父親精液HBV-DNA載量與HBV父嬰垂直傳播的相關(guān)性分析

陳順萍， 張榮蓮， 任坤海， 王梅穎

(1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院婦兒教研室，福建 福州 350101;2.福建省婦幼保健院婦產(chǎn)科，福建 福州 350001)

中國為乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高發(fā)區(qū)，2012年度中國法定傳染病疫情報告顯示發(fā)病數(shù)居首仍為病毒性肝炎，其中乙肝的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)最高［1］.垂直傳播是形成人群中慢性HBV感染和HBV儲存庫的主要途徑之一，HBV的代代相傳對健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展構(gòu)成威脅.有研究表明，HBV的垂直傳播的途徑不僅有母嬰傳播，而且存在父嬰傳播，且多數(shù)學(xué)者認(rèn)為父親乙型肝炎病毒血清脫氧核糖核酸(HBV-DNA)陽性是HBV父嬰垂直傳播的危險因素［2-5］，本研究小組前期研究工作亦顯示傳播的發(fā)生與血清HBV-DNA載量有關(guān)［6］.HBV父嬰垂直傳播指HBV通過生殖細(xì)胞即精子直接傳給子代.那么父親血清與其精液中HBV-DNA載量有何相關(guān)性，精子中HBV出現(xiàn)的規(guī)律和復(fù)制特點如何影響垂直傳播的發(fā)生尚未清楚.本研究檢測HB-sAg陽性父親血清和精液及其新生兒臍血作HBVDNA，分析HBsAg陽性父親精液HBV-DNA載量對HBV父嬰垂直傳播的影響，旨在為探求預(yù)防HBV父嬰垂直傳播的方法提供實驗依據(jù).

1 資料與方法

1.1 資料

(1)研究對象 2010年～2011年以乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物(hepatitis B virus markers，HBVM)及HBV-DNA為指標(biāo)于福建省婦幼保健院產(chǎn)科門診篩檢孕婦及其丈夫，將丈夫HBsAg陽性、孕婦HBsAg及HBV-DNA均為陰性的52個家庭作為研究對象.

研究家庭納入標(biāo)準(zhǔn):①知情同意;②丈夫:血清HBsAg(+);③孕婦:無乙肝病史，且從未接受抗乙肝病毒治療，于孕期、分娩時采集其血清，檢測HB-sAg和HBV-DNA均(-)，確定無HBV感染，排除乙肝母嬰傳播的可能性.

(2)分組標(biāo)準(zhǔn) 臍帶血 HBV-DNA＜1.0×103拷貝/mL為對照組，HBV-DNA≥1.0×103拷貝/mL為病例組.

(3)主要試劑及儀器 乙肝病毒標(biāo)志物(HBVM)檢測試劑盒由中山生物工程有限公司提供，血清HBV-DNA定量采用深圳匹基生物工程有限公司研制的熒光定量PCR試劑盒，精液HBV-DNA定量采用德國QIAGEN公司研制的熒光定量PCR試劑盒.Labsystems MK3型酶標(biāo)儀為芬蘭 Thermo Labsystems公司產(chǎn)品，Thermo洗板機(jī)、Light Cycler熒光PCR檢測儀產(chǎn)自瑞士Roche公司，可調(diào)多道移液器產(chǎn)自芬蘭Thermo Labsystems公司，-20℃電子溫控低溫冰箱為德國西門子公司產(chǎn)品，自動離心機(jī)產(chǎn)自德國Sigma公司，WS2-261-79型電子恒溫水浴箱產(chǎn)自上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠，ZDQ-Ⅲ型旋渦振蕩器產(chǎn)自長春博研科學(xué)儀器有限公司等儀器設(shè)備.

1.2 方法

(1)標(biāo)本收集 ①丈夫禁欲2～7 d后，同期采集肘靜脈血和手淫法采集精液，檢測血清HBVM和HBV-DNA與精液HBV-DNA.②新生兒出生時抽取臍靜脈血檢測HBV-DNA.

