Ca2+對(duì)CcRIPII-2基因轉(zhuǎn)化寧陽(yáng)大棗的影響

黃艷艷,羅磊,牛慶霖,,劉峰,翁曼麗,劉靜,馮殿齊*

Ca2+對(duì)CcRIPII-2基因轉(zhuǎn)化寧陽(yáng)大棗的影響

黃艷艷1,羅磊1,牛慶霖2,1,劉峰2,翁曼麗3,劉靜1,馮殿齊1*

1.泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院,山東泰安271000
2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué),山東泰安271018
3.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所,北京100101

本研究應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響寧陽(yáng)大棗基因轉(zhuǎn)化的各項(xiàng)因子進(jìn)行了分析比較，并著重探索了Ca2+濃度對(duì)侵染轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明：侵染效率最高的組合為1/2侵染液濃度，20 min侵染時(shí)間和0 mg/L Ca2+濃度。Ca2+濃度在提高寧陽(yáng)大棗基因轉(zhuǎn)化效率方面沒有明顯促進(jìn)效果。Ca2+濃度僅對(duì)平均分化芽數(shù)影響較大，濃度為0 mg/L時(shí)，平均分化芽數(shù)最多。本試驗(yàn)共獲得27株轉(zhuǎn)化苗，試驗(yàn)轉(zhuǎn)化效率為33.33%。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法;香樟核糖體失活蛋白基因;棗瘋病;Ca2+濃度

棗瘋病是我國(guó)棗樹的一種嚴(yán)重病害，由MLO病毒感染引起[1]。防治方法主要有兩類：一是常規(guī)防治方法，二是化學(xué)防治方法，但防治效果都不理想[2]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因工程已成為現(xiàn)代植物改良育種的有效手段。本試驗(yàn)針對(duì)當(dāng)?shù)靥赜袃?yōu)良棗樹品種寧陽(yáng)大棗（Ningyang Jujube）深受棗瘋病困擾的現(xiàn)實(shí)，以自主構(gòu)建的香樟CcRIP II抗病基因?yàn)槟康幕?，利用該基因產(chǎn)生的對(duì)病毒和真菌的廣譜抗性，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，使用已建立良好再生體系的優(yōu)良棗樹品種寧陽(yáng)大棗組培苗為試驗(yàn)材料，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法受多重因素的影響。本試驗(yàn)設(shè)立了侵染液濃度，侵染時(shí)間與Ca2+濃度3個(gè)因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。試驗(yàn)在以往棗樹農(nóng)桿菌介導(dǎo)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將Ca2+的濃度作為一個(gè)試驗(yàn)變量來進(jìn)行研究，著重探索了Ca2+濃度對(duì)農(nóng)桿菌侵染過程的影響，探索更為高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以提高當(dāng)?shù)靥赜衅贩N寧陽(yáng)大棗的基因轉(zhuǎn)化效率，并進(jìn)一步提高寧陽(yáng)大棗抗棗瘋病的能力，也為棗樹基因轉(zhuǎn)化研究和防治棗瘋病做些有益探索。

1 材料與方法

1.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Orthogonal experiment design L9(34)

表2 農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Agrobacterium-mediated gene transformation orthogonal experiment design L9(34)

1.2受體材料

本試驗(yàn)受體材料為寧陽(yáng)大棗（Ningyang Jujube）長(zhǎng)紅品種，為泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)中心自主培養(yǎng)的組培苗。

1.3基因來源

本研究所采用的香樟核糖體失活蛋白基因CcRIP II，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院共同分離克隆。

1.4實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 預(yù)培養(yǎng)取寧陽(yáng)大棗長(zhǎng)紅組培苗為待用材料，選擇生長(zhǎng)健壯的莖段作為侵染試材。每個(gè)莖段(1 cm左右)至少要保留一對(duì)芽，切兩端，平鋪到培養(yǎng)基上。試驗(yàn)共9個(gè)組合，每個(gè)組合3瓶。每個(gè)組合對(duì)應(yīng)2個(gè)對(duì)照組，共45瓶。將按試驗(yàn)設(shè)計(jì)做好的瓶苗作好標(biāo)記并注明日期,，暗培養(yǎng)2～6 d。

1.4.2 菌種活化將含有香樟核糖體失活蛋白基因（CcRIP II-2）的農(nóng)桿菌按150μL:100 mL體積比接種于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，在搖床上于28℃，180 r/min條件下培養(yǎng)過夜。菌液OD值：0.4～0.6。

1.4.3 侵染將已預(yù)培養(yǎng)的材料取出來，在無菌條件下進(jìn)行適當(dāng)刻傷處理（對(duì)照組同樣處理），根據(jù)正交設(shè)計(jì)加入相應(yīng)的侵染液進(jìn)行侵染。其中原液即為含有CcRIP II-2基因的正常搖菌所得的農(nóng)桿菌菌液濃度（菌液OD值0.4～0.6）；1/2菌液為含一半CcRIP II-2基因的農(nóng)桿菌菌液（菌液OD值0.4～0.6）和一半MS母液的混合液體；1/3菌液為含有1/3 CcRIP II-2基因的農(nóng)桿菌菌液和2/3MS母液的混合液體。在侵染過程中要進(jìn)行間歇性的搖動(dòng)。

1.4.4 共培養(yǎng)按試驗(yàn)設(shè)計(jì)侵染結(jié)束，將材料從侵液中取出放到帶有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上，吸干表面菌液，接種在分化培養(yǎng)基上，共27瓶轉(zhuǎn)化材料和18瓶對(duì)照材料，一起暗共培養(yǎng)2 d。

1.4.5 卡那霉素篩選共培養(yǎng)結(jié)束，將受體材料和相應(yīng)的對(duì)照材料轉(zhuǎn)接于含有卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。卡那篩選培養(yǎng)基的選擇壓力設(shè)定2個(gè)不同的梯度：30 mg/L（一篩培養(yǎng)基）、50 mg/L（二篩培養(yǎng)基）。選擇過程為2個(gè)周期，每周期依次設(shè)置7 d，30 d。選擇培養(yǎng)結(jié)束可對(duì)初選出的抗性苗進(jìn)行采樣、提取DNA和進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.5試驗(yàn)調(diào)查

侵染材料轉(zhuǎn)入卡那霉素一篩培養(yǎng)后開始對(duì)轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的調(diào)查。分別調(diào)查一篩Kan 30 mg/L，二篩Kan 50 mg/L培養(yǎng)基上苗木生長(zhǎng)情況數(shù)據(jù)。

本試驗(yàn)主要是針對(duì)篩選后植物材料的成活率%、每株枯死程度（全部枯死，每株枯死3/5、每株枯死1/5）、平均分化芽數(shù)/株、平均新芽高度（cm）等指標(biāo)進(jìn)行調(diào)查分析。

1.6分子檢測(cè)

對(duì)經(jīng)過第二次篩選培養(yǎng)30 d的寧陽(yáng)大棗轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行采樣，按試驗(yàn)組合順序編號(hào)。本試驗(yàn)共獲得81個(gè)存活的抗性芽苗，因有的芽苗過小，采樣時(shí)只采集到27個(gè)株號(hào)的組培苗。對(duì)這27個(gè)號(hào)提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。根據(jù)所提供的CcRIP II-2基因的序列資料，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物：

引物1：5'-TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT-3'

引物2：5'-TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA–3'

2 結(jié)果與分析

2.1第一次卡那霉篩選結(jié)果

在共培養(yǎng)結(jié)束后，將受體材料莖段轉(zhuǎn)移至一篩培養(yǎng)基中（卡那霉素濃度為30 mg/L）培養(yǎng)，7 d后對(duì)每個(gè)組合中的成活苗、枯死苗、每株枯死1/5與每株枯死3/5的莖段所占的比例以及平均新芽高度、平均分化芽數(shù)以及生長(zhǎng)狀態(tài)做了調(diào)查統(tǒng)計(jì)。見表3。

表3 卡那霉素第一次篩選調(diào)查Table 3 The first selection of Kanamycin

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，可以直觀看出受體材料一篩培養(yǎng)時(shí)的成活率和分化生長(zhǎng)情況，見圖1、圖2：

