馬錢子配伍蘇木對佐劑關節(jié)炎大鼠滑膜組織IL-1β、IL-6及IL-10的影響

孫響波，于妮娜，楊子東，唐迎雪

（1.山東中醫(yī)藥大學2012級博士研究生，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學2012級碩士研究生，山東 濟南 250014；

3.山東中醫(yī)藥大學研究生處，山東 濟南 250355）

類風濕性關節(jié)炎（RA）是與環(huán)境、細胞、病毒、遺傳、免疫、性激素及神經(jīng)精神狀態(tài)等因素密切相關的疾病。研究證實，RA患者滑膜細胞及滑膜組織中浸潤的單核/巨噬細胞、淋巴細胞等通過自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生大量的細胞因子和炎性介質(zhì)，參與RA的致病過程。IL-1、IL-6、LI-10等在RA的發(fā)病中具有促炎、抑炎或刺激、抑制正負反饋免疫調(diào)控作用［1］。在RA活動期，滑膜中的IL-1β、IL-6等致炎性細胞因子升高，自身產(chǎn)生抑制性細胞因子以減輕炎癥反應；在體內(nèi)，IL-10是最主要的抑炎性細胞因子，主要由單核/巨噬細胞、T細胞等分泌，通過抑制單核巨噬細胞的激活、遷移與粘附及炎癥因子的合成與釋放，減輕全身及關節(jié)局部炎癥反應。馬錢子性溫味苦，有大毒，功能活血逐瘀，通絡止痛，其性猛烈，善于疏通走竄，功捷效強。臨床多用于風濕痹痛，肢體癱瘓等頑疾的治療。蘇木性平，味甘、咸、微辛，無毒，歸心、肝、脾經(jīng)。具活血祛瘀，消腫止痛之功。主治血滯經(jīng)閉、跌打瘀痛、癰腫瘡毒等。臨床多用于風濕痛，膝關節(jié)腫脹，腰腿痛，足跟痛，骨折疼痛等病的治療。我們用馬錢子配伍蘇木（簡稱馬蘇）對佐劑關節(jié)炎（AA）大鼠滑膜中 IL-1β、IL-6、IL-10含量的影響，探討馬蘇配伍后的抗炎機制并尋求最佳配比，報道如下。

1 材 料

中藥材：馬錢子，為馬錢科植物馬錢Strychnos.nuxvomica L.的成熟種子。以砂燙炮制。蘇木，為豆科植物蘇木Caesalpinia sappan L.的心材。以上中藥材購于山東中醫(yī)藥大學中魯醫(yī)院，經(jīng)本校中藥鑒定教研室李峰老師鑒定，符合2010版《中國藥典》標準。

制劑制備：①馬錢子單煎劑：稱取馬錢子20g，加8倍量（以質(zhì)量計）蒸餾水，浸泡1h，武火煮沸30min，用雙層紗布過濾，得濾液I；藥渣再加6倍量蒸餾水，武火煮沸20min，同上法過濾，得濾液II；合并濾液I，II，65℃恒溫水浴濃縮至每毫升制劑含馬錢子0.25g，滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂隈R錢子配伍蘇木1∶6煎劑：稱取馬錢子20g，蘇木120g，加8倍量（以質(zhì)量計）蒸餾水，浸泡1h，武火煮沸30min，用雙層紗布過濾，得濾液I；藥渣再加6倍量蒸餾水，武火煮沸20min，同上法過濾，得濾液II；合并濾液I，II，65℃恒溫水浴濃縮至1mL制劑含馬錢子0.25g，滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。③馬蘇1︰12、1︰18、1︰24煎劑：制備方法同上。

試劑：0.3%戊巴比妥鈉（分析純，批號1D08062311，山東齊都藥業(yè)有限公司），冰乙酸（分析純，批號20080626，萊陽市康德化工有限公司），無水乙醇（批號20080521，萊陽市康德化工有限公司），弗氏完全佐劑（批號038K8726 CAS9007-81-2，美國Sigma公司），IL-1β測試盒（批號28C037，美國R&D公司），IL-6測試盒（批號46E029，美國R&D公司），IL-10測試盒（批號12A021，美國R&D公司）。

儀器：電熱恒溫水浴箱（SSW，上海博迅實業(yè)有限公司），快速混勻器（SZ-1，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠），外徑千分尺（滬00000315，上海永鑫工量具有限公司），全自動高速冷凍離心機（GL20A，湖南儀器儀表總廠離心機廠），超低溫冰箱（UltraFreeze，丹麥Heto公司），上皿電子天平（JA5003，上海精科天平廠），全自動酶標儀（EL340i，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）。

動物：SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，許可證號SCXK（魯）20110015。

實驗結果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，采用One-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，均以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 方 法

取Wistar大鼠91只，取其中70只，雌雄各半，按體質(zhì)量、性別隨機分為7組，每組10只，分別為空白組、模型組、馬錢子單煎劑組、馬錢子配伍蘇木1∶6、1∶12、1∶18、1∶24煎劑組。另21只大鼠做好標記，3只為一組，分別置于上述7組中（用于做滑膜組織病理切片）。造模方法參照文獻［2］，從實驗開始第1天，除正常組外，其余各組大鼠分別從每只大鼠右后足墊部皮下注入弗氏完全佐劑（Freund's Complete Adjuvant，F(xiàn)CA）0.1mL（0.25mL注射器，專人注射，保持劑量準確及部位一致），建立AA大鼠模型。實驗從第32天的21:00禁食不禁水12h，第33天全部大鼠稱重，用水合氯醛腹腔注射麻醉0.01mL/g，取滑膜。

