華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類主要弧菌病原的分離與鑒定

崔 婧，范雪亭，劉文竹，李紅月，周永燦，王世鋒，謝珍玉

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口570228)

海水魚類的種類豐富，可選擇的養(yǎng)殖品種較多，而我國適宜養(yǎng)殖的遼闊海域也為海水養(yǎng)殖業(yè)提供了場所. 目前，我國試養(yǎng)的海水魚類累計(jì)已達(dá)80 多種(包括部分引進(jìn)種)［1］，其中大規(guī)模養(yǎng)殖的有30 多種.在2012 年漁業(yè)產(chǎn)值中，海水養(yǎng)殖的產(chǎn)值已達(dá)2 264.54 億元，實(shí)現(xiàn)增加值1 308.18 億元［2］. 不過，隨著海水魚類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，大面積頻繁暴發(fā)的養(yǎng)殖魚類重大流行性疾病已成為制約海水魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最主要瓶頸之一.

引起海水養(yǎng)殖魚類病害的原因眾多，除受營養(yǎng)性因素和環(huán)境因素影響外，細(xì)菌、病毒和寄生蟲等均可引發(fā)傳染性疾病. 由于細(xì)菌感染引起的疾病具有流行面廣、發(fā)病迅速、死亡率高、危害大等特點(diǎn)，所以它一直是國內(nèi)外的研究重點(diǎn). 目前，已報(bào)道的海水養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病有十余種，其中弧菌病(Vibriosis)被公認(rèn)為是對海水魚類養(yǎng)殖危害最大的病害之一，它也一直是我國華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類的主要細(xì)菌性病害［3］，引發(fā)該病的病原主要有:哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、鰻弧菌(V. anguillarum)、需鈉弧菌(V. natriegens)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、燦爛弧菌(V. splendidus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、輪蟲弧菌(V. rotiferianus)、創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)、殺鮭弧菌(V. salmonicida)、海利斯頓氏菌(V. pelagius)、美人魚弧菌(V. damsela)、奧氏弧菌(V. ordalii)、費(fèi)氏弧菌(V. fischeri)以及最小弧菌(V. mimicus)等［4－6］. 近年來，華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類的多次大面積流行性疾病均呈現(xiàn)弧菌病典型癥狀，為此，筆者連續(xù)3 年在該地區(qū)開展了弧菌病的流行病學(xué)調(diào)查，旨在確定這些重大流行性疾病的主要弧菌病原，以便為今后有效控制該類疾病的爆發(fā)和流行奠定初步的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 流行病學(xué)調(diào)查及病原菌的分離 調(diào)查時(shí)間:2011 年5 月～2013 年10 月

調(diào)查地點(diǎn):海南省文昌市鋪前鎮(zhèn)、海南省陵水市新村港、海南省三亞市南山港、廣西壯族自治區(qū)北海市西村港、廣東省深圳市大亞灣.

調(diào)查內(nèi)容:詢問并記錄華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類的發(fā)病時(shí)間及發(fā)病規(guī)律;測量發(fā)病魚排與養(yǎng)殖池塘的水溫、鹽度、pH 值;觀察和記錄患病魚的體表癥狀和解剖癥狀.

調(diào)查方法:參考周素明［7］的方法并作適當(dāng)改良. 即:從每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)挑取3 口網(wǎng)箱或池塘，每口網(wǎng)箱或池塘分別取3 尾具有典型病癥的魚;用TCBS 平板劃線分離法從病魚的體表病灶、肝臟、脾臟、頭腎、心臟分離細(xì)菌［8］，30 ℃培養(yǎng)24 h 后記錄結(jié)果. 挑取菌落形態(tài)一致的優(yōu)勢菌，并以TCBS 培養(yǎng)基純化培養(yǎng)2～3 次，直至獲得純培養(yǎng)菌. 同時(shí)，將優(yōu)勢菌株用普通海水營養(yǎng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(每1 000 mL 中，酵母浸膏1.0 g，牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 30.0 g，調(diào)pH 至7.6 ～7.8)，菌懸液與等體積φ=50%的甘油混合，保存于－80 ℃的冰箱中備用.

