墨蘭ISSR—PCR反應(yīng)體系建立及優(yōu)化

張睿等

摘要：為建立墨蘭的ISSR-PCR反應(yīng)體系，采用正交試驗(yàn)分析了5個(gè)因素

1引言

墨蘭（Cymbidium sinense）花瓣香氣濃郁、花色多變、葉形獨(dú)特，是國(guó)蘭中株型最大，花莖最長(zhǎng)的種類。目前對(duì)于墨蘭的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及孢粉學(xué)上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[3]，該技術(shù)在SSR（即簡(jiǎn)單序列重復(fù)）技術(shù)的基礎(chǔ)上有所發(fā)展，使實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便且迅速，穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，現(xiàn)今在基因定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、進(jìn)化以及系統(tǒng)發(fā)育等研究中被廣泛應(yīng)用[4]。不同植物對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系要求不同，因此在利用ISSR標(biāo)記之前，必須建立該種植物最適ISSR-PCR反應(yīng)體系。本研究旨在通過(guò)正交試驗(yàn)分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5個(gè)因子在4個(gè)水平上對(duì)墨蘭ISSR-PCR反應(yīng)影響，并據(jù)此建立墨蘭最適ISSR-PCR反應(yīng)體系，為利用ISSR標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

2材料與方法

試驗(yàn)材料墨蘭來(lái)源于國(guó)家林業(yè)局保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)方法包括以下3種。

（1）墨蘭基因組DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨蘭基因組DNA。

4結(jié)語(yǔ)

采用正交試驗(yàn)分析5個(gè)因素（Tag酶濃度、Mg2+濃度、模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃度）在4個(gè)水平上對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：Tag酶濃度為16U/25μL、Mg2+濃度為24mmol/L、dNTP濃度096 mmol/L、Primer濃度為064μmol/L、DNA濃度32ng/25μL是墨蘭ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系。Tag酶用量直接影響擴(kuò)增反應(yīng)成功與否，濃度過(guò)高造成浪費(fèi)，但如果Tag酶濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物合成效率下降。Mg2+ 濃度主要是通過(guò)影響Tag酶活性從而影響PCR反應(yīng)。dNTP作為PCR反應(yīng)的原料，濃度太低會(huì)使擴(kuò)增不完全，從而降低PCR產(chǎn)物產(chǎn)量；濃度過(guò)高會(huì)對(duì)Mg2+產(chǎn)生抑制作用，降低Mg2+的有效濃度，影響Tag酶的活力，造成浪費(fèi)。本試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步建立優(yōu)化、系統(tǒng)的ISSR-PCR反應(yīng)體系提供了初步的科學(xué)數(shù)據(jù)，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)墨蘭進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性及遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張孟錦，楊志娟蘭花育種途徑與進(jìn)展[J]廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（2）：120～123

[2] 鄭萬(wàn)均，傅立國(guó)中國(guó)植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J]遺傳，2002，24（5）：613～616

[5] 孫正海，王錦，李世峰，等滑葉藤ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（5）：746～750

[6] 李愛(ài)民，秀麟，陳功錫墨蘭解剖學(xué)研究[J]熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002，10（4）：295～300

[7] 劉塔斯，林麗美，龔力民，等分子標(biāo)記中植物DNA提取方法的研究進(jìn)展[J]中南藥學(xué)，2005，3（6）：0370～04

[8] 項(xiàng)艷，於安鳳，彭鎮(zhèn)華墨蘭離體快繁研究[J]林業(yè)科學(xué)研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，劉運(yùn)生，陳立華正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J]湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：03～404

[10] 劉峰，顧志敏，陳析豐，等長(zhǎng)春花ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化[J]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黃執(zhí)纓墨蘭花朵發(fā)育和衰老生理的初步研究[J]生物學(xué)雜志，2008，20（4）：26～28

[12] 嚴(yán)華，張冬梅，羅玉蘭，等38種國(guó)蘭親緣關(guān)系的ISSR分析[J]分子植物育種，2010，8（4）：736～741

[13] 吳振興，王慧中，施農(nóng)農(nóng)，等蘭屬植物ISSR遺傳多樣性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必華，方永水正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的理論分析方法及應(yīng)用[J]安徽建筑工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint

摘要：為建立墨蘭的ISSR-PCR反應(yīng)體系，采用正交試驗(yàn)分析了5個(gè)因素

1引言

墨蘭（Cymbidium sinense）花瓣香氣濃郁、花色多變、葉形獨(dú)特，是國(guó)蘭中株型最大，花莖最長(zhǎng)的種類。目前對(duì)于墨蘭的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及孢粉學(xué)上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[3]，該技術(shù)在SSR（即簡(jiǎn)單序列重復(fù)）技術(shù)的基礎(chǔ)上有所發(fā)展，使實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便且迅速，穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，現(xiàn)今在基因定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、進(jìn)化以及系統(tǒng)發(fā)育等研究中被廣泛應(yīng)用[4]。不同植物對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系要求不同，因此在利用ISSR標(biāo)記之前，必須建立該種植物最適ISSR-PCR反應(yīng)體系。本研究旨在通過(guò)正交試驗(yàn)分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5個(gè)因子在4個(gè)水平上對(duì)墨蘭ISSR-PCR反應(yīng)影響，并據(jù)此建立墨蘭最適ISSR-PCR反應(yīng)體系，為利用ISSR標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

2材料與方法

試驗(yàn)材料墨蘭來(lái)源于國(guó)家林業(yè)局保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)方法包括以下3種。

（1）墨蘭基因組DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨蘭基因組DNA。

4結(jié)語(yǔ)

采用正交試驗(yàn)分析5個(gè)因素（Tag酶濃度、Mg2+濃度、模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃度）在4個(gè)水平上對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：Tag酶濃度為16U/25μL、Mg2+濃度為24mmol/L、dNTP濃度096 mmol/L、Primer濃度為064μmol/L、DNA濃度32ng/25μL是墨蘭ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系。Tag酶用量直接影響擴(kuò)增反應(yīng)成功與否，濃度過(guò)高造成浪費(fèi)，但如果Tag酶濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物合成效率下降。Mg2+ 濃度主要是通過(guò)影響Tag酶活性從而影響PCR反應(yīng)。dNTP作為PCR反應(yīng)的原料，濃度太低會(huì)使擴(kuò)增不完全，從而降低PCR產(chǎn)物產(chǎn)量；濃度過(guò)高會(huì)對(duì)Mg2+產(chǎn)生抑制作用，降低Mg2+的有效濃度，影響Tag酶的活力，造成浪費(fèi)。本試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步建立優(yōu)化、系統(tǒng)的ISSR-PCR反應(yīng)體系提供了初步的科學(xué)數(shù)據(jù)，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)墨蘭進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性及遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張孟錦，楊志娟蘭花育種途徑與進(jìn)展[J]廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（2）：120～123

[2] 鄭萬(wàn)均，傅立國(guó)中國(guó)植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J]遺傳，2002，24（5）：613～616

[5] 孫正海，王錦，李世峰，等滑葉藤ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（5）：746～750

[6] 李愛(ài)民，秀麟，陳功錫墨蘭解剖學(xué)研究[J]熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002，10（4）：295～300

[7] 劉塔斯，林麗美，龔力民，等分子標(biāo)記中植物DNA提取方法的研究進(jìn)展[J]中南藥學(xué)，2005，3（6）：0370～04

[8] 項(xiàng)艷，於安鳳，彭鎮(zhèn)華墨蘭離體快繁研究[J]林業(yè)科學(xué)研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，劉運(yùn)生，陳立華正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J]湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：03～404

[10] 劉峰，顧志敏，陳析豐，等長(zhǎng)春花ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化[J]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黃執(zhí)纓墨蘭花朵發(fā)育和衰老生理的初步研究[J]生物學(xué)雜志，2008，20（4）：26～28

[12] 嚴(yán)華，張冬梅，羅玉蘭，等38種國(guó)蘭親緣關(guān)系的ISSR分析[J]分子植物育種，2010，8（4）：736～741

[13] 吳振興，王慧中，施農(nóng)農(nóng)，等蘭屬植物ISSR遺傳多樣性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必華，方永水正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的理論分析方法及應(yīng)用[J]安徽建筑工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint

摘要：為建立墨蘭的ISSR-PCR反應(yīng)體系，采用正交試驗(yàn)分析了5個(gè)因素

1引言

墨蘭（Cymbidium sinense）花瓣香氣濃郁、花色多變、葉形獨(dú)特，是國(guó)蘭中株型最大，花莖最長(zhǎng)的種類。目前對(duì)于墨蘭的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及孢粉學(xué)上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[3]，該技術(shù)在SSR（即簡(jiǎn)單序列重復(fù)）技術(shù)的基礎(chǔ)上有所發(fā)展，使實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便且迅速，穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，現(xiàn)今在基因定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、進(jìn)化以及系統(tǒng)發(fā)育等研究中被廣泛應(yīng)用[4]。不同植物對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系要求不同，因此在利用ISSR標(biāo)記之前，必須建立該種植物最適ISSR-PCR反應(yīng)體系。本研究旨在通過(guò)正交試驗(yàn)分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5個(gè)因子在4個(gè)水平上對(duì)墨蘭ISSR-PCR反應(yīng)影響，并據(jù)此建立墨蘭最適ISSR-PCR反應(yīng)體系，為利用ISSR標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

2材料與方法

試驗(yàn)材料墨蘭來(lái)源于國(guó)家林業(yè)局保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)方法包括以下3種。

（1）墨蘭基因組DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨蘭基因組DNA。

4結(jié)語(yǔ)

采用正交試驗(yàn)分析5個(gè)因素（Tag酶濃度、Mg2+濃度、模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃度）在4個(gè)水平上對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：Tag酶濃度為16U/25μL、Mg2+濃度為24mmol/L、dNTP濃度096 mmol/L、Primer濃度為064μmol/L、DNA濃度32ng/25μL是墨蘭ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系。Tag酶用量直接影響擴(kuò)增反應(yīng)成功與否，濃度過(guò)高造成浪費(fèi)，但如果Tag酶濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物合成效率下降。Mg2+ 濃度主要是通過(guò)影響Tag酶活性從而影響PCR反應(yīng)。dNTP作為PCR反應(yīng)的原料，濃度太低會(huì)使擴(kuò)增不完全，從而降低PCR產(chǎn)物產(chǎn)量；濃度過(guò)高會(huì)對(duì)Mg2+產(chǎn)生抑制作用，降低Mg2+的有效濃度，影響Tag酶的活力，造成浪費(fèi)。本試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步建立優(yōu)化、系統(tǒng)的ISSR-PCR反應(yīng)體系提供了初步的科學(xué)數(shù)據(jù)，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)墨蘭進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性及遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張孟錦，楊志娟蘭花育種途徑與進(jìn)展[J]廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（2）：120～123

[2] 鄭萬(wàn)均，傅立國(guó)中國(guó)植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J]遺傳，2002，24（5）：613～616

[5] 孫正海，王錦，李世峰，等滑葉藤ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（5）：746～750

[6] 李愛(ài)民，秀麟，陳功錫墨蘭解剖學(xué)研究[J]熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002，10（4）：295～300

[7] 劉塔斯，林麗美，龔力民，等分子標(biāo)記中植物DNA提取方法的研究進(jìn)展[J]中南藥學(xué)，2005，3（6）：0370～04

[8] 項(xiàng)艷，於安鳳，彭鎮(zhèn)華墨蘭離體快繁研究[J]林業(yè)科學(xué)研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，劉運(yùn)生，陳立華正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J]湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：03～404

[10] 劉峰，顧志敏，陳析豐，等長(zhǎng)春花ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化[J]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黃執(zhí)纓墨蘭花朵發(fā)育和衰老生理的初步研究[J]生物學(xué)雜志，2008，20（4）：26～28

[12] 嚴(yán)華，張冬梅，羅玉蘭，等38種國(guó)蘭親緣關(guān)系的ISSR分析[J]分子植物育種，2010，8（4）：736～741

[13] 吳振興，王慧中，施農(nóng)農(nóng)，等蘭屬植物ISSR遺傳多樣性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必華，方永水正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的理論分析方法及應(yīng)用[J]安徽建筑工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint