西瓜翠衣抑制酪氨酸酶、抗自由基作用及其成分的含量測定

王園園，龍嫻，鐘大妹，葛月賓，汪振雄

（中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430074）

西瓜翠衣抑制酪氨酸酶、抗自由基作用及其成分的含量測定

王園園，龍嫻，鐘大妹，葛月賓*，汪振雄

（中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430074）

評價西瓜翠衣的抑制酪氨酸酶和抗自由基作用，并測定其成分的含量。采用酪氨酸酶活性抑制率和DPPH自由基清除率活性測定方法，分析西瓜翠衣提取物的多糖、總氨基酸和VC含量。西瓜翠衣用95%乙醇作為溶劑，提取物活性較高，其多糖、總氨基酸和VC含量分別為50.10、2.59、26.75 mg/g；提取物經(jīng)大孔樹脂純化后，水洗脫部位的活性較好且富集量最大；進一步透析水洗脫部位，其透析液的酪氨酸酶活性抑制率達到58.12%，與0.25 mmol/L曲酸作用相當，DPPH自由基清除率達到56.82%。通過此研究確定了西瓜翠衣的抑制酪氨酸酶和抗自由基功效及其成分的含量。

西瓜翠衣；酪氨酸酶抑制率；DPPH自由基清除率；含量測定

西瓜翠衣，即西瓜皮，為葫蘆科植物西瓜（Citrullus lanatus）的果皮，又叫西瓜青、西瓜翠等。西瓜翠衣中除含有果膠（約2%）外，還含豐富的營養(yǎng)成分，如多種氨基酸、微量元素、糖類以及豐富的維生素等。中醫(yī)認為，西瓜翠衣性寒，味甘，有清熱解暑、除煩止渴及利尿作用，可以治療多種熱盛津傷的疾病，古人稱其為“天然白虎湯”[1-2]。

近年來，植物萃取物被廣泛應(yīng)用于食物療養(yǎng)、保健品、護膚品中，其天然溫和、刺激性小、效果顯著等優(yōu)點越來越受到人們的關(guān)注。在日常生活中，西瓜翠衣也常作為自制食品和護膚品，可以促進人體新陳代謝、消暑除煩、美白滋潤皮膚、增加面部皮膚光澤、淡化痘印等[3-5]。目前，對于西瓜翠衣已有的文獻報道主要包括果膠的提取、飲料的制作等食品行業(yè)、栽培技術(shù)等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[6-8]，而其抑制酪氨酸酶和抗自由基等活性作用及其成分含量測定的實驗研究尚未見報道。因此，本文旨在采取酪氨酸酶抑制和自由基清除兩種活性測定技術(shù)，追蹤開展西瓜翠衣的提取純化工作，測定其成分的含量，為西瓜翠衣的應(yīng)用開發(fā)提供研究依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

西瓜翠衣（市面所售西瓜，用刀將表皮青色含有蠟質(zhì)的青色皮和紅色肉質(zhì)除去后所得的果皮部分）；HP20型大孔樹脂：日本三菱化學(xué)公司；35kM透析袋：上海源葉生物技術(shù)有限公司；蘑菇酪氨酸酶：Worthington Biochemical Co.；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Fluka；左旋多巴（L-DOPA）、曲酸Aladdin：上海晶純生化科技股份有限公司；VC：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

CP214電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；SB-800D型超聲波振蕩儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司。

2 方法

2.1 西瓜翠衣樣品的制備

新鮮西瓜翠衣切制成片，稱取重量，按1∶5比例（質(zhì)量體積比）加入提取溶劑；用組織搗碎機攪拌2 min，搗碎成勻漿狀；取勻漿液進行超聲萃取（500 W）30 min，過濾，濾渣再次加入同上比例溶劑進行超聲、過濾，反復(fù)操作3次；合并濾液，對濾液進行減壓濃縮干燥，即得西瓜翠衣提取物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HP20大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后，西瓜翠衣提取物經(jīng)少量乙醇溶解，拌樣上柱，用乙醇-水進行不同濃度梯度洗脫，洗脫梯度為超純水、10%、30%、50%、70%、90%乙醇，分段收集洗脫液，減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到膏狀濃縮液，4℃保存?zhèn)溆?。取超純水洗脫濃縮液置于透析袋中，純水透析。提取純化流程見圖1所示。

