重組抗人表皮生長因子受體（EGFR）嵌合單克隆抗體CH225非還原電泳純度分析

付換成+盧秋麗+劉浩+張文秋+趙云

【摘要】 目的：分析CH225在非還原電泳時抗體條帶主條帶以外在高分子量和低分子量產(chǎn)生雜條帶的原因。方法：在不同的供試品緩沖液和不同電泳條件下進行SDS-PAGE電泳比較。結(jié)果：上樣前100 ℃煮樣1 min與加碘乙酰胺結(jié)果相同。結(jié)論：高分子量和低分子量雜條帶可以用電泳上樣前100 ℃煮樣1 min消除即可。

【關(guān)鍵詞】 非還原SDS-PAGE； 重組單抗； EGFR； 重組抗人表皮生長因子受體

藥品生產(chǎn)過程中，重組蛋白類藥物的質(zhì)量檢測和控制十分重要，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）是蛋白類藥物的純度分析的常用手段[1-2]。CH225（重組抗人表皮生長因子受體（EGFR）嵌合單克隆抗體）是四川恒星生物制藥有限公司采用基因工程技術(shù)，利用NS/0細胞表達的人源化抗體，屬于IgG1亞型，已用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、頭頸癌等多種癌癥的治療，并且現(xiàn)有研究表明可能適用于鼻咽癌、肺癌等其他癌癥的治療[3-4]。在CH225的臨床前研發(fā)，質(zhì)量檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，除抗體主條帶以外，還存在一些分子量大小不同的雜條帶，特別在非還原性實驗中，情況尤為明顯。本文采用不同溫度和不同試劑的條件下對樣品進行預(yù)處理，比較最佳的SDS-PAGE結(jié)果，為CH225批量生產(chǎn)的質(zhì)量檢測和控制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 參比品（批號C201105002）：四川恒星生物制藥有限公司于2011年5月第2批生產(chǎn)的CH225注射液；對照品（批號C201107006）：四川恒星生物制藥有限公司于2011年7月第6批生產(chǎn)的CH225注射液；愛比妥（Erbitux）：通用名西妥昔單抗（cetuximab），默克公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑和儀器 SDS-PAGE電泳裝置和掃描儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 緩沖液的配制 還原型SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍，4% SDS，200 mmol/L DTT；非還原型SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍，4% SDS；天然供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍；加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：向上述非還原SDS-PAGE供試品緩沖液中加入新鮮配制的1 mol/L碘乙酰胺母液，至終濃度為200 mmol/L。

1.4 實驗過程

1.4.1 70 ℃與100 ℃水浴非還原SDS-PAGE分析 C201105002（參比品）、稀釋至2 mg/mL與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，70 ℃分別水浴1、3、5 min后，立即轉(zhuǎn)入冰浴。另取相同樣品加入與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，100 ℃分別水浴1、3、5 min，立即轉(zhuǎn)入冰浴。再取相同樣品加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，不經(jīng)水浴。分離膠濃度8.0%，10 μL/孔上樣，100 V電壓開始電泳，待指示劑前沿進入分離膠后，電壓改為150 V。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍R250染色[5]。

1.4.2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE分析 C201105002（參比品）和Erbitux樣品均稀釋至2 mg/mL與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，分別70 ℃水浴3 min、100 ℃水浴1 min后，立即轉(zhuǎn)入冰浴。分離膠濃度8.0%，10 μL/孔上樣，100 V開始電泳，待指示劑前沿進入分離膠后，電壓改為150 V。另取相同樣品加入天然供試品緩沖液后不進行加熱變性處理，直接進行SDS-PAGE電泳。再取相同樣品加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，不經(jīng)水浴進行電泳。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍R250染色[5]。

1.4.3 添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE分析 C201105002（參比品）、C201107006和Erbitux樣品均稀釋至2 mg/mL，分別加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液或加碘乙酰胺的2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液，混勻后，70 ℃水浴3 min。分離膠濃度8.0%，上樣量10 μL，采用室溫條件下150 V恒壓電泳。電泳結(jié)束后，SDS-PAGE凝膠用考馬斯亮藍R250染色[1]。

2 結(jié)果

2.1 70 ℃與100 ℃不同時間水浴非還原SDS-PAGE分析 70 ℃分別處理1、2、3 min的樣品電泳結(jié)果的相對分子量小的次帶依次減少，70 ℃ 3 min相對分子量小的次帶已基本不可見；100 ℃ 1、2、3 min時相對分子量小的次帶有增加趨勢，100 ℃ 1 min時相對分子質(zhì)量小的次帶已基本消失；未經(jīng)水浴的條帶出現(xiàn)多個雜的相對分子低的次帶。表明對樣品進行70 ℃ 3min或者100 ℃ 1 min的水浴處理對減少相對分子小的次帶有較好的效果，見圖1。

2.2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE分析 未經(jīng)水浴的樣品中相對分子量大和相對分子量小的雜條帶比較明顯；對樣品進行過預(yù)處理的電泳結(jié)果條帶單一；而對樣品未經(jīng)預(yù)處理的天然SDS-PAGE電泳結(jié)果出現(xiàn)彌散狀條帶，見圖2。

2.3 添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE分析 愛比妥、C201107006、參比品在添加碘乙酰胺的情況下都比其沒有添加碘乙酰胺的相對分子量小的次帶要少得多；添加碘乙酰胺的樣品和未添加碘乙酰胺但經(jīng)過100 ℃ 1 min水浴的樣品的相對分子量小的次帶都明顯減少；在70 ℃ 3min煮樣后再添加碘乙酰胺對減少相對分子量小的次帶基本沒有效果，見圖3。endprint