圖1 一篩成活率Fig.1 Survival rate of the first screening culture

圖2 一篩分化生長(zhǎng)情況Fig.2 Differential growth of the first screening culture

從圖1可直觀看出，成活苗最多的是組合6（1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度），成活率為68.3%，與成活率最低的組合1（侵染液原液+10 min侵染時(shí)間+0 mg/L Ca2+濃度）相差30.2%。從受體材料枯死程度看，組合2和組合8枯死枯死程度為3/5的數(shù)值最低，不到10%，組合4最高達(dá)40%；枯死程度為1/5的組合中，組合1最高，達(dá)60%，組合4（1/2侵染液濃度+10 min侵染時(shí)間+880 mg/L Ca2+濃度）最低，不到10%。綜合各組合受體材料的成活率表現(xiàn)，成活率差異較大，基本無枯死苗；枯死程度為1/5的和枯死程度為3/5的數(shù)量呈相反增減趨勢(shì)，這一點(diǎn)從組合3至組合9的趨勢(shì)最明顯。因此，最有利于提高受體材料成活率的是組合6（1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度）。

從圖2看出，受體材料生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸增強(qiáng)，組合1、2長(zhǎng)勢(shì)一般，組合3至組合9長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定增強(qiáng)；分化新芽數(shù)量差異不大，每組數(shù)量都在1～1.5個(gè)之間，組合9最多，為1.4個(gè)；各組合的新芽高度都很低，都不到0.5 cm，無明顯生長(zhǎng)，這和培養(yǎng)時(shí)間短有關(guān)。綜合以上分析，一篩培養(yǎng)時(shí)，受體材料生長(zhǎng)狀況還處于新芽萌發(fā)和適應(yīng)生長(zhǎng)階段，較適合新芽萌發(fā)的是組合9（1/3侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+0 mg/L Ca2+濃度）。

根據(jù)表3第一次篩選結(jié)果，對(duì)受體材料成活率、平均新芽高度、平均分化芽數(shù)進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表4：

表4 第一次篩選培養(yǎng)極差分析Table 4 orthogonal analysis to the first screening culture

由表4分析得出，對(duì)成活率影響最大的因素為侵染液濃度，其次為Ca2+濃度，侵染時(shí)間影響最小。在各因素中，侵染液濃度以1/2侵染液濃度為最佳，侵染時(shí)間以20 min最佳，Ca2+濃度為440 mg/L時(shí)最佳。因此成活率最高的組合是：1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度。

對(duì)平均新芽高度影響最大的因素為侵染液濃度，其次為侵染時(shí)間，影響最小的是Ca2+濃度。得到平均新芽高度最高的組合為：1/3侵染液濃度+10 min侵染時(shí)間+880 mg/L Ca2+濃度。

對(duì)平均分化芽數(shù)影響最大的因素為Ca2+濃度，其次為侵染液濃度，影響最小的是侵染時(shí)間。得到平均分化芽數(shù)最多的組合為：1/3侵染液濃度+10 min侵染時(shí)間+0 mg/L Ca2+濃度。

綜合一篩培養(yǎng)直觀分析和極差分析結(jié)果，在成活率和新芽分化數(shù)量方面基本一致。

2.2第二次卡那霉篩選

在一篩培養(yǎng)結(jié)束后，將受體材料莖段轉(zhuǎn)入二篩培養(yǎng)基（卡那霉素濃度為50 mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)，30 d后調(diào)查每個(gè)組合中的成活苗、枯死苗、每株枯死1/5與每株枯死3/5的莖段所占的比例以及平均新芽高度、平均分化芽數(shù)、生長(zhǎng)量以及生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果見表7。