1.2 病原菌確定 由于斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)是我國華南地區(qū)近二十年來石斑魚養(yǎng)殖中最主要的養(yǎng)殖種類之一，也是本次調(diào)查中發(fā)病最多的魚類，因此選取斜帶石斑魚作為人工感染試驗(yàn)的動(dòng)物.選取健康斜帶石斑魚(體重30 ～35 g)，用過濾海水暫養(yǎng)7 d 后，5 條/組飼養(yǎng)在48 cm×38.5 cm×38.5 cm(長×寬×高)的玻璃缸中，水深約25 cm，連續(xù)充氣，日換水量為水體的1/3. 將從患病魚中分離的優(yōu)勢菌株經(jīng)普通海水營養(yǎng)液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用無菌生理鹽水(w =0.85%)稀釋成1.1 ×107CFU/mL 的菌懸液;腹腔注射，接種量0.2 mL/尾，對照組注射等量的無菌生理鹽水;每組5 尾，設(shè)1 個(gè)重復(fù). 記錄感染后15 d 內(nèi)各組石斑魚的發(fā)病及死亡情況，并對發(fā)病個(gè)體進(jìn)行細(xì)菌重分離，接著將重分離菌株做重感染試驗(yàn). 當(dāng)病魚的發(fā)病癥狀相同，且所分離和重分離菌株的菌落形態(tài)與人工感染菌株的菌落形態(tài)完全相同時(shí)，則確定該菌株為致病菌株(柯赫氏法則). 根據(jù)大量哈維氏弧菌的人工感染經(jīng)驗(yàn)得出，在哈維氏弧菌感染魚體后，24 h 內(nèi)出現(xiàn)發(fā)病死亡現(xiàn)象的菌株為強(qiáng)毒株，24 h 后發(fā)病的菌株為弱毒株，15 d 內(nèi)不發(fā)病的菌株為無毒株.

1.3 病原菌的菌種鑒定

1.3.1 16S rDNA 以及管家基因topA，mreB 基因序列的測定與分析 病原菌經(jīng)30 ℃振蕩培養(yǎng)20 h 后，以菌液為模板PCR. 擴(kuò)增基因16S rDNA、管家基因topA 和mreB 的引物序列分別參照Ana Cano－Gomez 等［9］的方法，引物由華大基因公司合成.25 μL PCR 反應(yīng)體系:10 ×Taq Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTPs Mix(10 mmol/L)0.5 μL，20 μmol/L 正反向引物各1 μL，Taq DNA 聚合酶(5U/μL)0.2 μL，模板DNA 1 μL，無菌水18.8 μL. PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán);最后于72 ℃溫育10 min，并以w=1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果. 采用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收. 連接pMD19－T Vector，篩選陽性克隆送華大基因公司進(jìn)行核苷酸序列的測定. 采用MEGA 5 軟件，將強(qiáng)毒株GDH11385 的16S rDNA 序列、topA 與mreB 的串聯(lián)序列分別與從GenBank 中獲得的同源性最高的細(xì)菌16S rDNA 序列、topA 與mreB 的串聯(lián)序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.3.2 表型鑒定 參照Mercedes－Anicel［10］和東秀珠等［11］的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化檢測鑒定. 生化鑒定管及相關(guān)試劑均購自杭州微生物有限公司. 選取的生理生化指標(biāo)包括:4 ℃生長、28 ℃生長、35 ℃生長、40 ℃生長、w=0 %的NaCl 生長、w=2 %的NaCl 生長、w=6 %的NaCl 生長、w=8 %的NaCl 生長、w=10 %的NaCl 生長、TCBS 上生長顏色、革蘭氏染色、水解木糖、水解蔗糖、水解乳糖、水解鼠李糖、水解阿拉伯糖、水解葡萄糖、葡萄糖(產(chǎn)氣)、肌醇、甘露醇、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解、枸緣酸鹽、硝酸鹽還原、ONPG、吲哚試驗(yàn)、O/129(10 μg)、O/129(150 μg).

