琥珀?；男詫γ卓返鞍坠δ苄再|的影響

翟愛華，馬國飛，2，李丹

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319；2.中共友誼縣委組織部，黑龍江雙鴨山155800）

琥珀酰化改性對米糠蛋白功能性質的影響

翟愛華1，馬國飛1，2，李丹1

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319；2.中共友誼縣委組織部，黑龍江雙鴨山155800）

為了改變米糠蛋白的功能性質，擴大米糠蛋白在食品工業(yè)的應用范圍，利用琥珀酸酐對米糠蛋白進行?；男蕴幚怼Ｍㄟ^單因素反應，確定了琥珀酸酐酰化改性米糠蛋白的最適反應條件為：米糠蛋白濃度為10%，反應溫度為35℃，琥珀酸酐/蛋白質用量為15%。在最適反應條件下，分別反應40min、80min，制得酰化度分別為46.8%、69.2%的琥珀酰化米糠蛋白。評價了上述兩種琥珀酰化米糠蛋白制品的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質，結果表明，琥珀?；男詫γ卓返鞍椎娜芙庑?、乳化穩(wěn)定性以及起泡性均有一定改善，而?；卓返鞍椎娜榛钚浴⑴菽€(wěn)定性隨著?；潭鹊奶岣哂兴陆怠?/p>

琥珀?；?；米糠蛋白；功能性質

米糠約占稻谷重量的5%～5.5%，是稻谷碾米過程中產(chǎn)生的重要副產(chǎn)品。米糠中含有豐富的營養(yǎng)物質，其中脫脂米糠中含有高達18%的蛋白質。然而，目前大部分米糠仍被用作動物飼料，造成嚴重的資源浪費，因此，從米糠中提取蛋白質，增加米糠的附加值具有重要的現(xiàn)實意義。米糠蛋白被公認為優(yōu)質植物蛋白質，其必需氨基酸組成均衡合理，接近FAO/WHO推薦模式；其中米糠蛋白含有較高的賴氨酸，是其他植物蛋白無法比擬的，米糠蛋白的生物效價很高，消化率可達90%以上；并且米糠蛋白屬于低過敏性蛋白，是唯一一種可以免于過敏試驗的谷物蛋白。因此，米糠蛋白非常適合作為嬰幼兒和特殊人群營養(yǎng)食品。

雖然，米糠蛋白的營養(yǎng)特性已被廣泛認可，但目前，米糠濃縮蛋白和分離蛋白并沒有商品化，主要原因就是米糠蛋白的溶解性差，因為：①米糠蛋白是一種混合蛋白，其中含有：質量分數(shù)為37%的清蛋白、質量分數(shù)為36%的球蛋白、質量分數(shù)為22%的谷蛋白和質量分數(shù)5%的醇溶谷蛋白，超過三分之一的蛋白不能在水、鹽、乙醇、乙酸中溶解（其對米糠蛋白的抽提率分別為34%，15%，6%，11%）；②米糠蛋白聚合度很高，分子間通過二硫鍵交聯(lián)使蛋白溶解性變差；③米糠中植酸和纖維含量高（其質量分數(shù)分別為1.7%和12%），它們與蛋白質結合，使蛋白不易與其它成分分離[1-2]。

如何提高米糠蛋白的溶出得率成為國內外的研究熱點。管驍?shù)萚3]研究了米糠蛋白制備過程中存在的提取率低、產(chǎn)品顏色深等問題。張敏等[4]按照Osbron法提取米糠中的清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白，并對4種蛋白進行功能性質評價。鄭耀華等[5]以新鮮米糠為原料，采用堿法、酸法、鹽法分步對米糠蛋白進行復合提取，并確定了復合法提取新鮮米糠蛋白的最佳方法。?；男詫儆诤啽阋仔械母男苑椒ǎ谄渌鞍踪|改性中應用較廣。張紅印等[6]采用乙酸酐及琥珀酸酐對小麥面筋蛋白進行?；男?，比較了?；男詫π←溍娼畹鞍坠δ苄缘母纳菩Ч?。本研究選用琥珀酸酐作為?；噭γ卓返鞍走M行?；男?，通過對?；卓返鞍椎墓δ苄再|的測定，以期獲得具有良好功能性質的米糠蛋白制品，以便擴大米糠蛋白在食品加工業(yè)的應用范圍，為食品生產(chǎn)提供良好的加工基料。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料

米糠蛋白：北大荒希杰食品科技公司；琥珀酸酐：天津市大茂化學試劑廠；牛血清白蛋白：北京索萊寶公司；茚三酮：天津市大茂化學試劑廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要設備