表5 卡那霉素第二次篩選Table 5 The second screening culture of Kanamycin

根據(jù)表5數(shù)據(jù)，可以直觀看出受體材料二篩培養(yǎng)時(shí)的成活率和分化生長(zhǎng)情況，見圖3、圖4：

圖3 二篩成活率Fig.3 Survival rate of the second screening culture

圖4 二篩分化生長(zhǎng)情況Fig.4 Differential growth of the second screening culture

從圖3看出，在二篩培養(yǎng)中變化最明顯的是枯死苗數(shù)量顯著增加，呈明顯上升趨勢(shì)，組合9枯死率最高，有接近60%的受體材料都枯死了，其次是組合4，枯死率最低的是組合6，不到30%，與最高枯死率相差30%左右；各組合成活苗數(shù)量也出現(xiàn)明顯差異，成活率最高的是組合5，為42%，最低的是組合7（1/3侵染液濃度+10 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度），僅19%，兩者相差23%；枯死程度3/5和1/5的表現(xiàn)較一致，枯死率呈現(xiàn)減—增—減的數(shù)量整體趨向。綜上，成活苗最多的是組合5（1/2侵染液濃度+15 min侵染時(shí)間+0 mg/L Ca2+濃度），枯死率最高的是組合9（1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度）。

從圖4看出，二篩受體材料生長(zhǎng)狀態(tài)呈現(xiàn)前后一般中間較強(qiáng)的特點(diǎn)，組合1、2、3、8、9為同一水平，長(zhǎng)勢(shì)一般，組合4、5、6、7為同一水平，長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，無明顯突出的組合；各組合分化芽數(shù)差異不大，都在1個(gè)～1.5個(gè)之間，其中組合2最多，為1.5個(gè)；各組合生長(zhǎng)量差異不大，都在0.5 cm～1.5 cm之間，組合2最大，為1.4 cm，比最小的組合8多0.68 cm；新芽高度差異不顯著，最大的組合7為1.17 cm比最小的組合5高0.65 cm。綜上，除生長(zhǎng)狀態(tài)外，各組合的新芽高度、分化新芽數(shù)量和生長(zhǎng)量生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，差異幅度都不大。組合2（侵染原液+15 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度）分化芽數(shù)最多，生長(zhǎng)量最大，組合7（1/3侵染液濃度+10 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度）新芽最高。

根據(jù)表5第二次篩選所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行正交分析，結(jié)果見表6。

表6 第二次篩選培養(yǎng)極差分析Table 6 Range analysis to the second screening culture

從表6計(jì)算的受體材料成活率、平均新芽高度、平均分化芽數(shù)極差結(jié)果，得出：

各因素對(duì)成活率的影響依次為：侵染液濃度＞Ca2+濃度＞侵染時(shí)間。得到成活率最高的組合為：1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+0 mg/L Ca2+濃度。

各因素對(duì)平均新芽高度的影響依次為：侵染液濃度＞侵染時(shí)間＞Ca2+濃度。得到平均新芽高度最高的組合為：1/3侵染液濃度+10 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度。

各因素對(duì)平均分化芽數(shù)的影響依次為：Ca2+濃度＞侵染液濃度＞侵染時(shí)間。得到平均分化芽數(shù)最多的組合：1/3侵染液濃度+15 min侵染時(shí)間+0 mg/L Ca2+濃度。

綜合二篩極差分析結(jié)果，侵染液濃度對(duì)成活率和新芽高度影響最大，Ca2+濃度對(duì)分化芽數(shù)影響最大。

綜合二篩培養(yǎng)直觀分析和極差分析結(jié)果：

影響受體材料成活率和新芽高度最大的因素是侵染液濃度，影響分化芽數(shù)最大的因素是Ca2+濃度。

成活率最高的是組合5：1/2侵染液濃度+15 min侵染時(shí)間+0 mg/L Ca2+濃度；

枯死率最高的是組合9：1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度；

分化芽數(shù)最多，生長(zhǎng)量最大的是組合2：侵染原液+15 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度；新芽生長(zhǎng)最高的是組合7：1/3侵染液濃度+10 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度。

