大豆耐鹽基因的預(yù)測與篩選

原 野

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

大豆耐鹽基因的預(yù)測與篩選

原 野

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

本研究運用生物信息學(xué)方法和實驗驗證，對大豆的3號染色體上Satt339～Sat304區(qū)間內(nèi)耐鹽相關(guān)基因進行了結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測，篩選大豆的耐鹽性狀相關(guān)基因。通過實時熒光PCR技術(shù)，定量分析候選基因響應(yīng)于鹽脅迫。

大豆；耐鹽基因；生物信息學(xué)；基因篩選

作為我國重要的經(jīng)濟作物之一，大豆的耐鹽性較敏感，尤其在我國北方地區(qū)，可用耕地多為鹽性土壤，對大豆的生長影響較大。因此，找到耐鹽基因，解決大豆的耐鹽問題是克服土壤鹽漬化的重要前提[1]，是我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。已有的研究表明，植物的抗鹽性是一個由多基因控制的數(shù)量性狀，其抗性機制是一個十分復(fù)雜的問題[2]，涉及植物器官、組織、細胞、細胞器直至分子，既有蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物等結(jié)構(gòu)和能量物質(zhì)的代謝，還有激素合成、抗氧化酶活化、離子調(diào)控與區(qū)域化、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成及基因表達[3]，許多基因會隨環(huán)境中鹽濃度的改變而改變表達量[4]。而過高的土壤含鹽量會對植株造成包括水分脅迫、離子脅迫、光合作用下降等多方面不利影響[5-12]，等。國外文獻中刊載的相關(guān)研究[13-16]是針對農(nóng)作物耐鹽性的研究[12，15，17，18]，Mansour(2004)等主要是和對植物耐鹽性狀分子機理的研究。以往的研究中，對于大豆的耐鹽性狀研究尚顯薄弱。正是基于此現(xiàn)狀的啟發(fā)，確定以大豆為研究對象，應(yīng)用Softberry的ORF預(yù)測功能和美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST檢索系統(tǒng)獲取大豆基因的基因結(jié)構(gòu)并進行生物信息學(xué)分析，了解基因可能的功能，高效地縮小大豆耐鹽候選基因的范圍。在得到大豆耐鹽候選基因后，通過對大豆植株進行DNA酶切和PCR擴增，驗證候選基因的存在。繼而對大豆植株進行鹽脅迫，通過運用實時熒光PCR技術(shù)，定量驗證目的基因響應(yīng)于大豆植株受到的鹽脅迫。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用合豐39大豆種由上海交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.2 大豆耐鹽基因的篩選

大豆耐鹽候選基因的篩選即通過生物信息學(xué)方法，分析大豆基因序列，在不少于1.4Mbp的序列內(nèi)分析基因功能，預(yù)測與大豆耐鹽性相關(guān)的基因。通過phytozome網(wǎng)站，得到大豆的全基因組序列，并在標(biāo)記基因JD33前后，在Gm03染色體上標(biāo)記基因Satt339～Sat304之間，選取約1.4Mbp的DNA序列，通過Softberry的FGENESH分析，得到預(yù)測基因序列。

通過NCBI的BLAST分析 （蛋白質(zhì)序列），將預(yù)測的ORF（開放閱讀框）與基因庫（Gene Bank）的雙子葉植物數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選同源序列。根據(jù)序列相似程度（E值、Score值）以及基因組成，對基因進行綜合分析，從而排除不完整的基因片段。

根據(jù)已注釋的直系同源基因的功能對大豆ORF的功能進行預(yù)測，確定與耐鹽相關(guān)的候選基因。

1.3 候選基因的PCR驗證

大豆耐鹽閾值，即當(dāng)外界土壤或水中鹽濃度 （以NaCl計）超過時植株生長開始受到嚴(yán)重影響，如枝葉萎靡、生長驟緩、葉片出現(xiàn)斑點等，是大豆耐鹽性的重要指標(biāo)。測定合豐39大豆耐鹽閾值，即作為植株鹽脅迫實驗的標(biāo)準(zhǔn)濃度。