T6新世紀紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；AR2140電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；PH-3C pH計：上海安亭雷磁有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海森信試驗儀器有限公司；TDS-050冷凍干燥試驗機：撫順黎明機械廠；FKA型組織搗碎機：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 米糠蛋白琥珀?；瘲l件優(yōu)化

1.2.1.1 底物質量分數(shù)對?；潭鹊挠绊?/p>

將米糠蛋白分別配制成3%、6%、8%、10%、15% 5個濃度梯度的懸浮液，并用0.2 mol/L的NaOH溶液將蛋白溶液pH調至8.0～8.5。稱取一定量的琥珀酸酐，向蛋白溶液中逐漸加入琥珀酸酐，加入量為米糠蛋白的10%，反應溫度固定為25℃，進行琥珀?；磻?，反應時間為1 h。反應過程中，用磁力攪拌器進行攪拌，使米糠蛋白與琥珀酸酐充分反應，并加入一定量的NaOH溶液，保證反應過程中反應體系的pH在8.0～8.5之間。按照1.2.2采用茚三酮法測定?；潭?。

1.2.1.2 反應溫度對?；潭鹊挠绊?/p>

準確配制濃度為5%的米糠蛋白懸浮液，并用0.2 mol/L的NaOH溶液將蛋白溶液pH調至8.0～8.5。稱取一定量的琥珀酸酐，向蛋白溶液中逐漸加入琥珀酸酐，加入量為米糠蛋白的10%。分別在25、30、35、40℃4個溫度梯度下反應1 h。反應過程中，用磁力攪拌器進行攪拌，使米糠蛋白與琥珀酸酐充分反應，并加入一定量的NaOH溶液，保證反應過程中反應體系的pH在8.0～8.5之間。按照1.2.2采用茚三酮法測定?；潭取?/p>

1.2.1.3 琥珀酸酐的用量對?；潭鹊挠绊?/p>

準確配制濃度為5%的米糠蛋白懸浮液，并用0.2 mol/L的NaOH溶液將蛋白溶液pH調至8.0～8.5。稱取一定量的琥珀酸酐。在25℃下，向反應體系逐漸加入琥珀酸酐，加入量分別為3%、5%、10%、15%、20% 5個用量梯度進行琥珀酰化反應1 h。反應過程中，用磁力攪拌器進行攪拌，使米糠蛋白與琥珀酸酐充分反應，并適當加入一定量的NaOH溶液，保證反應過程中反應體系的pH在8.0～8.5之間。按照1.2.2采用茚三酮法測定?；潭取?/p>

1.2.2 相關分析

1.2.2.1 蛋白質?；鹊臏y定—茚三酮法[7-8]

米糠蛋白溶液經(jīng)?；磻?，于3 000 r/min離心15 min，取上清液2.0 mL稀釋至25 mL，再取2 mL～2.5 mL米糠蛋白溶液于25 mL比色管，補加蒸餾水至4 mL，另加pH 8.0的磷酸鹽緩沖液及茚三酮溶液各1 mL，混合均勻后水浴加熱15 min，處理后迅速冷卻至室溫并加水定容至25 mL，靜置15 min后，以蒸餾水為空白，測定其在570 nm處的吸光值。吸光度表示游離氨基酸與茚三酮試劑的反應程度，吸光度越大表示米糠蛋白的?；潭仍降汀?/p>

?；潭鹊墓綖椋?/p>

?；潭龋?）=（米糠蛋白的吸光值-酰化米糠蛋白的吸光值）/米糠蛋白的吸光值×100%

1.2.2.2 溶解性

配制濃度為1%的米糠蛋白（?；卓返鞍祝┤芤海胶?0 min，3 000 r/min離心30 min，取1 mL上清液于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，劇烈震蕩10 min后，放置30 min，于540 nm處進行比色。配置10 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA），分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，用蒸餾水補足到1 mL，加4 mL雙縮脲試劑劇烈震蕩10 min后放置30 min，于540 nm處進行比色，以吸光度值為橫坐標，BSA濃度為縱坐標，繪制標準曲線。待測蛋白吸光度值代入標準曲線，可求出待測蛋白的濃度。以pH為橫坐標，NSI（%）為縱坐標繪圖，分析不同pH對米糠蛋白以及乙?；卓返鞍祝ㄧ牾；卓返鞍祝┤芙庑缘挠绊憽?/p>