綜合比較一篩和二篩極差分析結(jié)果，見表7：

表7 極差分析比較Table 7 Comparison of the range analysis

從表7看出，在一篩培養(yǎng)時(shí)，對(duì)受體材料成活率和新芽高度影響最大的是侵染液濃度，對(duì)分化芽數(shù)影響最大的是Ca2+濃度；二篩培養(yǎng)時(shí)，對(duì)受體材料成活率和新芽分化數(shù)影響最大的是Ca2+濃度，侵染液濃度對(duì)新芽高度影響較大。綜上，兩次篩選培養(yǎng)中，Ca2+濃度對(duì)新芽分化數(shù)影響都最大，成活率受侵染液濃度和Ca2+濃度雙重影響，侵染液濃度都是影響新芽高度的最重要因素。

對(duì)一篩、二篩的最佳組合進(jìn)行比較，分析兩次培養(yǎng)的差異，見表8。

表8 最佳組合比較Table 8Aggregate optimum group

綜合分析兩次篩選培養(yǎng)最佳組合，結(jié)果基本類似，只略有不同。

Ca2+濃度對(duì)兩次篩選培養(yǎng)中受體材料成活率和新芽高度有明顯影響，在侵染液濃度和侵染時(shí)間相同情況下，一篩培養(yǎng)的Ca2+濃度比二篩培養(yǎng)的濃度高440 mg/L。在兩次培養(yǎng)中，適合提高成活率的侵染液濃度都是1/2侵染液濃度，侵染時(shí)間都是20 min；適合新芽高生長(zhǎng)的侵染液濃度都是1/3侵染液濃度，侵染時(shí)間都是10 min；

Ca2+濃度對(duì)新芽分化數(shù)影響不明顯，兩次篩選培養(yǎng)中都是不添加Ca2+時(shí)分化芽數(shù)最多。侵染時(shí)間對(duì)兩次篩選的影響差異最大，在侵染液濃度和Ca2+濃度相同情況下，一篩培養(yǎng)選用10 min侵染時(shí)間，二篩培養(yǎng)選用15 min侵染時(shí)間能分化最多新芽。

本試驗(yàn)中，根據(jù)第二次篩選培養(yǎng)結(jié)果，可初步判斷受體材料基因轉(zhuǎn)化效率，主要以篩選后轉(zhuǎn)化受體的成活率為標(biāo)準(zhǔn)，所以轉(zhuǎn)化效率最高的組合為：1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+0 mg/LCa2+濃度。

2.3轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分子鑒定

圖5 PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.5 PCR electrophoretogram

由PCR電泳圖可見，檢測(cè)的27個(gè)株號(hào)轉(zhuǎn)基因植株全部顯示出明顯的陽(yáng)性目的條帶，而未轉(zhuǎn)化植株沒有顯示出目的條帶。這初步表明外源香樟核糖體失活蛋白基因已整合到寧陽(yáng)大棗基因組內(nèi)。

3 討論

本試驗(yàn)采用的核糖體失活蛋白基因RIP是一種專一性較強(qiáng)的毒蛋白，可抑制某些蛋白質(zhì)的生物合成，從而達(dá)到提高抗性的目的。RIP的抗性基因工程已在煙草、小麥、玉米、番茄等很多植物中穩(wěn)定表達(dá)，且對(duì)相應(yīng)的病原菌具有一定程度的抗性[3]。因此轉(zhuǎn)RIP基因工程正發(fā)展成為防治植物病蟲害的新途徑[4]。本試驗(yàn)所采用的CcRIP II-2基因包含了RIP基因的這一特性，通過對(duì)寧陽(yáng)大棗進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)試驗(yàn)，獲得27個(gè)抗性單株，經(jīng)PCR檢測(cè)，初步確定CcRIP II-2基因已經(jīng)整合到寧陽(yáng)大棗基因組中。這些抗性單株的獲得，為寧陽(yáng)大棗抗棗瘋病品種選育和果樹抗性育種研究開辟了一條新途徑。