2.2 酪氨酸酶活性的測定

采用多巴氧化法測定樣品對酪氨酸酶活性的影響作用[9-11]。反應(yīng)體系見表1。

取西瓜翠衣樣品用1/15 mol/L PBS（pH6.8）溶解稀釋液（相當于新鮮西瓜翠衣原材料2 g/mL）1 mL，加入酪氨酸酶溶液（50 U/mL）1 mL混合均勻，32℃孵育10 min，加入0.15%L-DOPA1 mL，32℃繼續(xù)孵育10 min，立即于分光光度計475 nm處測定吸光度值A(chǔ)。陽性對照為0.25 mmol/L曲酸溶液。西瓜翠衣提取物的對酪氨酸酶活性的抑制率（I）計算公式如下：I=[1-（C-D）/（AB）]×100%。

圖1 西瓜翠衣提取純化的流程圖Fig.1 The extracting and purifying process of watermelon peel

表1 酪氨酸酶活性測定的反應(yīng)液組成Table 1 The measuring system of tyrosinase activity

2.3 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定[12]反應(yīng)體系見表2。

表2 DPPH自由基清除率測定的反應(yīng)液組成Table 2 The measuring system of DPPH radical scavenging rate

取西瓜翠衣樣品用甲醇溶解稀釋液（相當于新鮮西瓜翠衣原材料2 g/mL）0.8 mL，加入32 μg/mL DPPH溶液3.2 mL混合均勻，置于暗處靜置30min，立即于分光光度計517 nm處測定吸光度值A(chǔ)。陽性對照為維生素C溶液。西瓜翠衣提取物的DPPH自由基清除率（Y）的計算公式如下：Y=[1-B/A]×100%。

2.4 硫酸-苯酚法測定多糖的含量[13]

精密量取待測液2 mL于試管中，加入4%重蒸苯酚1 mL，搖勻，緩慢加入濃硫酸5 mL，40℃水浴加熱15 min，冰水浴5 min，于490 nm測定吸光度A值，重復(fù)測定3份樣品，計算平均含量。取葡萄糖對照品溶液（1 mg/mL）稀釋成不同濃度，同法測定吸光度A值，繪制標準曲線。

2.5 茚三酮比色法測定總氨基酸的含量[14]

精密量取待測液2 mL于50 mL量瓶中，加入2%茚三酮1 mL和磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）2 mL，搖勻，90℃下水浴加熱15 min，冷卻至室溫，用蒸餾水定容，于570 nm下測定吸光度A值，重復(fù)測定3份樣品，計算平均含量。取亮氨酸對照品溶液（0.1 mg/mL）稀釋成不同濃度，同法測定吸光度A值，繪制標準曲線。

2.6 紫外分光光度法測定VC的含量[15]

精密量取待測液2 mL于50 mL量瓶中，加入5× 10-3mol/L氯化銅溶液3 mL，加入少量蒸餾水，在70℃下水浴加熱5 min，用蒸餾水定容，冷卻至室溫，于246 nm下測定吸光度A值，重復(fù)測定3份樣品，計算平均含量。取VC對照品溶液（400 μg/mL）稀釋成不同濃度，同法測定吸光度A值，繪制標準曲線。

3 結(jié)果

3.1 不同提取溶劑對西瓜翠衣活性的影響

考察不同溶劑水、70%乙醇和95%乙醇提取西瓜翠衣，經(jīng)減壓濃縮干燥后對活性的影響。結(jié)果見表3。

表3 不同提取溶劑對西瓜翠衣活性的影響Table 3 Measurement of activities in watermelon peel extracts by different solvents

結(jié)果表明，相比于水和70%乙醇，95%乙醇提取西瓜翠衣的酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率活性最高。

3.2 大孔樹脂純化對西瓜翠衣活性的影響

為了進一步純化富集西瓜翠衣的活性成分，采用大孔樹脂對西瓜翠衣95%醇提物進行不同濃度的乙醇-水（0、10%、30%、50%、70%、90%乙醇）梯度洗脫，測定其活性，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，在酪氨酸酶抑制率活性方面，70%和90%乙醇洗脫物最高，純水洗脫物次之；在DPPH自由基清除率活性方面，10%乙醇洗脫物最高，純水和70%乙醇洗脫物次之。此外，通過不同濃度梯度乙醇洗脫，純水洗脫部位收得的固形物量最大，結(jié)合活性和洗脫物質(zhì)量結(jié)果，選擇純水洗脫物繼續(xù)下一步的透析純化過程。

表4 大孔樹脂梯度洗脫西瓜翠衣純化物的活性測定Table 4 Measurement of activities in watermelon peel extracts by macroporous resin purification