雙縮脲試劑的配置[7]：將3 g酒石酸鈉和0.75 g硫酸銅溶于250mL蒸餾水。攪拌下徐徐加入150mL10% NaOH，最后定容至500 mL。

1.2.2.3 乳化性質

配制濃度為0.01%、0.02%、0.03%和0.04%的?；卓返鞍兹芤?。取150 mL蛋白溶液與50 mL大豆油混合，12 000 r/min均質1 min，靜置，在0 min和10 min時從容器底部取50 μL乳狀液于試管中，加5 mL 0.1%的SDS，充分混勻，于500 nm處測定吸光度值（以0.1%的SDS調整儀器零點）。同樣處理、測定琥珀酰化米糠蛋白溶液。乳化活性指數(shù)（EAI）及乳化穩(wěn)定性（ESI）的計算方法如下[9]：

式中：EAI為乳化活性指數(shù)，（m2/g）；T為2.303；A0為零時刻的吸光度值；C為蛋白質濃度，（g/mL）；φ為溶液中油的體積分數(shù)；ESI為乳化穩(wěn)定性；A10為靜置10 min后的吸光度值。

1.2.2.4 起泡性質

準確稱取2 g米糠蛋白（?；卓返鞍祝?，加入100mL水，置于裝料杯中，在高速組織搗碎機中攪打1 min，迅速倒入500 mL量筒中，記錄泡沫體積a；靜置10 min后，再次測量泡沫體積b。起泡性與泡沫穩(wěn)定性計算公式如下[10]：

1.3 統(tǒng)計分析

本研究中所有指標的數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差表示。采用Excel（2003）和Duncan's多重比較法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P＜0.05認為差異顯著，P＜0.01認為差異極顯著。用Excel（2003）軟件繪制圖示。

2 結果與討論

2.1 琥珀?；男詶l件的確定

2.1.1 底物質量分數(shù)對?；潭鹊挠绊?/p>

在琥珀酸酐/蛋白質添加量為10%、反應溫度為25℃的條件下，考查米糠蛋白的底物濃度對琥珀酰化?；鹊挠绊懀Y果如圖1。

圖1 底物濃度對米糠蛋白?；鹊挠绊懀╪=3）Fig.1 The effect of substrate concentration on the degree of acylation of rice bran protein（n=3）

琥珀酸酐呈粉末狀，不易溶于水，對于米糠蛋白的酰化改性的反應速率相對慢些。從圖1中可以看出，在相同反應時間內，?；入S著底物濃度的增加而逐漸增加，當米糠蛋白的濃度達到10%左右時，?；葹?7.8%，達到最大值。當米糠蛋白的濃度繼續(xù)增加，?；瘸尸F(xiàn)下降趨勢。而且觀察反應現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，當?shù)孜餄舛仍?0%以上時，琥珀?；男赃^程中，蛋白質發(fā)生聚集沉淀現(xiàn)象。原因可能是過多的琥珀酸酐粉末加入到反應體系中，導致蛋白分子外面包裹的水化膜被去除，進而導致蛋白質分子發(fā)生聚集的現(xiàn)象，致使酰化反應無法進行下去，因此，當?shù)孜餄舛却笥?0%時，?；瘸手饾u下降的趨勢。因此，將底物濃度10%確定為該反應體系的最適反應濃度。

2.1.2 反應溫度對酰化程度的影響

反應溫度對米糠蛋白的琥珀?；灿幸欢ǖ挠绊憽Ｔ诿卓返鞍诐舛葹?%、琥珀酸酐/蛋白質添加量為10%的條件下，考查反應溫度對?；鹊挠绊?，結果如圖2所示。

圖2 反應溫度對米糠蛋白酰化度的影響（n=3）Fig.2 The effect of reaction temperature on the degree of acylation of rice bran protein（n=3）

從圖2中可以看出，隨著反應溫度的增加，琥珀酰化對米糠蛋白的改性程度逐漸增加，?；戎饾u提高，當反應溫度為35℃時，?；冗_到44.6%。而當反應溫度繼續(xù)上升，發(fā)現(xiàn)?；瘸氏陆第厔?。這可能是由于，反應溫度的升高，導致粉末狀的琥珀酸酐加速了使米糠蛋白分子沉淀的現(xiàn)象，從而使?；冉档?。因此，在此反應體系中，確定35℃為最佳反應溫度。

2.1.3 琥珀酸酐的用量對酰化程度的影響

當米糠蛋白濃度為5%、反應溫度為25℃時，考查琥珀酸酐的用量對?；潭鹊挠绊憽Ｆ浞磻Y果如圖3所示。

圖3 琥珀酸酐用量對米糠蛋白酰化度的影響（n=3）Fig.3 The effect of concentration of succinic anhydride on thedegree of acylation of rice bran protein（n=3）