(2)HBVM采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測.

(3)精液標(biāo)本室溫解凍后，振蕩精液，使精子、精漿充分混勻.具體操作及結(jié)果判斷由PCR室專業(yè)人員嚴(yán)格參照試劑盒操作方法提取精液及血清HBV-DNA.

(4)HBV-DNA定量采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)法檢測 將標(biāo)本中已提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完整的探針帶有熒光發(fā)光基團(tuán)及熒光淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅，擴(kuò)增后，熒光發(fā)光基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分開，在激光照射下產(chǎn)生特定波長的熒光，實時熒光PCR儀實時檢測熒光信號，根據(jù)熒光信號與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系，擴(kuò)增儀軟件系統(tǒng)計算得到實時擴(kuò)增曲線.測定反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度計算初始模板的數(shù)量即拷貝數(shù).擴(kuò)增液中加入陰性、陽性質(zhì)控品與陽性定量參考品.

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析處理

統(tǒng)計軟件:SPSS 15.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件包.數(shù)據(jù)分析:χ2檢驗、Fisher精確概率檢驗、Spearman等級相關(guān)、Wilcoxon秩和檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本檢測結(jié)果

11例新生兒臍血HBV-DNA≥1.0×103copies/mL，臍帶血HBV-DNA陽性率為21.2%(11/52).

52位父親血HBVM:大三陽即HBsAg、HBeAg、HBcAb三項陽性18例(34H6%)、小三陽即HBsAg、HBeAb、HBcAb 三項陽性 31 例(59.6%)、HBsAg、HBcAb雙陽性有1例(1.9%)、單項HBsAg陽性者有 2例 (3.8%)，血清 HBV-DNA 陽性 44份(84.6%);血清HBV-DNA陽性父親的新生兒臍血檢測HBV-DNA陽性為25.0%(11/44);52份精液HBV-DNA陽性14份(26.9%)，精液HBV-DNA陽性父親的新生兒臍血檢測HBV-DNA陽性為64.3%(9/14).

2.2 均衡性檢驗

11例臍血HBV-DNA≥1.0×103拷貝/mL的新生兒為病例組，余41例為對照組.兩組孕母既往和本次孕產(chǎn)史即妊娠并發(fā)癥或合并癥、分娩并發(fā)癥等情況，新生兒的妊娠結(jié)局:孕周、性別、出生體質(zhì)量、身長、Apgar評分、出生缺陷、病理性黃疽及其他內(nèi)外科疾病等情況，均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明兩組在一般特征方面均衡可比.

2.3 父親精液HBV-DNA與其血清HBV-DNA載量水平間的相關(guān)性分析

將血清與精液HBV-DNA載量的對數(shù)值，經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示二者在載量等級間存在正相關(guān)關(guān)系，血清病毒載量越高，精液HBV-DNA陽性率越高(P＜0.01);經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗，精液載量與血清載量間關(guān)系顯著，精液HBV-DNA載量低于其血清載量(P＜0.01，表1).

表1 父親血清與其精液HBV-DNA載量的關(guān)系Table1 Correlation between semen and serum of HBVDNA load levels

2.4 父親精液HBV-DNA與HBV父嬰垂直傳播的關(guān)系

病例組父親精液HBV-DNA陽性者占81.8%，而對照組僅占12.2%，提示精液HBV-DNA陽性父親其新生兒發(fā)生HBV父嬰垂直傳播的危險性高于精液 HBV-DNA陰性父親的新生兒(P＜0.01，表2).

表2 父親精液HBV-DNA與HBV父嬰垂直傳播的關(guān)系(%)Table2 Relationship between paternal semen HBV-DNA and vertical transmission of HBV from father to infant

2.5 為了解父親精液及其血清HBV-DNA載量在新生兒感染HBV關(guān)系，作受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析，比較二者在預(yù)測HBV垂直傳播發(fā)生風(fēng)險的影響，精液HBV-DNA的曲線下面積為0.906，P ＜0.001，血清 HBV-DNA 的曲線下面積為0.598，P=0.324，提示精液 HBV-DNA 在預(yù)測 HBV垂直傳播發(fā)生風(fēng)險的效果優(yōu)于血清HBV-DNA(圖1).

