免疫熒光法在微生物快速檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究

艾春英

免疫熒光法在微生物快速檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究

艾春英

目的探討免疫熒光法在呼吸道感染患者快速檢測(cè)中的臨床應(yīng)用效果。方法采用免疫熒光法對(duì)2011年9月~2013年9月本院所接受治療的200例上呼吸道感染患者鼻、咽分泌物標(biāo)本進(jìn)行快速檢驗(yàn), 檢測(cè)呼吸道感染患者感染病毒種類及其感染率。結(jié)果200例患者中, 病毒感染陽性者178例, 病毒感染率為89%。包括呼吸道合胞病毒陽性者24例, 腺病毒者49例, 流感病毒A、B者各38例、29例, 副流感病毒1、2、3各10、16、12例, 感染率分別為13.48%、27.53%、21.35%、16.29%、5.62%、8.99%、6.42%。上呼吸道感染患者中病毒感染者占絕大多數(shù), 其中尤以腺病毒感染率最高。結(jié)論免疫熒光能快速檢測(cè)患者病毒感染種類且敏感性高, 為上呼吸道感染患者治療有良好的效果, 值得臨床推廣使用。

免疫熒光法；上呼吸道感染；病毒檢驗(yàn)

免疫熒光技術(shù)是指應(yīng)用將抗原和抗體相結(jié)合的生物反應(yīng)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的原理, 把血清學(xué)特異性、熒光色素的敏感性和顯微鏡檢查法融為一體。該方法由于特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快成為今年來診斷學(xué)應(yīng)用越來越廣的手段之一。目前已經(jīng)應(yīng)用于多種病毒、細(xì)菌、真菌的快速檢測(cè)中。急性上呼吸道感染95%以上均為病毒感染所引起, 主要常見的有呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、副流感病毒等［1］。本文采用免疫熒光法檢測(cè)對(duì)200例上呼吸道感染患者進(jìn)行快速診斷, 以對(duì)患者感染病毒種類進(jìn)行快速診斷, 結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所有對(duì)象均來自電子科技大學(xué)醫(yī)院2011年9月~2013年9月呼吸科所接受治療的上呼吸道感染患者200例, 包括男性128例、女性72例, 年齡在3~80歲之間, 平均年齡為(56.4±2.8)歲。包括喉部感染患者38例、咽部感染者69例、鼻部感染者93例。有13人并發(fā)急性心肌炎、10人伴有腎炎、8人并發(fā)風(fēng)濕熱癥。

1.2研究方法

1.2.1檢測(cè)試劑 本研究共使用7項(xiàng)病毒熒光檢測(cè)試劑盒,均由美國(guó)DHI公司提供, 包括：熒光標(biāo)志抗體試劑盒, 熒光標(biāo)志的單克隆抗體試劑盒, 針對(duì)呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、2、3型試劑盒。除此之外還有濃縮洗滌液(40×), 封閉液、病原體相關(guān)對(duì)照玻片(包括陽性對(duì)照記陰性對(duì)照的點(diǎn)樣孔)。

1.2.2檢測(cè)方法 標(biāo)本的收集及處理：①采取負(fù)壓吸引器先將患者鼻、咽、喉部的分泌物, 大約2~3 ml, 將分泌物移至無菌生理鹽水中。②反復(fù)吹打分泌物, 移至離心管中。③離心除去上清液, 轉(zhuǎn)速500 r/min, 時(shí)間為8 min。④將沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌, 混勻。⑤重復(fù)離心步驟, 除去上層,重復(fù)直至上清液不在粘稠。⑥將最后一次離心的沉淀溶解于0.5~1 ml磷酸鹽緩沖鹽溶液中, 吹打使其成為細(xì)胞懸液。⑦在病原體對(duì)照玻片中每孔點(diǎn)入25 μl的細(xì)胞懸液。⑧使點(diǎn)樣孔風(fēng)干, 再用冷丙酮固定10 min。

熒光染色：主要包括3個(gè)步驟, ①在對(duì)照玻片樣孔中的細(xì)胞中滴加上1滴相對(duì)應(yīng)的熒光抗體20 μl, 于37℃保濕盒中孵育0.5 h。即1~7號(hào)樣孔中一次滴加熒光標(biāo)志抗體作陰性對(duì)照, 熒光標(biāo)志單克隆抗體做陽性對(duì)照, 以及呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、2、3型試劑盒作樣品孔。②用洗滌液將玻片中細(xì)胞洗滌數(shù)次,數(shù)次之后再用蒸餾水洗滌1 min。③待蒸餾水風(fēng)干后將玻片孔中滴加入1滴封閉液, 蓋上蓋玻片, 再用熒光顯微鏡觀察。