通過圖3中所示的結果，可以分析出，琥珀?；某潭入S琥珀酸酐添加量的增加而增加。當琥珀酸酐添加量為5%時，?；葹?9.9%，當琥珀酸酐添加量達到15%時，?；葹?4.6%。體系中的琥珀酸酐濃度的增加，琥珀酸酐分子與米糠蛋白分子的碰撞幾率變大，反應速率增加，引起了米糠蛋白琥珀?；潭仍黾樱虼缩；扔兴岣撸@一現(xiàn)象符合化學反應規(guī)律。但從結果中不難發(fā)現(xiàn)，琥珀酸酐的添加量由5%增加至15%時，?；鹊脑黾臃炔淮?，而當琥珀酸酐的添加量繼續(xù)增加，當添加量增加到20%時，?；瘸氏陆第厔?。原因可能是琥珀酸酐添加量的增大，溶于水中的琥珀酸酐濃度也相應增加，結果導致米糠蛋白的變性，最終阻礙了?；磻倪M行。因此，綜合考慮，本實驗中，將琥珀酸酐的最適添加量確定為15%。

在上述最適反應條件下進行?；磻?，反應分別進行40、80 min制備琥珀?；卓返鞍?、琥珀?；卓返鞍?制品備用，兩種?；鞍字破返孽；确謩e為46.8%、69.2%。

2.2 酰化米糠蛋白功能性質的測定

2.2.1 溶解性

2.2.1.1 溶解性標準曲線

根據(jù)1.2.2.2的方法測定，以牛血清白蛋白質量為橫坐標，吸光值A540為縱坐標繪制標準曲線。如圖4

吸光值（y）和牛血清白蛋白質量（x）的直線方程為：y=2.538x+0.039 6，R2=0.994 8，線性關系良好，可以用于蛋白質含量的計算。

2.2.1.2 琥珀酰化米糠蛋白的溶解性

米糠蛋白與兩種琥珀?；卓返鞍祝趐H3～10條件下的氮溶解指數(shù)（NSI）見圖5所示。

圖4 牛血清白蛋白溶解性標準曲線Fig.4 The standard curve of solubility of bovine serum albumin

圖5 不同pH條件下米糠蛋白及琥珀?；卓返鞍兹芙庑裕╪=3）Fig.5 Solubiligy of rice bran protein and succinic anhydrided rice bran protein products at different pH（n=3）

從圖5中，可以明顯得出結果，在大于等電點的pH范圍內，琥珀?；卓返鞍椎娜芙庑愿哂诿卓返鞍椎娜芙庑?，并且琥珀?；卓返鞍椎娜芙庑噪S著酰化度的增大而顯著提高。米糠蛋白與琥珀酰化米糠蛋白溶解性的最低點，即等電點，稍有不同。從圖中明顯看出，琥珀酰化米糠蛋白的等電點略向pH＜5方向，即向酸性方向移動，大約在pH=4附近，并且在pH＜pI范圍內，琥珀?；卓返鞍椎娜芙舛嚷缘陀诿卓返鞍椎娜芙舛?。

2.2.2 乳化性質

對琥珀酰化米糠蛋白的乳化活性指數(shù)及乳化穩(wěn)定性也進行了相關評價，結果如圖6、圖7所示。

由圖6可知，針對米糠蛋白和琥珀?；卓返鞍字破返乃膫€蛋白質濃度進行研究。與相同濃度的米糠蛋白相比，兩種琥珀?；卓返鞍兹闋钜旱娜榛钚灾笖?shù)均略有降低，琥珀?；卓返鞍?的乳化活性指數(shù)為45.1 m2/g～11.1 m2/g蛋白，琥珀?；卓返鞍?的乳化活性指數(shù)為42.7 m2/g～10.7 m2/g蛋白，比米糠蛋白的乳化活性指數(shù)51.3 m2/g～24.8 m2/g蛋白略低。

圖6 米糠蛋白與琥珀酰化米糠蛋白的乳化活性指數(shù)（n=3，P＜0.01）Fig.6 Emulsifying activity index of rice bran protein and succinic anhydrided rice bran protein products（n=3，P＜0.01）

圖7 米糠蛋白與琥珀?；卓返鞍椎娜榛€(wěn)定性（n=3，P＜0.01）Fig.7 Emulsifying stability index of rice bran protein and succinic anhydrided rice bran protein products（n=3，P＜0.01）

