西沙野生諾尼內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性初步研究

曹艷花, 劉 洋,*, 姚 粟, 李金霞, 譚望橋, 程 池,*

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,北京 100015;2.海南諾尼生物工程開(kāi)發(fā)有限公司,海南海口 570125)

海濱木巴戟(Morinda citrifolia Linn.)屬被子植物門(mén)(Angiospermae)木蘭綱(Magnoliopsida)茜草目(Rubiales)巴戟天族(Trib.Morindeae)木巴戟組(Morinda Sect.Roioc)植物,生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶,常被稱(chēng)為諾尼(Noni),也被稱(chēng)為海巴戟、檄樹(shù)、椿根、桔葉巴戟天、諾麗果、諾尼、水冬瓜、檄書(shū).原產(chǎn)于波利尼西亞、澳大利亞及一些太平洋島嶼,諾尼果被當(dāng)?shù)厝朔Q(chēng)作“神奇果”,現(xiàn)引種于我國(guó)海南等地.諾尼這種植物,特別是它的果實(shí),已經(jīng)作為民間的醫(yī)藥被應(yīng)用了幾個(gè)世紀(jì)[1],可用來(lái)治療多種疾病,如糖尿病、高血壓、心臟不適、疼痛、精神壓抑及消化不良等[2-3].已有科學(xué)研究證實(shí)諾尼果汁可以延長(zhǎng)Lewis肺癌小鼠的壽命[4].Wong[5]通過(guò)醫(yī)學(xué)記錄和病理切片對(duì)2例癌癥患者進(jìn)行了回顧性分析,發(fā)現(xiàn)患者服用諾尼果汁一段時(shí)間后,癥狀明顯改善.研究認(rèn)為諾尼果汁在臨床上雖不能作為主要抗癌藥物,但可作為癌癥免疫治療的佐藥.

諾尼果的抑菌功能是最先被發(fā)現(xiàn)的性質(zhì).早在1956年Atkinson就發(fā)現(xiàn)諾尼能夠抑制某些微生物,如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、幽門(mén)螺旋菌等的生長(zhǎng),同時(shí)指出抑制微生物生長(zhǎng)主要成分是酚類(lèi)物質(zhì)[6].Dittmar研究表明,諾尼果能夠有效地抑制不同種屬沙門(mén)氏菌、志賀氏菌生長(zhǎng).其研究同時(shí)也指出諾尼果抑菌作用在很大程度上與成熟度和處理過(guò)程有關(guān),果實(shí)完全成熟并且不經(jīng)過(guò)干燥處理時(shí)抑菌效果最好[7].諾尼果抑菌活性是否同其自身內(nèi)生微生物也有一定關(guān)系尚無(wú)相關(guān)科學(xué)研究,還有待于科學(xué)的考證.目前對(duì)諾尼的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值研究,對(duì)諾尼內(nèi)生微生物研究除本研究室外國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道.內(nèi)生菌是影響植物生長(zhǎng)至關(guān)重要的因素,因此系統(tǒng)地研究諾尼果內(nèi)生菌具有重要意義.

本研究首次采用16S rDNA克隆文庫(kù)構(gòu)建非培養(yǎng)方法對(duì)西沙野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行群落多樣性初步分析,可以獲得西沙野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其分布,能夠更好地為開(kāi)發(fā)利用諾尼這種特色經(jīng)濟(jì)物種奠定理論基礎(chǔ).同時(shí)首次采用Mothur軟件對(duì)諾尼果內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,構(gòu)建Mothur軟件數(shù)據(jù)分析平臺(tái),為進(jìn)一步的研究奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 西沙諾尼果樣品的采集

本研究以海南西沙野生諾尼成熟果實(shí)為研究材料.于2012年12月采集自中國(guó)海南省三沙市永興島,具體位置為東經(jīng)112.34°,北緯16.83°.樣品采用無(wú)菌袋密封置于冰上冷藏,帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80℃低溫保藏備用.