2 結(jié) 果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查及病原菌分離 調(diào)查結(jié)果表明，每年5 ～10 月為發(fā)病高峰期;發(fā)病池水體的鹽度為28±5，pH 值為7，4 ±0.4，水溫為(28 ±3)℃. 不同地點(diǎn)、不同種類魚的發(fā)病癥狀存在一定差異. 其中，海南省瓊海市潭門鎮(zhèn)的紅鰭笛鯛(Lutjanus erythopterus)在發(fā)病初期伏底、不活動(dòng)、反應(yīng)遲鈍，在后期其體表的不同區(qū)域脫鱗潰爛，通過對患病魚的解剖可見，其肝臟充血、腫大，腹腔積水;海南省文昌市鋪前鎮(zhèn)的紅鰭笛鯛的發(fā)病癥狀為體表脫鱗潰爛，患病魚的解剖內(nèi)臟無明顯異常;而在各地調(diào)查的斜帶石斑魚、褐點(diǎn)石斑魚(E. fuscoguttatus)和珍珠龍膽(棕點(diǎn)石斑魚E. fuscoguttatus♀×鞍帶石斑魚E. lanceolatus♂)等病魚都表現(xiàn)為眼球混濁突出，嚴(yán)重時(shí)眼球充血，全身大面積脫鱗潰爛(見圖1)，以背部最為嚴(yán)重，肝臟充血并出現(xiàn)白斑.

圖1 發(fā)病的珍珠龍膽(棕點(diǎn)石斑魚♀×鞍帶石斑魚♂)

細(xì)菌分離結(jié)果表明，在所采集的135 份樣品中，共有70 份肝臟、脾臟、頭腎、心臟樣品，從它們都可分離出菌落形態(tài)相對單一的菌株，而且，同一尾病魚的不同內(nèi)臟部位所分離的細(xì)菌在TCBS 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)基本一致，細(xì)菌含量為(4 ～50)×105CFU/g;從病灶處也可分離獲得相應(yīng)數(shù)量的細(xì)菌，其中優(yōu)勢菌落的形態(tài)與從內(nèi)臟分離的細(xì)菌相同，但常夾雜少量其他菌落形態(tài)的細(xì)菌. 將這70 份樣品的分離物培養(yǎng)24 h后，形成的菌落直徑為1 ～3 mm，大多數(shù)菌落為黃色，少數(shù)菌落呈綠色;最終，從不同病魚的肝臟、脾臟、頭腎、心臟和創(chuàng)傷部位總共分離獲得優(yōu)勢細(xì)菌63 株(見表1).

表1 2011 年5 月—2013 年10 月所采集的菌種信息及分子鑒定結(jié)果

2.2 病原菌確定 菌株GXH11001，GXH11003，GXH11004，GXH12001，GXH12003，GDH11385，GDH11387，GDH12388，GDH133899，XC11155，XC13156，XCH130211，NSH121632，NSH121251，NSH131652，WCH11DH52，WCH11D151，WCH12DH11，WCH12H252，WCH12D262，WCH13DH31 均可使石斑魚致病.其中，在感染后12 h 內(nèi)GDH11385 致使所有測試魚死亡;而在感染后24 h 內(nèi)GDH11387 也致使所有測試魚死亡;不過被GDH11388 和GDH11389 感染后的24 h 內(nèi)，魚會(huì)開始出現(xiàn)死亡，死亡率為50%，但在3 d內(nèi)所有測試魚均死亡;被GXH11003，NSH131652，WCH12DH11，WCH12H252 感染后，在24 h 內(nèi)均會(huì)出現(xiàn)魚死亡的現(xiàn)象，死亡率分別為10%，30%，20%，10%，15 d 內(nèi)所有測試魚均死亡. 其余14 株菌株，在感染后15 d 內(nèi)的致死率分別為20% ～40%. 人工感染時(shí)，死亡個(gè)體的肝臟充血，死亡時(shí)口和鰓明顯張大. 對人工感染患病個(gè)體的肝臟、脾臟和頭腎重進(jìn)行分離，可獲得大量與感染菌株菌落形態(tài)相同的細(xì)菌，這些重分離菌株對供試動(dòng)物的毒力與原感染菌株的毒力基本相同. 因此，根據(jù)科赫法則，最終認(rèn)定上述21 株為病原菌株，其中GDH11385，GDH11387，GDH12388，GDH13389 為強(qiáng)毒株，以GDH11385 的毒性為最強(qiáng)，其余17 株為弱毒株.