選飽滿、色澤亮黃的大豆種，分組置于培養(yǎng)皿中，置于干燥器中，加100ml NaClO溶液（84消毒液）與1.5ml 37%HCl，滅菌24小時。將大豆種置于1.2%水瓊脂培養(yǎng)基上，4℃春化24小時；轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～5天。大豆出芽后，轉(zhuǎn)入50% 霍格蘭氏培養(yǎng)液，光照培養(yǎng)箱中，光照16小時/天，23℃持續(xù)水培。

配置含鹽霍格蘭氏工作液 （50%濃度），NaCl濃度梯度為 0mmol/L、0mmol/L （ 對 照 組 ）、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、150mmol/L， 共9組，每組9或10株，光照16小時/天，24～25℃，每3日更換含鹽培養(yǎng)液，持續(xù)水培。

第二周期在前一周期試驗的基礎(chǔ)上，NaCl濃度梯度為0mmol/L（對照組）、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L，共六組，其余條件同上。

鹽脅迫兩周后取樣。隨機抽取每組植株一株，記錄植株生長情況，包括第一、第二對真葉葉長、根長、莖長和植株出現(xiàn)的特殊狀況，如葉上長癍，莖葉萎靡等。觀察分析得到實驗中合豐39大豆的耐鹽閾值。

通過生物信息學(xué)方法，我們已經(jīng)獲得了大豆耐鹽相關(guān)的候選基因。但其中很有可能仍包括一些不完整的基因片段。于是，我們對候選基因進行實驗驗證。

在對候選基因的進一步分析、選優(yōu)過程中，我們發(fā)現(xiàn)個別基因過短、保守域在基因中所占比例過大，難以設(shè)計合適的PCR引物的情況。借助計算機軟件Primer Premier 5.0，設(shè)計CG含量介于40%～60%、一對3’～5’和5’～3’引物退火溫度相差不超過5℃、引物長度介于18～25bp之間、PCR產(chǎn)物在300bp以上的對應(yīng)引物，并盡量確保沒有發(fā)卡或回文結(jié)構(gòu)。

采用合豐39大豆耐鹽閾值濃度50mmol/L NaCl的50%霍格蘭氏培養(yǎng)液，對水培植株進行鹽脅迫12小時，共5株。

取每棵植株第一片、第二片真葉各一片，一部分根。剪下植株組織后迅速置于10ml離心管中，標(biāo)記后置于液氮中保存。

使用康為RNA pure Plant Kit試劑盒提植物RNA，將獲得的 RNA溶液10μL， 向其中加入 1μL oligodT（50mmol/L），混勻離心，置于70℃水浴5分鐘。取出后立刻冰浴5分鐘。后向其中加入：

4μL 5×反轉(zhuǎn)錄酶的 Buffer；1μL反轉(zhuǎn)錄酶；0.5μL RNA酶 抑 制 劑 ；2.4μL Mg離 子 溶 液 （2.5mM）；1.1μL dNTPs（2.5mM）混勻后，25℃水浴5分鐘，再置于42℃水浴1小時，得到cDNA。

使 用 溫度梯度 PCR方 法， 從 51、53、55、56、57℃至59℃，共六個溫度梯度，40個循環(huán)，平行進行PCR擴增：

25μL System：2.5μL dNTPs；2.5μL 10×Taq buffer；0.5μL模板 cDNA；0.25μL正向引物S；0.25μL反向引物A；18.5μL水；0.5μL Taq酶。

配置1%瓊脂，冷凝后加入樣本、Marker，110V電泳，30分鐘后用EB染色，拍照。根據(jù)Marker條帶，估計PCR產(chǎn)物大小。并根據(jù)樣本條帶亮度，與對照組對比，估算濃度。