1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基:10 g胰蛋白胨,5 g酵母提取物,10 g NaCl,pH 7.0,去離子水定容至1 000 mL.LB固體培養(yǎng)基中需另加15 g瓊脂.

細(xì)菌基因組DNA提取及PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自TIANGEN公司;PCR引物合成及序列測(cè)定由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成.

1.3 諾尼果表面滅菌

采用乙醇-次氯酸鈉聯(lián)合滅菌[8]的方式對(duì)野生諾尼果進(jìn)行表面滅菌,首先將野生諾尼果用無(wú)菌水徹底清洗干凈表面,然后依次用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡3 min,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min,體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇清洗30 s,最后用無(wú)菌水沖洗5次,無(wú)菌濾紙吸取多余水分.將最后一次清洗的水少量涂布于R2A檢測(cè)平板上作為對(duì)照用于表面滅菌的效果檢測(cè),要求對(duì)照平板無(wú)菌落生長(zhǎng),確保表面滅菌徹底.

1.4 野生諾尼果基因組DNA的提取和純化

采用改良的CTAB方法直接從已表面滅菌徹底的野生諾尼果中提取和純化基因組DNA.稱(chēng)取10 g已表面滅菌的野生諾尼果置于研缽中,用液氮充分研磨后放入帶有已滅菌處理的EP管中,參考Liu等[9]對(duì)玉米種子內(nèi)生細(xì)菌總DNA提取的方法進(jìn)行諾尼果內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA提取.所得樣品基因組DNA于-20℃保存.基因組DNA的檢測(cè)在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳,EB染色后采用凝膠成像系統(tǒng)成像.

1.5 野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物純化

采用細(xì)菌 16S rDNA通用引物 799F(5′-AACAGGATTAGATACCCTG-3′)和 1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)野生諾尼果基因組總DNA的16S rDNA部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10].反應(yīng)體系(50uL):10×buffer 5 uL 、dNTP(2.5 mmol/L)4 uL、引物799F(10 mmol/L)2 uL、引物1492R(10 mmol/L)2 uL、Taq 酶(5 U/uL)0.25 uL、DNA 模板 3 uL,并采用ddH2O補(bǔ)足至50 uL.PCR反應(yīng)程序:94℃5 min;94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物采用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳,將所需條帶與其他植物DNA分開(kāi),EB染色后觀察擴(kuò)增結(jié)果,在紫外燈下用干凈的刀片切下730 bp左右DNA條帶的瓊脂糖凝膠,放入無(wú)菌的1.5 mL離心管中.采用OMEGA試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作.

1.6 野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)構(gòu)建

使用DU 800核酸蛋白分析儀測(cè)定純化后16S rDNA的PCR產(chǎn)物濃度.根據(jù)載體說(shuō)明書(shū)將已經(jīng)純化后約為730 bp的PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體(TRANSGEN)進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化.采用藍(lán)白篩方法進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選.文庫(kù)挑取100個(gè)白色克隆采用T7和SP6引物進(jìn)行PCR陽(yáng)性克隆檢測(cè),并將陽(yáng)性克隆菌液送樣北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序.序列采用Chimera-Check程序檢測(cè)并剔除嵌合序列,非嵌合序列采用EzBioCloud(http:∥eztaxone.ezbiocloud.net/)進(jìn)行序列比對(duì)分析,確定與已知模式菌株序列同源性關(guān)系.

1.7 克隆文庫(kù)的分析

采用 Mothur軟件[11](http://www.mothur.org/)對(duì)構(gòu)建的克隆文庫(kù)進(jìn)行Rarefaction curve繪制和多樣性指數(shù)比較分析.

1.7.1 繪制Rarefaction curve

利用Mothur軟件可以直接計(jì)算出可操作分類(lèi)單元(OTU)及相應(yīng)的n值.Rarefaction curve根據(jù)16S rDNA克隆文庫(kù)中已知OTU的相對(duì)比例,獲得n個(gè)克隆時(shí)出現(xiàn)OTU數(shù)量的期望值,然后根據(jù)n值與其對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)量的期望值來(lái)制作曲線,當(dāng)Rarefaction curve趨于平緩或者已經(jīng)達(dá)到平臺(tái)期時(shí)就能夠表示克隆文庫(kù)的庫(kù)容已經(jīng)基本足夠.

1.7.2 多樣性指數(shù)比較分析

利用Mothur軟件計(jì)算chao豐富度指數(shù)、ACE豐富度指數(shù)、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)[12],對(duì)諾尼果內(nèi)生細(xì)菌豐富度及多樣性等進(jìn)行評(píng)價(jià).

1.8 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

將獲得的諾尼果內(nèi)生細(xì)菌陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)定結(jié)果中代表序列提交至GenBank.用ClustalX 1.83按照最大同源性的原則對(duì)測(cè)定序列及其模式菌株序列進(jìn)行比對(duì),并用MEGA 4.0軟件以鄰接法(neighbor-jining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[13],自展值(Bootstrap values)設(shè)為1 000分析評(píng)估進(jìn)化樹(shù)的穩(wěn)定性,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 野生諾尼果基因組DNA的提取

野生諾尼果表面滅菌最后一次清洗用水涂布于R2A檢測(cè)平板48h后未見(jiàn)菌落生長(zhǎng),證明野生諾尼果樣品表面滅菌徹底.以表面滅菌合格的野生諾尼果為材料,采用改良的CTAB法提取基因組DNA,利用DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA濃度,260nm/280nm大小約為1.8,符合標(biāo)準(zhǔn).瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示,基因組DNA片段大小約為23kb,見(jiàn)圖1,其中包含諾尼果和內(nèi)生細(xì)菌兩者的基因組DNA.

2.2 野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA片段PCR擴(kuò)增

細(xì)菌DNA與植物線粒體DNA和葉綠體DNA在系統(tǒng)發(fā)育分析上具有較近同源性,對(duì)于植物基因組DNA的PCR過(guò)程其引物的選擇是關(guān)鍵.參考孫磊等[10]利用基因組DNA為模板進(jìn)行水稻根內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA片段PCR擴(kuò)增方法,本研究為盡量避免植物線粒體DNA和葉綠體DNA干擾,利用799f-1492r引物對(duì)諾尼果基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)為兩條帶,一條位于730 bp左右,應(yīng)為野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA片段,另一條位于1 000～1 500 bp,應(yīng)是諾尼果線粒體DNA片段,結(jié)果如圖2.

利用OMEGA膠純化回收試劑盒對(duì)凝膠電泳檢測(cè)中位于730 bp膠回收純化,回收730 bp的PCR產(chǎn)物,見(jiàn)圖3,將用于構(gòu)建野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù).

圖1 基因組DNAFig.1 Genomic DNA

圖2 PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化Fig.3 Purification of PCR products

2.3 野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)構(gòu)建及序列分析

利用TRANSGEN公司的pEASY-T3克隆試劑盒將已純化回收730 bp左右PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化,構(gòu)建野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù).挑取了100個(gè)16S rDNA白色克隆子,送樣測(cè)序后經(jīng)chimera-check分析檢測(cè)嵌合序列并剔除.西沙野生諾尼果16S rDNA克隆文庫(kù)共獲得93條可用序列.將16S rDNA克隆序列利用EzBioCloud比對(duì)分析,與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行相似性比較從而得到最相近的模式菌株序列.

將所得到的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果中代表序列提交GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù),所得序列號(hào)為KC478826-KC478837.得到西沙野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌序列比對(duì)結(jié)果如表1.在屬水平上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),如圖4.構(gòu)建的西沙諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16 S rDNA克隆文庫(kù)中,93個(gè)克隆分屬于12個(gè)不同的可操作分類(lèi)單元(OTU),序列比對(duì)結(jié)果表明,大部分克隆與已知細(xì)菌的16S rDNA序列相似性較高.93個(gè)克隆分別屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)的 Alpha、Beta、Gamma綱,放線菌門(mén)(Actinobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)中的不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)、水桿狀菌屬(Aquabacterium sp.)、甲基桿菌屬(Methylobacterium sp.)、水庫(kù)桿菌屬(Piscinibacter sp.)、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas sp.)、賽托氏菌屬(Schlegelella sp.)、厭氧球菌屬(Anaerococcus sp.)、嗜蛋白胨菌屬(Peptoniphilus sp.)、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)、放線鏈孢菌屬(Actinomycetospora sp.)和土壤紅色桿形菌屬(Solirubrobacter sp.).從表中可以看出,優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)(Proteobacteria),優(yōu)勢(shì)屬為β變形菌綱(β-Proteobacteria)中的(Piscinibacter sp.),占總克隆數(shù)的80.65%,為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群.

