮內(nèi)感染致早產(chǎn)幼鼠腦組織神經(jīng)生長相關(guān)蛋白 (GAP-43)、白介素 21表達的影響 , 為參麥注射液治療早產(chǎn)兒腦損傷尋求實驗室證據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料 清潔級成熟 Wistar大鼠由鄭州大學(xué)動物實驗中心提供。雌性大鼠 30只 , 平均體重 (250±20)g, 雄性大鼠 15只 , 平均體重 (280±20)g。常規(guī)飼養(yǎng) , 飲食自由 , 12 h/12 h明暗周期 , 室溫恒定 21℃。1周后 , 16：00以 2:1合籠 , 次日 7:00行陰道脫落細胞涂片檢查 , 查得精子的孕鼠另籠飼養(yǎng) , 檢查當(dāng)日為孕第0天。

1. 2 主要試劑 脂多糖 (LPS)血清型、GAP-43試劑盒、白介素 21 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。參麥注射液 ：河北神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn) 。申捷 ：神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液 , 吉林英聯(lián)生物制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1. 3 模型制備及分組 將受孕大鼠隨機分為生理鹽水組(n=8只 )和 LPS組 (n=16只 ), LPS組 孕 鼠 于 孕 16 d腹 腔 注射 LPS 450 μg/(kg·d), 連續(xù) 2 d, 生理鹽水組腹腔注射同等劑量的生理鹽水 , 連續(xù) 2 d。孕 22 d前分娩的仔鼠為早產(chǎn)仔鼠。分娩后隨機選取兩組孕鼠各 2只 , 取胎盤行 HE染色觀察宮內(nèi)感染情況。隨機選取生理鹽水組足月產(chǎn)仔鼠8只作為對照組 , 選取 LPS組早產(chǎn)仔鼠 32只 , 隨機分為參麥組、神經(jīng)節(jié)苷脂組、聯(lián)合組、模型組等四組 , 每組 8只仔鼠。五組大鼠恒溫恒濕 , 母乳喂養(yǎng) , 7日齡時開始腹腔注射用藥 ：參麥組予參麥注射液 8 ml/(kg·d), 神經(jīng)節(jié)苷脂組予申捷 4 ml/(kg·d),聯(lián)合組予申捷聯(lián)合參麥注射液 (參麥注射液 8 ml/(kg·d)申捷 4 ml/(kg·d)；模型組予生理鹽水 4 ml/(kg·d), 共 14 d。21日齡時各組仔鼠均斷頭處死 , 取腦組織固定后石蠟包埋 , 4 μm切片厚度 , 應(yīng)用免疫組化方法對 GAP-43和 IL-21進行測定。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用統(tǒng)計學(xué)軟件 SPSS13.0處理數(shù)據(jù) , 計量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 ( x-±s)表示 , 采用 t檢驗 , 采用單因素方差分析比較不同組間的相關(guān)性 , 以 P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 胎盤病理檢查結(jié)果 生理鹽水組母鼠胎盤病理檢測未見明顯炎癥反應(yīng) , LPS組母鼠胎盤內(nèi)可見大量中性粒細胞浸潤、血管充血、水腫。

2. 2 免疫組化的檢測結(jié)果 GAP-43、IL-21的檢測按免疫組織化學(xué)試劑盒步驟進行 , 利用自動圖像分析系統(tǒng)對染色結(jié)果進行定量分析。各組各取 6張組織切片 , 鏡下隨機選取 6個位點測量陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物面積 , 取平均值 , 結(jié)果表1。

表1 不同組間的 GAP-43和 IL-21表達

本研究結(jié)果顯示 , IL-21 在模型組腦室旁白質(zhì)中含量最高 , 對照組含量最低 , 兩組間相比有極顯著差異 (P＜0.01)；與模型組相比 ：參麥組、神經(jīng)節(jié)苷脂組 IL-21 含量明顯下降 ,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05), 聯(lián)合組 IL-21 含量明顯下降 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；與聯(lián)合組相比 , 參麥組和神經(jīng)節(jié)苷脂組的 IL-21 含量偏高 (P＜0.05)；參麥組與神經(jīng)節(jié)苷脂組比較兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。GAP-43 在對照組腦室旁白質(zhì)中陽性細胞數(shù)目屬最高 , 與對照組相比 , 模型組中 GAP-43 陽性細胞數(shù)明顯偏低 (P＜0.01), 聯(lián)合組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05), 參麥組和神經(jīng)節(jié)苷脂組較空白組偏低 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；與模型組相比 , 聯(lián)合組中 GAP-43陽性細胞數(shù)明顯增多 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01), 參麥組和神經(jīng)節(jié)苷脂組較模型組 GAP-43 陽性細胞數(shù)增多 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；與聯(lián)合組相比 , 參麥組和神經(jīng)節(jié)苷脂組GAP-43 陽性細胞數(shù)偏低 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；參麥組和神經(jīng)節(jié)苷脂組間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。

3 討論

近年來 , 由于產(chǎn)科技術(shù)、圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)、新生兒醫(yī)學(xué)的發(fā)展 ,新生兒死亡率、死胎發(fā)生率均有明顯下降 , 但腦癱發(fā)病率并無減少趨勢 , 重癥腦癱的比例有增多趨勢 , 且早產(chǎn)成為腦癱的主要病因之一。尋找可以促進損傷的腦神經(jīng)反應(yīng)性再生、結(jié)構(gòu)重建的藥物 , 從而降低腦癱的發(fā)生率、減輕腦癱兒的殘障程度 , 是基礎(chǔ)研究的方向。