取滑膜組織，在下右膝關節(jié)打開膝關節(jié)腔，沿膝關節(jié)正中縱行切開皮膚直至暴露出以膝關節(jié)為中心約3cm×3cm區(qū)域，用有齒鑷提起髕骨，沿髕骨上沿約0.3～0.4cm處向下切至股骨，再分別沿髕骨兩側向下分離至脛骨，由髕骨下極向上延續(xù)有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，完整剝離滑膜組織，用刀片完整切下。稱重后以1.5mL生理鹽水于冰浴中勻漿滑膜組織，將勻漿液2000rpm離心10min，取上清液待測。

3 結 果

馬錢子配伍蘇木對AA大鼠滑膜組織IL-1β、IL-6含量的影響見表1。

表1 馬錢子配伍蘇木對AA大鼠滑膜組織中IL-1β、IL-6含量的影響（）

表1 馬錢子配伍蘇木對AA大鼠滑膜組織中IL-1β、IL-6含量的影響（）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與馬錢子單煎劑組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

△馬蘇1∶24煎劑 10 110.0 0.251±0.091* 69.571±42.176*

馬錢子配伍蘇木對AA大鼠滑膜組織中IL-10含量的影響見表2。

表2 馬錢子配伍蘇木對AA大鼠滑膜組織中IL-10含量的影響 （）

表2 馬錢子配伍蘇木對AA大鼠滑膜組織中IL-10含量的影響 （）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與馬錢子單煎劑組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別 動物數(shù)（只） 劑量（mg/kg） IL-10（pg/mL）空白組 10 - 141.208±16.132模型組 10 - 102.125±21.314馬錢子單煎劑 9 110.0 109.347±20.246馬蘇1∶6煎劑 10 110.0 113.261±19.077*馬蘇1∶12煎劑 9 110.0 120.721±22.534*馬蘇1∶18煎劑 10 110.0 127.216±19.359**△馬蘇1∶24煎劑 10 110.0 106.103±18.638

4 討 論

滑膜是一層具有豐富血管的結締組織，是血管豐富的關節(jié)囊內(nèi)膜，由平滑光亮、粉紅色、薄而柔潤的疏松結締組織構成，內(nèi)含有膠原性纖維，緊貼關節(jié)囊纖維層的內(nèi)面，附著于關節(jié)軟骨的周緣。RA的病理過程中，伴隨著滑膜細胞增生，會出現(xiàn)滑膜組織增厚，關節(jié)粘連等病理改變，盡管許多炎性細胞因子和炎性介質(zhì)參與了這個病理過程，但滑膜細胞增生仍是這一病理過程的最直接反應。馬錢子與蘇木配伍后可協(xié)同增效，降低毒性。IL-1β是RA軟骨損傷的主要原因之一，在慢性類風濕關節(jié)炎發(fā)病中，IL-1促進關節(jié)滑膜過量產(chǎn)生前列腺素和膠原酶，破壞軟骨組織，活化破骨細胞，促進骨吸收。關節(jié)腔內(nèi)有IL-1存在與發(fā)病的嚴重程度正相關。IL-6是一種多功能的細胞因子，可由淋巴細胞及非淋巴細胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)免疫應答、急性期反應、促進骨髓造血等方面均具有重要作用。RA患者的炎性滑膜可釋放一些細胞因子，刺激破骨細胞釋放酸性蛋白水解酶，從而導致骨吸收和軟骨鈣化增加［3］。IL-6還能誘導其他細胞因子如IL-1、IL-2和TNF-α等產(chǎn)生及釋放，并且增強了IL-1和TNF-α等炎癥的破壞作用［3］。IL-10是RA病變過程中起保護作用的重要細胞因子，由TH2產(chǎn)生，能夠促進抗體產(chǎn)生、促進肥大細胞和嗜酸性粒細胞的增殖與分化、抑制單核細胞因子（如IL-1、TNF-α）的產(chǎn)生。研究證實其作用機制可能與抑制滑膜巨噬細胞和T細胞合成炎性因子有關。馬蘇的不同濃度組的抗炎作用可能與其抑制炎性因子的產(chǎn)生與釋放密切相關，在不同程度上減慢或阻斷炎性細胞因子的致炎效應，使血清中的炎性細胞因子含量呈現(xiàn)下降趨勢，通過下降異常分泌增多的IL-1β、IL-6以及升高保護性因子IL-10進而減輕AA大鼠炎癥反應，加速炎性細胞因子的清除，以抑制滑膜細胞的增生以及B細胞、T細胞等異常激活，來減輕滑膜細胞的炎癥反應和骨組織破壞和吸收，中斷AA大鼠的病理進程，繼而影響炎癥的發(fā)生、發(fā)展，達到抗炎消腫的目的。

［1］姚航平，徐建忠，張立煌.類風濕關節(jié)炎患者血清滑液和滑膜組織白細胞介素-18的水平及意義［J］.中華風濕病學雜志，2002，2（3）：12.

［2］CHOY E Clinical experience with inhibition of interleuk in-6［J］.Rheum D is Clin North Am，2004，30（2）：405-415.

［3］Einhorn TA.Neutral proteases in regenerating bone［J］.Clin Orthop，1991，262：286.