有研究證明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化效率受多個(gè)因子的影響，包括農(nóng)桿菌的株型、質(zhì)粒的構(gòu)建、外植體的再生頻率、篩選標(biāo)記的可靠性，以及轉(zhuǎn)化過程中外部環(huán)境的控制等，其中前幾個(gè)因子在轉(zhuǎn)化方案確定后不會(huì)有很大的改變，而轉(zhuǎn)化的外部環(huán)境可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的需要作出較大的調(diào)整，這些調(diào)整在提高轉(zhuǎn)化效率上往往收益顯著[5]。因此，我們把Ca2+作為轉(zhuǎn)化過程中的一個(gè)外部影響因素加以考慮。Ca2+信號(hào)通路是植物中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已確認(rèn)的主要途徑，它參與了多種生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)[6]。大量研究表明，Ca2+也參與了植物----微生物互作的信號(hào)傳遞[7]。我們推測(cè)在農(nóng)桿菌侵染過程中Ca2+也發(fā)揮了重要的作用。

通過試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)Ca2+在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化CcRIP II-2基因過程中對(duì)受體材料轉(zhuǎn)化效率確有明顯影響但對(duì)促進(jìn)轉(zhuǎn)化效率提高作用不明顯，未添加Ca2+的侵染液較添加了不同濃度Ca2+的獲得了較高的轉(zhuǎn)化率。盡管Ca2+對(duì)提高寧陽(yáng)大棗基因轉(zhuǎn)化效率促進(jìn)作用不明顯，但其對(duì)寧陽(yáng)大棗（Ningyang Jujube）受體材料成活率和新芽高度卻有顯著促進(jìn)作用，這說明，Ca2+作為迄今為止唯一被證實(shí)的植物細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)環(huán)境的反應(yīng)和適應(yīng)中起著十分重要的作用[8]。

另外，Ca2+濃度對(duì)新芽分化數(shù)也有影響，侵染液中不添加Ca2+時(shí)寧陽(yáng)大棗受體材料分化芽數(shù)比添加了Ca2+的要多，說明侵染液中的Ca2+對(duì)于受體材料芽組織的分化生長(zhǎng)促進(jìn)作用不明顯。

本試驗(yàn)中，在篩選培養(yǎng)基中添加不同濃度的卡那霉素，同時(shí)為了抑制農(nóng)桿菌的過度生長(zhǎng)對(duì)植物受體造成傷害，還添加了抑菌素，這些都對(duì)轉(zhuǎn)化受體材料具有一定毒害作用，也在一定程度上影響了植物材料的正常生長(zhǎng)。張和臣等認(rèn)為，植物對(duì)細(xì)胞外部的逆境信號(hào)需要細(xì)胞感受并跨越細(xì)胞膜才能把信息輸進(jìn)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達(dá)，產(chǎn)生各種生物反應(yīng)，引起細(xì)胞膜滲透壓的增加，進(jìn)而引起細(xì)胞壁間的機(jī)械脅迫以及膜的流動(dòng)性等。植物通過膜的變化誘發(fā)植物產(chǎn)生鈣信號(hào)并誘發(fā)產(chǎn)生由膜外到膜內(nèi)的信號(hào)傳遞過程[9]，因此，受體材料的狀態(tài)和生長(zhǎng)環(huán)境都對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響。

因本試驗(yàn)樣本較小，對(duì)Ca2+濃度的設(shè)計(jì)梯度有所限制，故Ca2+濃度水平對(duì)棗樹基因轉(zhuǎn)化的確切影響還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株的穩(wěn)定性表現(xiàn)也還需進(jìn)一步檢測(cè)。

4 結(jié)論

（1）Ca2+對(duì)寧陽(yáng)大棗基因轉(zhuǎn)化效率有顯著影響，不添加Ca2+可獲得較高的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)PCR檢測(cè)，本試驗(yàn)共獲得27個(gè)轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率為33.33%。由此看出，Ca2+對(duì)提高寧陽(yáng)大棗轉(zhuǎn)化香樟核糖體失活蛋白基因CcRIP II-2轉(zhuǎn)化效率促進(jìn)作用不明顯；

（2）Ca2+濃度對(duì)寧陽(yáng)大棗受體材料成活率和新芽高度有明顯影響，在侵染液濃度和侵染時(shí)間相同情況下，添加Ca2+范圍在0 mg/L～440 mg/L對(duì)轉(zhuǎn)化受體成活率影響相同，添加Ca2+范圍在440 mg/L～880 mg/L對(duì)轉(zhuǎn)化受體新芽高度影響相同；成活率受侵染液濃度和Ca2+濃度雙重影響，侵染液濃度是影響新芽高度的最重要因素；