參麥注射液源于古醫(yī)方生脈散 , 由人參、麥冬等制備 ,可改善心、肝、腦等主要臟器的供血 , 能提高機體耐缺氧能力、改善微循環(huán) ,對缺血性損害有保護性作用 , 目前臨床上多用于缺血性心、腦血管疾病的治療。但針對參麥治療早產(chǎn)兒腦損傷的作用機制研究較少。神經(jīng)節(jié)苷脂針具有保護腦細胞膜 ,在腦細胞的生長、分化和再生過程中起關(guān)鍵作用 , 同時能促進腦細胞的損傷和修復(fù) , 維持神經(jīng)功能。既往［2］研究發(fā)現(xiàn)外源性的神經(jīng)節(jié)苷脂能明顯縮短缺氧缺血性腦病的病程 , 降低缺氧缺血性腦病患兒的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥發(fā)生率。

LPS 是革蘭陰性細菌感染后炎癥反應(yīng)的主要成分 , 將其注入孕鼠腹腔 , 可造成新生仔鼠早產(chǎn)、仔鼠腦損傷模型。有研究表明［3］仔鼠腦組織內(nèi) IL-1β、腫瘤壞死因子 (TNF-a) mRNA 呈劑量依賴性增加 , IL-1β、腫瘤壞死因子 (TNF-a)通過一氧化氮合成酶出現(xiàn)協(xié)同炎癥反應(yīng)而致腦損傷 , 而且內(nèi)毒素的釋放增加腦缺血及出血的危險性。

GAP-43 主要分布在已定性并開始軸突生長的神經(jīng)元細胞中 , 它與軸突延伸生長、突觸的形成有嚴(yán)格的同步性 , 因而將 GAP-43 視為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)的重要標(biāo)記物之一［4］。神經(jīng)節(jié)苷脂是神經(jīng)細胞膜的組成成分 , 是臨床應(yīng)用廣泛、作用明確的營養(yǎng)神經(jīng)藥物 , 對腦神經(jīng)的修復(fù)有作用。本研究結(jié)果表明 , 腦損傷早期積極應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)藥物可使 GAP-43 表達增高 , 聯(lián)合組的 GAP-43 的表達明顯高于參麥組和神經(jīng)節(jié)苷脂組 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 , 說明參麥可以增強神經(jīng)節(jié)苷脂的腦保護作用 , 促進神經(jīng)的修復(fù)和再生。

IL-21 是一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子 , 它可以調(diào)節(jié) T 細胞的增值 , 促進 B 細胞、NK 細胞的增殖、分化并能提高 NK細胞殺傷活性 , 它在免疫應(yīng)答中的依賴性可能根據(jù)免疫環(huán)境的變化而不同。以往研究表明［5］在免疫系統(tǒng)疾病 (克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、艾滋病、原發(fā)性干燥綜合癥 )中 IL-21 對組織細胞有破壞性作用 , 同時它對腫瘤細胞有明顯的抑制作用。本研究結(jié)果表明 , IL-21 在腦損傷早期表達增多 , 可能參與炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大作用 , 應(yīng)用營養(yǎng)神經(jīng)藥物可降低其表達 , 聯(lián)合用藥較單一用藥效果明顯 , 說明參麥注射液能夠通過降低 IL-21 的表達起到其腦保護作用。

本研究結(jié)果顯示 , 參麥對宮內(nèi)感染致早產(chǎn)腦損傷仔鼠腦組織中 GAP-43 和 IL-21 表達有調(diào)節(jié)作用 , 它與神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合應(yīng)用可明顯降低腦組織中 IL-21 表達和使 GAP-43 表達升高 , 從而達到減輕腦損傷、促進神經(jīng)生長、修復(fù)的作用。

綜上所述 , 腦癱的治療療程較長 , 無論是從經(jīng)濟上還是從心理上都給患者家庭帶來沉重負(fù)擔(dān) , 參麥注射液是一種中藥制劑 , 能夠從根本上提高機體耐缺氧能力、改善微循環(huán) ,對缺血性損害有保護性作用 , 是腦癱患者的有效治療藥物 ,還可以大大降低腦癱治療的成本 , 具有很好的社會效益、可觀的經(jīng)濟效益和特殊的學(xué)術(shù)價值。

參考文獻

［1］楊明 , 孫群 , 鄭志育 , 等 . 大劑量參麥注射液輔助治療新生兒充血性心力衰竭療效觀察 .中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 , 2006, 16(4): 610-611.

［2］曾林 . 神經(jīng)節(jié)苷脂治療新生兒缺氧缺血性腦病療效觀察 .中國實用神經(jīng)疾病雜志 , 2009, 12(3):84-85.

［3］Saliba E, Henrot A. Inflammatory mediators and neonatal brain damage. Biol Neonate, 2001, 79(324):224-227.

［4］Shen Y, Mani S, Donovan SL, et al. Grow associated pro-tein-43 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. J Neurosci, 2002, 22(21):239-241.

［5］王士杰 . 白細胞介素 21 的基礎(chǔ)與臨床研究進展 . 安徽醫(yī)藥 , 2009, 13(9):1016-1017.

2014-04-11］

471000 洛陽市婦女兒童醫(yī)療保健中心康復(fù)科 (王冬 )；河南中醫(yī)學(xué)院 (周慧茹 )