表1 非培養(yǎng)方法分離諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列相似性分析Tab.1 Sequence analysis of 16S rDNA from fruit of Noni

2.4 Rarefaction curve對(duì)克隆文庫(kù)的評(píng)價(jià)

通過(guò)Mothur軟件比較DNA序列相似性,將相似性大于或等于97%的序列歸為同一種可操作分類(lèi)單元(OTU).采用Mothur軟件生成的數(shù)據(jù)繪制稀缺性曲線(Rarefaction curve)如圖5,Rarefaction curve圖顯示OTU數(shù)目隨克隆子數(shù)目增多而增加,但增幅逐漸變小,稀缺性曲線上升幅度逐漸平緩,這在一定程度上表明挑取的克隆已基本能反應(yīng)諾尼果內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫(kù)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的類(lèi)群.

2.5 諾尼果內(nèi)生細(xì)菌多樣性比較分析

研究用Mothur軟件計(jì)算諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列的遺傳矩陣,再進(jìn)行OTU分類(lèi),用chao和ACE對(duì)物種豐富度進(jìn)行估算,并計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù).97%遺傳距離的多樣性如表2,結(jié)果表明在97%遺傳距離的水平諾尼果內(nèi)生細(xì)菌chao豐富度指數(shù)為10.75,ACE豐富度指數(shù)為11.8,Shannon Weaver多樣性指數(shù)為0.899,Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為0.651 4.目前利用Mothur軟件對(duì)克隆文庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的相關(guān)報(bào)道較少,袁超磊等[14]在紅壤剖面微生物群落研究中,所得不同樣品chao的范圍在23-2219.本研究chao指數(shù)同其比較相對(duì)較低,這同樣品采集及樣品為內(nèi)生細(xì)菌的研究有較大關(guān)系,在一定程度上能夠反映西沙野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌群落具有一定的豐富度,后續(xù)研究中還需進(jìn)一步對(duì)多個(gè)樣品比較分析.許璐等[15]研究中國(guó)沙棘居群的多樣性,多樣性指數(shù)平均值為0.85.本研究的Shannon多樣性數(shù)值為0.899同其相比略高,能夠表明諾尼果內(nèi)生細(xì)菌較為豐富.

圖4 鄰接法構(gòu)建的諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree constructed with endophytic bacteria isolated from fruit of Noni

表2 OTU分類(lèi)及細(xì)菌多樣性比較分析Tab.2 OTU list and comparative analysis of bacterial diversity

圖5 諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)稀缺性曲線Fig.5 Rarefaction curve of endophytic bacterial 16S rDNA clone library of fruit of Noni

3 討 論

諾尼是天然、富含多種營(yíng)養(yǎng)成分的植物,具有很高的臨床藥用價(jià)值.目前諾尼在我國(guó)海南等熱帶地區(qū)的引種種植已獲成功,在海南諾尼生物工程開(kāi)發(fā)有限公司諾尼種植基地已較大面積的推廣種植.同時(shí)國(guó)內(nèi)外的研究均表明,諾尼植株本身和諾尼產(chǎn)品對(duì)于當(dāng)今的城市病、亞健康等都有著很好的療效.其保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和研究已成為新的熱點(diǎn),已投放市場(chǎng)的保健產(chǎn)品有諾尼果汁、凍干粉等,市場(chǎng)前景較好.我國(guó)新制定的《食品工業(yè)“十二五”發(fā)展規(guī)劃》中,營(yíng)養(yǎng)與保健食品制造業(yè)首次被納入國(guó)家食品產(chǎn)業(yè)規(guī)劃并成為重點(diǎn)行業(yè),這反映了國(guó)家對(duì)保健食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的高度重視.然而目前對(duì)重要的保健食品原材—諾尼的研究主要集中在種植、栽培、產(chǎn)品研發(fā)等的研究,對(duì)諾尼果內(nèi)生菌的相關(guān)研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道.本研究采用構(gòu)建克隆文庫(kù)的非培養(yǎng)方法首次對(duì)諾尼果內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行初步分析,不僅具有重要的理論與創(chuàng)新意義,而且具有重要的實(shí)施必要性.