（3）Ca2+濃度對(duì)新芽分化數(shù)有顯著影響，侵染液中不添加Ca2+時(shí)寧陽(yáng)大棗受體材料分化芽數(shù)最多；

（4）影響受體材料成活率和新芽高度最大的因素是侵染液濃度，影響分化芽數(shù)最大的因素是Ca2+濃度；（5）添加Ca2+的寧陽(yáng)大棗（Ningyang Jujube）抗MLO病毒基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)最佳組合為：效率最高的組合：1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+0 mg/LCa2+濃度；成活率最高的組合：1/2侵染液濃度+15 min侵染時(shí)間+0 mg/L Ca2+濃度；枯死率最高的組合：1/2侵染液濃度+20 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度；分化芽數(shù)最多，生長(zhǎng)量最大的組合：侵染原液+15 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度；新芽生長(zhǎng)最高的是組合7:1/3侵染液濃度+10 min侵染時(shí)間+440 mg/L Ca2+濃度。

[1]王祈楷,徐紹華,陳子文,等.棗瘋病的研究[J].植物病理學(xué)報(bào),1981,11(1):15-18

[2]程麗芬,毛靜琴,梁鳳玉,等.棗瘋病的發(fā)病規(guī)律及防治[J].山西林業(yè)科技,1995(3):36-37

[3]單麗波,賈旭.核糖體失活蛋白及其在植物抗真菌病基因工程中的應(yīng)用[J].生物工程進(jìn)展,2000,20(6):74-78

[4]李建國(guó).核糖體失活蛋白研究進(jìn)展[J].分子植物育種,2005,3(4):566-570

[5]鄭進(jìn),康薇,洪華珠.影響農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化效率因素的研究[J].黃石理工學(xué)院學(xué)報(bào),2008,24(5):30-33

[6]張君誠(chéng),孟玉環(huán),宋育紅,等.植物Ca2+-CaM信號(hào)系統(tǒng)及其調(diào)控研究進(jìn)展[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,22(4):55-58

[7]楊民和,王國(guó)紅.Ca2+對(duì)植物—微生物互作反應(yīng)的調(diào)控[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001(2):43-48

[8]簡(jiǎn)令成,王紅.Ca～(2+)在植物細(xì)胞對(duì)逆境反應(yīng)和適應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用[J].植物學(xué)通報(bào),2008,(3):255-267

[9]張和臣,尹偉倫,夏新莉,等.非生物逆境脅迫下植物鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制[J].植物學(xué)通報(bào),2007,24(1):114-122

Effect of Ca2+on CcRIP II-2 Gene Transformation of Ningyang Jujube

HUANG Yan-yan1,LUO Lei1,NIU Qing-lin2,1,LIU Feng2,WENG Man-li3, LIU Jing1,FENG Dian-qi1*
1.Taishan Institute of Forestry Science,Tai'an271000,China
2.Shandong Agricultural University,Tai'an271018,China
3.Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

In this study,the concentration effect of Ca2+on transformation ofRIPgene(Ribosome Inactivating Protein Gene) cloned fromCinnamomum camphoratoNingyang Jujube was investigated in detail with L9(34)orthogonal design,through the analysis of factors which affected the transformation.The results showed that the concentration of Ca2+had no crucial effect on transformation and the best combination was the bacterium solution with 0.4-0.6 OD value was double diluted,20-minutes infection and without Ca2+.27 transformation seedlings were obtained and the transformation rate was 33.33%.

Agrobacterium-mediated transformation;Cinnamomum camphoraL.Ribosome-inactivating protein(RIP); Jujube Witches Broom;Ca2+concentration

S722.3文獻(xiàn)標(biāo)示碼:A

1000-2324(2014)04-0481-08

2012-10-18

2013-03-12

抗棗瘋病植原體(MLO)基因轉(zhuǎn)化項(xiàng)目

黃艷艷(1978-),女,工程師,主要從事林果花卉生物技術(shù)研究.E-mail:Yanhuang0321@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:fengdianqi@163.com