從圖7中可以看出，兩種琥珀?；卓返鞍字破返娜榛€(wěn)定性都比相同濃度下得米糠蛋白的乳化穩(wěn)定性高，尤其是在高濃度下，琥珀?；卓返鞍纵^米糠蛋白而言具有非常高的乳化穩(wěn)定性。當?shù)鞍踪|濃度為0.03%時（w/v），琥珀?；卓返鞍?和琥珀?；卓返鞍?的乳化穩(wěn)定性接近105%，而米糠蛋白的乳化穩(wěn)定性僅為55%。這一結果顯示了，經(jīng)過琥珀酸酐改性的米糠蛋白制品提高了乳化穩(wěn)定性，而削弱了乳化活性。

蛋白質分子聚集在油滴表面降低了油水界面的表面張力并形成一層保護層，并且，通過靜電斥力的作用阻止了油滴間的聚合，因而起到一定的乳化作用，而且吸附動力學可以解釋乳化活性指數(shù)對蛋白質濃度的依賴，即在較低的蛋白濃度下，蛋白質在油水界面屬于擴散控制；在較高蛋白濃度下，活化能將限制蛋白質遷移[11]，因此，乳化活性指數(shù)會隨著蛋白質濃度的增加逐漸減小。與米糠蛋白相比，琥珀?；卓返鞍椎娜榛钚灾笖?shù)有所降低，是由于琥珀?；卓返鞍姿聂然吭黾樱瑢е率杷越档?，從而提高了界面張力。

2.2.3 起泡性

由圖8可知，同等濃度下，琥珀?；钠鹋菪员让卓返鞍椎钠鹋菪杂兴岣?，并且隨著?；鹊脑黾?，起泡性也隨之增加，而泡沫穩(wěn)定性隨著?；鹊脑黾佣兴档汀１狙芯恐?，?；卓返鞍?的起泡性為226.2%，為米糠蛋白起泡性的2.8倍；而米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性為56.7%，琥珀?；卓返鞍?的泡沫穩(wěn)定性僅為14.2%。究其原因，起泡性的提高是由溶解性的提高引起的。

國外已有很多研究證實，在食用價值上，酰化蛋白是無毒易消化的。Groninger和Miller[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，賴氨酸殘基被?；?，用來喂養(yǎng)鼠類時，營養(yǎng)價值幾乎沒有損失。因此，琥珀酰化不會降低米糠蛋白的利用效果和營養(yǎng)價值，是一種潛在的食品添加基料。

圖8 米糠蛋白與?；卓返鞍椎呐菽再|（n=3）Fig.8 Foam properties of rice bran protein and acylated rice bran protein products（n=3）

3 結論

1）琥珀?；男悦卓返鞍椎淖钸m反應條件確定為米糠蛋白濃度為10%，反應溫度為35℃，琥珀酸酐/蛋白質用量為15%。

2）琥珀酰化改性對米糠蛋白的一些功能性質有了不同程度的改變，其中琥珀?；男蕴岣吡嗣卓返鞍椎娜芙庑浴⑷榛€(wěn)定性及起泡性，并隨著酰化度的增加而增加；而米糠蛋白的乳化活性以及泡沫穩(wěn)定性由于?；男远兴陆??？梢宰鳛槭称分械奶砑踊?，擴大米糠蛋白在食品加工業(yè)的應用范圍。

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Effect of Succinylated Modification on the Functional Properties of Rice Bran Protein

ZHAI Ai-hua1，MA Guo-fei1，2，LI Dan1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China；2.Organization Department，Chinese Communist Friendship County，Shuangyashan 155800，Heilongjiang，China）

Succinic anhydride was applied in the present work to treat rice bran protein for succinylated modification for improving the functional properties of rice bran protein and expanding the application in food industry.The concentration of rice bran protein of 10%，the reaction temperature of 35℃and succinic/protein addition level of 15%was determined for the optimum reaction conditions through single factor reaction.Two succinylated rice bran protein products prepared with reaction time of 40 min and 80 min had the degree of acylation of 46.8%and 69.2%.Some functional properties of two succinylated rice bran protein products，such as solubility，emulsification，foaming ability，were analyzed.The results indicated that solubility，emulsion stability and foaming ability of two succinylated rice bran protein products were higher than that of rice bran protein and emulsifying activity and foam stability of two succinylated rice bran protein products were lower than that of rice bran protein as degree of acylation increased.

Succinylation；rice bran protein；functional properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.001

2013-09-25

高端配方米加工及副產(chǎn)物綜合精深加工技術產(chǎn)業(yè)化示范（HNK11KF-01）

翟愛華（1970—），女（漢），教授，碩士，主要從事糧油精深加工的研究。