3.3 透析純化對西瓜翠衣活性的影響

根據(jù)3.2實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)西瓜翠衣95%醇提物經(jīng)大孔樹脂純水洗脫后，具有較好的抑制酪氨酸酶和DPPH自由基清除活性，并且該洗脫部位獲得的量最大。在濃縮過程中，水洗脫物呈現(xiàn)一定的粘性，因此采用透析法，對該部位洗脫物進一步純化，對透析袋外液濃縮物進行活性測定，結(jié)果見表5。

表5 透析純化西瓜翠衣提取物的活性測定Table 5 Measurement of activities in watermelon peel extracts by dialysis

結(jié)果表明，水洗脫物經(jīng)透析后，DPPH自由基清除率活性有明顯提高，而對酪氨酸酶活性抑制率的影響不大。

3.4 西瓜翠衣提取物成分的含量測定

在測定樣品前，繪制了葡萄糖、亮氨酸和VC的標準曲線分別為C=13.500A+0.116 3（r=0.999 5），C= 135.77A+0.026 6（r=0.999 5）和C=0.002 0A+0.015（r= 0.999 7）。對西瓜翠衣95%乙醇提取物、大孔樹脂洗脫物、透析純化物進行成分的含量測定，結(jié)果見表6。

表6 西瓜翠衣提取物成分的含量測定Table 6 Determination of contents in watermelon peel extracts

結(jié)果表明，純水洗脫物的三類成分含量均高于10%乙醇洗脫部位；透析對多糖成分起到一定的純化富集作用。

4 討論

通過測定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，考察了3種提取溶劑、大孔樹脂和透析分離純化對西瓜翠衣提取物活性的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西瓜翠衣經(jīng)95%乙醇超聲波萃取后，酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率均高于其它溶劑。采用大孔樹脂純化，發(fā)現(xiàn)不同濃度乙醇-水梯度洗脫物的酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率活性發(fā)生了變化，表明大孔樹脂對西瓜翠衣提取物的活性部位進行了較好的純化，本文對獲得的量最大并具有較好活性的純水洗脫部位開展了透析，進一步純化富集了活性成分。

通過本次實驗，測定了西瓜翠衣的酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率活性，其美白抗衰老的作用得到確定，并且測定了其成分多糖、氨基酸和VC的含量，為西瓜翠衣在食品、保健品、日用產(chǎn)品等的應(yīng)用提供了研究依據(jù)。在此結(jié)果上，將繼續(xù)開展西瓜翠衣提取純化的工藝條件優(yōu)化和質(zhì)量標準研究，為西瓜翠衣的產(chǎn)品開發(fā)提供技術(shù)支持和質(zhì)量保證。

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Anti-tyrosinase and Antioxidation Activities and Contents Determining from Watermelon Peel

WANG Yuan-yuan，LONG Xian，ZHONG Da-mei，GE Yue-bin*，WANG Zhen-xiong
（College of Pharmacy，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，Hubei，China）

To determine the contents and evaluate the anti-tyrosinase and antioxidation activities of extract from watermelon peel.Watermelon peel was extracted by different extraction solvents，macroporous resin purification as well as dialysis bag.And the contents of polysaccharides，amino acids，vitamine C were measured.In order to evaluate and compare the anti-tyrosinase and antioxidation activities of watermelon peel extracts，the tyrosinase activity inhibition rate and DPPH free radical scavenging rate were measured in vitro.It showed that selecting 95%ethanol as the extraction solvent，the anti-tyrosinase and anti-oxidative actions of extract were better than othersolvents，inwhichthecontentsofpolysaccharides，aminoacids，vitamineCwere50.10，2.59and26.75mg/g，respectively.After purification by macroporous resin，water-eluting location obtained much amount and showed higher activities.The elution was further dialyzed and the tyrosinase activity inhibition rate and DPPH free radical scavenging rate of the concentrate in the outside of dialysis bag were 58.12%and56.82%，respectively. Through the process，the anti-tyrosinase and antioxidation activities of watermelon peel was clear and the contents of active ingredients were determined.

watermelon peel；tyrosinase activity inhibiting rate；DPPH radical scavenging rate；contents determining

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.018

2014-07-10

國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃（GCX13108）;中南民族大學(xué)十二五“民族藥學(xué)”國家級實驗教學(xué)示范中心和中南民族大學(xué)藥物制劑品牌專業(yè)項目資助

王園園（1990—），女（漢），本科，研究方向：活性產(chǎn)物。*通信作者：葛月賓，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。