通過實驗，排除未能正常擴增的基因片段或不響應(yīng)與大豆鹽脅迫的基因。

1.4 實時熒光定量PCR測定預(yù)測基因表達量

通過普通PCR擴增與瓊脂糖凝膠電泳實驗，可以證明實驗選取的一部分基因是在大豆植株中存在并與耐鹽有關(guān)的。而實時熒光定量PCR實驗可以定量檢測預(yù)測基因在大豆植株中的表達量，并測定其改變量。因此，我們可以分析檢測同一基因在受不同時間鹽脅迫植株中的表達量，確定預(yù)測基因與大豆耐鹽的相關(guān)性。（步驟同驗證候選基因）

采用合豐39大豆耐鹽閾值濃度，含50mmol/L NaCl的50%霍格蘭氏培養(yǎng)液，對水培大豆植株進行鹽脅迫，分別進行鹽脅迫0小時、3小時、12小時、24小時、3天、5天，共6組，每組5株。按照相應(yīng)脅迫時間進行取樣 （取樣方法同1.3.2）。

使用康為RNApure Plant Kit提植物RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。（提取、反轉(zhuǎn)錄方法同步驟同驗證候選基因）PCR退火溫度為57℃，40個循環(huán)，每組5個樣品，分別將模板中cDNA濃度稀釋1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍，加入SYBR Green熒光染料，平行進行實時熒光定量PCR擴增。

最終確定預(yù)測基因的表達式樣與大豆所受鹽脅迫的相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆耐鹽基因的篩選結(jié)果

2.1.1 ORF預(yù)測結(jié)果 通過SoftBerry網(wǎng)站的相關(guān)軟件，我們以大豆基因組中1167011bp的DNA序列為基礎(chǔ)。預(yù)測了ORF共211個，其中113個位于正鏈，98個位于負鏈，平均長度1007bp；967個外顯子，平均長度220bp。

2.1.2 同源基因檢索結(jié)果 通過在NCBI雙子葉植物基因數(shù)據(jù)庫中進行BLAST檢索，211個預(yù)測基因中86個ORF沒有發(fā)現(xiàn)相似的序列，被淘汰；125個ORF與其它雙子葉植物基因有較強的相似性。根據(jù)已注釋的大豆及其它雙子葉植物基因的功能，從125個ORF中篩選出25個可能與大豆耐鹽相關(guān)的抗鹽候選基因。其功能涉及包括離子交換和調(diào)控基因表達等。

2.2 大豆耐鹽候選基因PCR驗證結(jié)果

2.2.1 合豐39大豆的耐鹽閾值測定結(jié)果

表1 第一周期耐鹽范圍測定的實驗結(jié)果

通過分析表1數(shù)據(jù)，鹽濃度在120mmol/L及以上的情況下，植株死亡過半，這種環(huán)境對于植株的脅迫作用相當(dāng)明顯，極大抑制植株的生長。鹽濃度在60mmol/L及以上的情況下，植株的葉子生長情況較差，葉片普遍偏小且下垂、黃萎，這種環(huán)境對于植株生長有比較大的脅迫作用。20mmol/L組共有9株樣品，其中有一株從第一對真葉展開后生長明顯遲緩，而后逐漸黃萎，在培養(yǎng)兩周后枯萎，個體異常造成該組存活率異常。綜合以上結(jié)果，可以分析得到合豐39大豆的耐鹽極限大致在40mmol/L—60mmol/L NaCl。

表2 第二周期耐鹽范圍測定的實驗結(jié)果

通過表2我們可以看出，當(dāng)鹽濃度超過50mmol/L后，第一片真葉黃萎、枯死明顯，第二片真葉雖都存活，但植株葉與根的生長都受到一定影響。經(jīng)過第二周期實驗，合豐39型大豆的耐鹽閾值可以確定在50-55mmol/L NaCl。

2.2.2 候選基因PCR驗證結(jié)果

通 過 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 實 驗 ，ORF20、ORF31、ORF33、ORF42、ORF62、ORF63和ORF79，都沒有明顯可見條帶，很有可能是不直接響應(yīng)于大豆鹽脅迫，遂將其排除；其它基因都基本正常擴增，證實它們在植株中能夠正常表達，確定候選基因13個。