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 16S rDNA，topA 和mreB 基因序列比對與聚類 經(jīng)擴(kuò)增和測序，分別獲得了63 株菌株的1 511 ～1 514 bp 的16S rDNA 片段，802 ～993 bp 的topA 基因片段、960 ～1 017 bp 的mreB 基因片段.16S rDNA，topA和mreB 基因序列在Genbank 中的同源性比對結(jié)果顯示，43 株細(xì)菌與哈維氏弧菌的同源性最高，7 株為溶藻弧菌，5 株為副溶血弧菌，2 株為輪蟲弧菌，1 株為需鈉弧菌，5 株為無法確定的弧菌屬其他種細(xì)菌(見表1)，序列相似性均達(dá)到99%以上. 將強(qiáng)毒株GDH11385 的16S rDNA 序列與Genbank 中同源性最高的且已鑒定到種的25 個(gè)菌株的基因序列進(jìn)行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)分支圖，結(jié)果表明，該菌株與哈維氏弧菌FJ605240.1，F(xiàn)N554612.2，F(xiàn)N554614.2 聚為一支，與輪蟲弧菌、需鈉弧菌、溶藻弧菌分支明顯(見圖2). 同時(shí)，GDH11385 的topA 和mreB 基因的串聯(lián)序列與哈維氏弧菌菌株相應(yīng)序列也具有最高同源性，達(dá)99%，不過，將其與Genbank 中同源性最高的20 個(gè)菌株的topA 和mreB 基因的串聯(lián)序列進(jìn)行比對，聚類結(jié)果顯示，該菌株單獨(dú)聚為一支(見圖3).

圖2 16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)分支圖

圖3 TopA 和MreB 基因序列構(gòu)建的弧菌系統(tǒng)分支圖

2.3.2 表型鑒定 以哈維氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為對照，對Genbank 中與哈維氏弧菌具有高度同源性的43 株細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)和生理生化特征的鑒定，這43 株細(xì)菌可以分為4 類，第一類以西村港分離到的細(xì)菌為代表，A 共有:GXH11001，GXH11002，GXH11003，GXH11004，GXH12001，GXH12002，GXH12003，GXH13001，GXH13002， GXH13003， WCH11D151， WCH12DH11， WCH12H252， WCH12DH11， WCH13D131，WCH13D231，WCH13D121，XCH110351，XCH110351，XCH110351，XCH110351，XCH120452，NSH111651，NSH121841，NSH131451，NSH131631，GDH12388 等菌株;第二類以鋪前鎮(zhèn)分離到的細(xì)菌為代表，B 共有:WCH12D251，WCH12D262，WCH13DH31，WCH13DH51，NSH131652，GDH13389 等菌株;第三類以鋪前鎮(zhèn)和南山港分離到的細(xì)菌為代表，C 共有:WCH11D222，WCH11DH52，WCH13DH21，WCH13D261，NSH111051，NSH111341，NSH121251，NSH131751，GXH13005 等菌株;第四類以大亞灣分離到的細(xì)菌為代表，D 共有:GDH11385，GDH11387，XCH130211，GXH13004，NSH131241 等菌株. 與標(biāo)準(zhǔn)菌株相對比，第一類細(xì)菌在水解賴氨酸和硝酸鹽還原的能力上存在差異，第二類在水解糖、精氨酸雙水解和硝酸鹽還原能力上存在差異，第三類細(xì)菌在水解甘露醇、賴氨酸和硝酸鹽還原能力上存在差異，第四類細(xì)菌在水解蔗糖、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解能力上存在差異(見表2). 因此認(rèn)為，這43 株菌的生理生化表型符合哈維氏弧菌的表型特征. 結(jié)合上述分子鑒定結(jié)果，這43 株菌株最終均被認(rèn)定為哈維氏弧菌.