本研究首次采用構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)的方法對(duì)我國(guó)海南西沙諾尼果內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行初步分析,16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析表明獲得的93個(gè)諾尼果內(nèi)生細(xì)菌克隆歸屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria),放線菌門(mén)(Actinobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)三大類(lèi)群,水庫(kù)桿菌屬(Piscinibacter sp.)為優(yōu)勢(shì)菌群,研究結(jié)果揭示出諾尼果內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有較為豐富的多樣性,為諾尼內(nèi)生菌的相關(guān)研究提供理論依據(jù).水庫(kù)桿菌屬(Piscinibacter sp.)目前此屬中只有水水庫(kù)桿菌(Piscinibacter aquaticus)一個(gè)種.Piscinibacter aquaticus是2009年由Methylibium aquaticum分類(lèi)學(xué)地位變遷而來(lái),最初人工分離自淡水池塘.已有研究表明水水庫(kù)桿菌(Piscinibacter aquaticus)在R2A培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天菌落圓形、米色、表面光滑,菌體短桿狀,具有堿性磷酸酶活性,能分泌植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸[16].劉洋等[17]已有研究表明在西沙野生諾尼種子內(nèi)生細(xì)菌群落中包含6.11%的水庫(kù)桿菌屬(Piscinibacter sp.).本研究中水庫(kù)桿菌屬(Piscinibacter sp.)占80.65%,而其他植物內(nèi)生細(xì)菌的報(bào)道中尚未見(jiàn)如此高比例.對(duì)諾尼果中的水庫(kù)桿菌屬(Piscinibacter sp.)還需通過(guò)可培養(yǎng)方法獲得純菌種后進(jìn)行深入研究.因本研究對(duì)野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究,在本研究獲得的理論基礎(chǔ)上還需對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行宏基因組等方法分析,以期獲得野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為詳細(xì)的信息.

本研究首次采用Mothur軟件對(duì)諾尼內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫(kù)進(jìn)行多樣性分析,構(gòu)建數(shù)據(jù)分析平臺(tái),為進(jìn)一步的科學(xué)研究奠定基礎(chǔ).在對(duì)非培養(yǎng)方法獲得的序列進(jìn)行可操作分類(lèi)單元(OTU)劃分時(shí),分類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)是非常重要的因素也是比較有爭(zhēng)議的指標(biāo).常用的OTU物種定義標(biāo)準(zhǔn)是99%[18]的序列相似性(遺傳距離分界值設(shè)定為0.01)和97%[19]的序列相似性(遺傳距離分界值設(shè)定為0.03).本研究以“屬”水平為標(biāo)準(zhǔn)采用97%的序列相似性,同時(shí)為有效地避免單一指數(shù)評(píng)價(jià)造成的偏差,通過(guò)多種指數(shù)來(lái)綜合評(píng)價(jià)物種的多樣性.這也是本研究采用多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)等多種指數(shù)進(jìn)行分析的原因所在,這樣得出的結(jié)論才更具有客觀性.本研究通過(guò)多樣性指數(shù)的分析顯示研究結(jié)果能夠在一定程度上表明西沙野生諾尼果內(nèi)生細(xì)菌具有多樣性.