1.3診斷原則及判斷的依據(jù) ①診斷原則：被熒光標(biāo)志的相對(duì)應(yīng)病毒特異性單克隆抗體與其抗原結(jié)合后, 形成結(jié)合復(fù)合物, 在熒光顯微鏡下可見綠色熒光, 而未被染色的則會(huì)被Evans藍(lán)染為紅色。② 陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：熒光顯微鏡下顯示綠色熒光為陽性, 無熒光為陰性, 當(dāng)在顯微鏡放大倍數(shù)為200時(shí), 有≥2個(gè)熒光細(xì)胞則認(rèn)為標(biāo)本為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 統(tǒng)計(jì)患者各種病毒種類感染例數(shù)及相應(yīng)感染率。

2 結(jié)果

在所研究的200例患者中, 患者各種病毒感染數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 上呼吸道病毒感染患者感染種類及感染率(n=178)

3 討論

免疫熒光法主要使用的試劑為患者血清以及其免疫熒光抗體。該試驗(yàn)要求試劑對(duì)關(guān)鍵的部分抗原應(yīng)具有高度的特異性, 即單特異性抗體制劑［2］。近年來, 在人工合成免疫原方面取得了進(jìn), 經(jīng)研究判明, 沙門氏菌的群特異性抗原決定簇是一種雙糖［3］。于是, 人們用人工方法合成高純度的這種雙糖, 再與蛋白質(zhì)結(jié)合成免疫原, 就可制出群特異性極強(qiáng)的單特異性抗體, 新近發(fā)展起來的制備單克隆抗體的技術(shù), 也為制備各種單特異性抗體開辟了廣闊的道路［4］。

本研究通過將免疫熒光法應(yīng)用于近兩年本院接收治療的上呼吸道感染患者200例, 通過對(duì)患者細(xì)胞標(biāo)本與相對(duì)應(yīng)的抗體作抗原抗體反應(yīng), 通過反應(yīng)陽性與否判斷患者相對(duì)應(yīng)的感染病毒種類。通過試驗(yàn)結(jié)果顯示, 200例患者中有178例患者病毒感染陽性者178例, 病毒感染率為89%。呼吸道和胞病毒、腺病毒、流感病毒A、B, 副流感病毒1、2、3感染率分別為13.48%、27.53%、21.35%、16.29%、5.62%、8.99%、6.42%, 結(jié)果準(zhǔn)確且快速。免疫熒光法能夠 準(zhǔn)確且快速的檢測(cè)出患者感染呼吸道的種類, 效果可靠。該方法能夠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)2 h時(shí)間且在僅需要熒光顯微鏡的設(shè)備以及相對(duì)應(yīng)試劑盒下即可檢測(cè)出患者感染病毒種類, 且簡(jiǎn)單、廉價(jià), 能為一般實(shí)驗(yàn)室所開展。

總之, 免疫熒光技術(shù)用于微生物學(xué)快速檢驗(yàn)已初露鋒芒,目前還在不斷與其它先進(jìn)技術(shù)結(jié)合, 逐漸發(fā)展得更加完善。

［1］ 唐盛, 林恒先, 龔海濤, 等.免疫熒光法檢測(cè)奈瑟氏淋球菌方法的建立及其臨床應(yīng)用評(píng)價(jià).標(biāo)記免疫分析與臨床, 2011, 18(2): 107-110.

［2］ 金之瑾, 陳健, 顧志芬, 等.間接免疫熒光法在弓形體檢測(cè)中的臨床應(yīng)用.第六屆全國(guó)優(yōu)生科學(xué)大會(huì)論文匯編, 2006(01): 147-149.

［3］ 黃秋林, 許翔, 蔣淑芳.直接免疫熒光法對(duì)多種呼吸道病毒檢測(cè)的臨床意義.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2008, 5(3):135-137.

［4］ 顏善活.免疫熒光檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的臨床應(yīng)用分析.中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué), 2010(30):19-21.

610054 電子科技大學(xué)校醫(yī)院檢驗(yàn)科