3 討 論

弧菌病是華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類最常見的細(xì)菌性疾病之一，其致病原主要為鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌等［12－14］. 本文的調(diào)查結(jié)果表明，近3 年來，該病多于每年的5 ～10 月份水溫較高時(shí)爆發(fā)，養(yǎng)殖密度高時(shí)更易發(fā)生，多種不同生長時(shí)期的魚類都可發(fā)病;本次實(shí)驗(yàn)共調(diào)查了15 個(gè)點(diǎn)，獲得了135份樣品，從中分離出63 株弧菌，其中21 株為病原菌，在這些病原菌中18 株為哈維氏弧菌(占85.7%)，這說明引起華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類弧菌病的主要病原為哈維氏弧菌，該病原引起的弧菌病具有感染率高、死亡量大等特點(diǎn). 國內(nèi)外大量的研究表明，哈維氏弧菌易感染斜帶石斑魚、褐點(diǎn)石斑魚、大黃魚等多種海水養(yǎng)殖魚類［15－20］. 本研究還發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌易感染紅鰭笛鯛、珍珠龍膽等，不僅可引起感染對象鱗片脫落、皮膚壞死、肌肉潰爛等嚴(yán)重病灶，而且還會(huì)引起病魚的肝臟、脾臟、頭腎等多種內(nèi)臟器官充血、產(chǎn)生白斑等病變，其中，該病原對紅鰭笛鯛存在致病性為本文首次報(bào)道. 人工感染試驗(yàn)表明，除慢性發(fā)病的斜帶石斑魚表現(xiàn)出眼球突出、潰爛、內(nèi)臟充血等感染癥狀外，本文還首次發(fā)現(xiàn)急性死亡的病魚出現(xiàn)口、鰓張大，即表現(xiàn)出明顯的缺氧癥狀，表明本研究所采集到的哈維氏弧菌對斜帶石斑魚的侵染器官與前人［18－20］獲得的哈維氏弧菌對斜帶石斑魚的侵染靶器官可能不同，該病原不僅侵染試驗(yàn)動(dòng)物的皮膚、眼、內(nèi)臟，而且還可能侵染呼吸系統(tǒng)或呼吸控制系統(tǒng). 同時(shí)，雖然GDH11385 菌株的topA 和mreB 基因均與哈維氏弧菌具有最高同源性，但是在聚類圖中該菌株單獨(dú)聚為一支. 因此，GDH11385 菌株的表位種類或結(jié)構(gòu)、侵染機(jī)制以及遺傳特征均與已報(bào)道的菌株存在明顯差異，因此它可能為一類新的病原菌株.

表2 4 類待測菌株和哈維氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的形態(tài)及生理生化特征

大量研究表明，哈維氏弧菌在TCBS 培養(yǎng)基上的菌落顏色均為黃色［4，18－19］，但也有研究結(jié)果顯示，哈維氏弧菌在TCBS 培養(yǎng)基上可形成綠色菌落，其哈維氏弧菌菌株為致病菌株［21－22］. 本研究中獲得的哈維氏弧菌GDH11385 不僅在TCBS 培養(yǎng)基上的菌落顏色為綠色，而且也是強(qiáng)毒株，這與前人的研究結(jié)果一致.

菌株形態(tài)及生理生化特征的分析結(jié)果表明，西村港的菌株基本都聚為一支，其他地區(qū)的菌株則分散在另三類中. 據(jù)此推測:西村港菌株有可能保持了原始地理種群的特征，其他地點(diǎn)的菌株則有可能因地域之間的苗種和親本引入等人為因素而導(dǎo)致了菌株間的相互交流，這種菌株交流行為有可能促進(jìn)了哈維氏弧菌的競爭與變異化，從而導(dǎo)致該疾病的大面積流行和新毒力菌株的產(chǎn)生.

綜上所述，本次在華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類中分離的哈維氏弧菌病原具有毒性大、耐藥性強(qiáng)、可侵染多種宿主的特點(diǎn)，同時(shí)，該菌存在不同的地理種群. 因此，在當(dāng)前無法確定哈維氏弧菌病原致病機(jī)理的情況下，確立華南地區(qū)各主要養(yǎng)殖區(qū)哈維氏弧菌的主要遺傳型毒力菌株的生物標(biāo)志和建立其快速分子檢測方法是目前防治哈維氏弧菌病大面積流行的有效手段.

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