2.3 實時熒光定量PCR結(jié)果

實驗一共進行了兩組，第一組將13個精篩后的候選基因和Tube、AS，共15個樣品進行實驗操作，繪制擴增曲線，分析DNA溶解溫度，最終確定10個候選基因，）進行第二組定量PCR擴增，精確測定表達量。

實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法處理，即以基因在每組脅迫0小時植株的根中的表達量為標(biāo)準(zhǔn)量1，計算相對表達量。實驗結(jié)果按根中的表達量可分為3種：

（1）單調(diào)增加。ORF179和ORF202在根中的表達量都是隨鹽脅迫時間成線性上升，說明該基因的表達是與植株耐鹽性狀正向相關(guān)的。如ORF179是PHD finger蛋白家族相關(guān)基因，參與到染色體狀態(tài)的調(diào)控和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[9]，該基因在鹽脅迫下的表達量增加，很可能是植株克服逆境的重要機制。

（2）先增高后降低。這些基因可能是植株的某種應(yīng)急機制。在受到鹽脅迫時，植株立即響應(yīng)，提高某些基因的表達，對抗不利環(huán)境，隨后在其它基因的陸續(xù)作用，或外界不利條件加劇的影響下，基因表達量再降低。如ORF160是亮氨酸拉鏈相關(guān)基因，是植物基因調(diào)控的重要因子，其在根中表達量上升又下降，很可能是受其他基因的影響，在短時的高表達之后，作用漸漸被其他基因所取代。

（3）單調(diào)下降。對于鹽脅迫時間長而表達量單調(diào)下降的基因而言，是與鹽脅迫反向相關(guān)。這樣的基因可能是受到鹽脅迫，表達被抑制。

圖1 實時熒光定量PCR

3 結(jié)論

實時熒光定量PCR的結(jié)果顯示，ORF179和ORF202是與大豆所受鹽脅迫成正相關(guān)的。說明其不僅響應(yīng)于大豆植株所受的鹽脅迫，還很有可能調(diào)控大豆其它相關(guān)基因的表達以對抗高鹽濃度對植株造成的損害。

ORF123等基因在根中的表達量都呈現(xiàn)先增高，后降低的過程。如ORF123，基因功能可能是Na+/H+逆向運輸?shù)鞍紫嚓P(guān)的基因，能降低胞質(zhì)Na+濃度，減輕Na+對酶類和膜系統(tǒng)的傷害，但之后其表達量又有所下降，推測是因為隨著鹽脅迫時間的增長，鹽溶液對植株的毒害作用逐漸增大，對其表達產(chǎn)生了影響；而其它基因功能可能為轉(zhuǎn)錄因子，其先增高后降低的趨勢，可能是一種預(yù)警或應(yīng)激機制，與耐鹽性狀并非直接相關(guān)。

ORF61在根中的表達量隨著鹽脅迫時間的增長而下降，屬于與鹽脅迫反向相關(guān)。

綜上所述，與鹽脅迫正向相關(guān)的基因ORF179 PHD finger transcription factor-like protein，位于大豆基因負鏈上；ORF202 ccaat-binding transcription factor subunit A，位于大豆基因正鏈上，是兩個調(diào)控基因。預(yù)測基因功能與離子轉(zhuǎn)運有關(guān)的基因ORF123 Na+/H+antiporter-like protein，位于大豆基因正鏈上，是結(jié)構(gòu)基因。根據(jù)多步實驗的逐級驗證，這三個基因在大豆植株中與其耐鹽性狀相關(guān)。

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[責(zé)任編輯：錢立武]

Q344

A

1674-1104(2014)03-0158-03

10.13420/j.cnki.jczu.2014.03.050

2014-03-14

原野（1992-），男，山西黎城人，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院學(xué)生，研究方向為植物生理及生物進化。