圖1 精液(分泌物)和血液HBV-DNA載量預(yù)測HBV垂直傳播發(fā)生風(fēng)險的ROC曲線Fig.1 The ROC curve of semen HBV-DNA load and serum HBV-DNA load that showed the prediction in the occurrence of vertical transmission

3 討論

本研究結(jié)果顯示隨著HBV感染者血清HBVDNA載量等級的上升，精液HBV-DNA陽性檢出率也呈上升趨勢，說明精液的傳染性與其血清感染狀態(tài)的密切相關(guān)，與研究報道［7-9］相似.可能與精、血兩體液系統(tǒng)在HBV入侵、感染、復(fù)制過程中存在一定關(guān)聯(lián)，當(dāng)血清病毒載量越高，HBV越易進(jìn)入男性生殖系統(tǒng)，精液HBV-DNA陽性檢出率越高.實驗中精液HBV-DNA陽性檢出率為26.9%(14/52)，與他人的報道差異較大，可能與精子攜帶HBV不是持續(xù)的而是間歇性有關(guān)［10］.

Hadchouel等［11］首次發(fā)現(xiàn)急性乙肝患者精子內(nèi)整合有HBV-DNA，提出HBV經(jīng)精子種系傳播的可能性.從精液、各級生精上皮細(xì)胞、成熟精子內(nèi)HBV-DNA 的檢出，說明精液具有傳染性［7，12-13］.另有研究證實男性乙肝HBV攜帶者精子中的HBVDNA可以整合入宿主生殖細(xì)胞基因，在早期胚胎細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)，通過改變基因組成從而引起HBV的廣泛世代相傳［14-15］.本結(jié)果提示父親精液 HBVDNA陽性是新生兒發(fā)生HBV父嬰垂直傳播的危險因素.ROC曲線分析提示雖然父親精液HBV-DNA載量低于其血清載量，但精液 HBV-DNA在預(yù)測HBV垂直傳播發(fā)生風(fēng)險的效果優(yōu)于血清HBVDNA，父親精液HBV-DNA陽性比血清HBV-DNA陽性更容易引起HBV父嬰垂直傳播的發(fā)生.

精液HBV-DNA載量是發(fā)生HBV父嬰垂直傳播的危險因素，由于直接的父嬰傳播發(fā)生在生殖細(xì)胞階段，可考慮通過受精前精子篩查［16］或精子洗滌技術(shù)后［17］行輔助生育技術(shù)(assisted reproductive techniques，ART)阻斷HBV父嬰垂直傳播.但ART作為預(yù)防父嬰垂直傳播的措施，臨床實施有一定的難度，而且精子洗滌也不能完全消除HBV經(jīng)精液傳播的危險性，可能與HBV-DNA整合入精子有關(guān)［7］.本研究結(jié)果顯示父親精液及其血HBV-DNA載量等級間存在正相關(guān)關(guān)系，因而可考慮通過降低血清HBV-DNA載量以降低精液HBV-DNA載量，盡管目前使HBV血清標(biāo)志物全面轉(zhuǎn)陰仍十分困難，但隨著抗病毒藥物的研究進(jìn)展，使丈夫通過降低血清HBV-DNA載量，從而降低精液HBV-DNA載量成為可能.有資料也證實父親的血清HBV-DNA載量越低，HBV 父嬰垂直傳播越容易阻斷［5，18］.因此建議對擬生育的男性乙肝患者尤其對血清HBV-DNA載量水平高的攜帶者，應(yīng)該在孕前進(jìn)行積極且科學(xué)的抗病毒治療以減少HBV父嬰垂直傳播的發(fā)生.

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