綜上所述,西沙野生諾尼果中內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性較為豐富.在此研究基礎(chǔ)上,將進(jìn)一步開(kāi)展諾尼果可培養(yǎng)內(nèi)生微生物及功能微生物的研究,并對(duì)微生物的組成與諾尼果汁理化性狀的相關(guān)性進(jìn)行研究,為諾尼微生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)研究提供更豐富的信息.

[1] Abbott I A,Shimazu C.The geographic origin of the plants most commonly used for medicine by Hawaiians[J].Journal of Ethnopharmacology,1985,14(2-3):213-222.

[2] 張偉敏,魏靜,施瑞誠(chéng),等.Noni果的活性成分和生理功能的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2007,19(6):1087-1091.

[3] Solomon N.Nature's amazing healer,Noni[M].Pleasant Grove,Utah:Woodland Publishing,1998:104.

[4] Hirazumi A,Furusawa E,Chou S C,et al.Anticancer activity of Morinda citrifolia(Noni)on intraperitoneally implanted Lewis lung carcinoma in syngeneic mice[J].Proceedings of the Western Pharmacology Society,1994,37:145.

[5] Wong D K.Are immune responses pivotal to cancer patient's long term survival?Two clinical case-study reports on the effects of Morinda citrifolia(Noni)[J].Hawaii Medical Journal,2004,63(6):182-184.

[6] Atkinson N. Antibacterial substances from flowering plants.3.Antibacterial activity of dried Australian plants by a rapid direct plate test[J].The Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science,1956,34(1):17-26.

[7] Dittmar A.Morinda citrifolia L.-use in Indigenous Samoan medicine[J].Journal of Herbs,Spices and Medicinal Plants,1993,1(3):77-92.

[8] 劉洋,左山,鄒媛媛,等.雜交玉米農(nóng)大108及其親本種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(23):4763-4771.

[9] Liu Yang,Zuo Shan,Zou Yuanyuan,et al.Investigation on diversity and population succession dynamics of endophytic bacteria from seeds of maize(Zea mays L.,Non-gda108)at different growth stages[J].Annals of Microbiology,2013,63(1):71-79.

[10] 孫磊.非培養(yǎng)方法和培養(yǎng)方法對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌的研究[D].北京:首都師范大學(xué),2006:1-108.

[11] Schloss P D,Westcott S L,Ryabin T,et al.Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing and comparing microbial communities[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(23):7537-7541.

[12] Paul F K,Josephine Y A.Bacterial diversity in aquatic and other environments:what 16S rDNA libraries can tell us[J].FEMS Microbiology Ecology,2004,47(2):161-177.

[13] Tamura K,Dudley J,Nei M,et al.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J].Molecular Biology and Evolution,2007,24(8):1596-1599.

[14] 袁超磊,賀紀(jì)正,沈菊培,等.一個(gè)紅壤剖面微生物群落的焦磷酸測(cè)序法研究[J].土壤學(xué)報(bào),2013,50(1):138-149.

[15] 許璐,蘇雪,董莉娜,等.青藏高原東緣中國(guó)沙棘的克隆多樣性及克隆結(jié)構(gòu)[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2012,21(3):117-124.

[16] Stackebrandt E,Verbarg S,Frühling A,et al.Dissection of the genus Methylibium:reclassification of Methylibium fulvum as Rhizobacter fulvus comb.nov.,Methylibium aquaticum as Piscinibacter aquaticus gen.nov.,comb.nov.and Methylibium subsaxonicum as Rivibacter subsaxonicus gen.nov.,comb.nov.and emended descriptions of the genera Rhizobacter and Methylibium[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2009,59(Pt 10):2552-2560.

[17] 劉洋,李輝,李金霞,等.西沙野生諾尼種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的初步研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2013(10):142-147.

[18] Kroes I,Lepp P W,Relman D A.Bacterial diversity within the human subgingival crevice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96(25):14547-14552.

[19] Stackebrandt E,Rainey F A.Partial and complete 16S rDNA sequences,their use in generation of 16S rDNA phylogenetic trees and their implications in molecular ecological studies[M].Netherlands:Kluwer Academic Publishers,1995:259-275.