被冰水浸泡后大鼠斷肢再植的實(shí)驗(yàn)研究

周健輝，李秀文，王夫平，冷樹立

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院手外科，廣東中山 528415)

·論著·

被冰水浸泡后大鼠斷肢再植的實(shí)驗(yàn)研究

周健輝，李秀文，王夫平，冷樹立

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院手外科，廣東中山 528415)

目的研究被冰水浸泡大腿斷肢后的不同時(shí)段對(duì)血管損傷程度的影響，為被冰水浸泡的斷指再植病例提供科學(xué)理論支持。方法實(shí)驗(yàn)選用成年大鼠共20只，雌雄不限，隨機(jī)分為4組，分別把左側(cè)大腿中上1/3水平環(huán)形離斷，然后分別將斷肢冰水浸泡1 h、2 h、4 h、6 h。然后對(duì)每組斷肢血管進(jìn)行病理觀察，再將不同組織別斷肢進(jìn)行再植，術(shù)中觀察血管通血情況，通血0.5 h后均將血管切斷，再次對(duì)斷肢血管行病理分析，最后再次接通斷肢血運(yùn)，縫合皮膚，把小鼠送回試驗(yàn)室，觀察各組斷肢再植的成活率。結(jié)果血管內(nèi)皮細(xì)胞在凍傷后的1 h、2 h、4 h內(nèi)未見明顯損傷，但在通過恢復(fù)血流復(fù)溫后，內(nèi)皮細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生不同程度的損傷。在1 h組及2 h組中，斷指再植的成活率較高，在4 h組斷肢再植成活率低，在6 h組中，無一斷肢成活。結(jié)論被冰水浸泡后的血管損傷程度隨著時(shí)間的推移而加重，浸泡的時(shí)間越長(zhǎng)，復(fù)位后血管形成的血栓越容易，當(dāng)?shù)竭_(dá)6 h以上均形成不可逆性損傷。

冰水浸泡；斷肢；再植；血管損傷

被冰水浸泡后的斷腕、斷指再植成功案例在國內(nèi)已經(jīng)屢有報(bào)道，在本地區(qū)也遇到不少，但成活率較正常保存的低，有學(xué)者曾經(jīng)用大鼠來研究斷肢不同保存方法對(duì)血管的損傷情況，但還沒有研究冰水浸泡時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)斷指血管的損傷以及斷肢再植成活率的影響。本實(shí)驗(yàn)研究大鼠組織離體后，通過冰水浸泡保存肢體的不同時(shí)段的病理學(xué)研究，探討冰水浸泡后的不同時(shí)段對(duì)血管的損傷程度，為臨床醫(yī)生在接診有關(guān)冰水保存斷肢患者時(shí)提供手術(shù)適應(yīng)證、手術(shù)操作、術(shù)后護(hù)理的參考及相關(guān)的理論支持。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型的建立選用成年大鼠共20只，雌雄不限，將20只大鼠分為術(shù)后離斷肢體被冰水浸泡1 h組、2 h組、4 h組、6 h組，每組大鼠5只，左側(cè)大腿為手術(shù)實(shí)驗(yàn)側(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程及記錄相關(guān)數(shù)據(jù)的辦法

1.2.1 大鼠的麻醉及注意事項(xiàng)首次麻醉以0.3 ml/100 g的劑量行腹腔注射10%的水合氯醛，實(shí)驗(yàn)手術(shù)中根據(jù)大鼠麻醉的狀態(tài)，腹腔再注射1/3的量來維持麻醉，避免大鼠產(chǎn)生任何自發(fā)運(yùn)動(dòng)，影響手術(shù)的操作，直至手術(shù)結(jié)束。

1.2.2 大鼠左側(cè)肢體的離斷固定、消毒、鋪巾，將左側(cè)大腿中上1/3水平作半環(huán)形切口，分離出股動(dòng)靜脈，然后將股動(dòng)靜脈離斷并結(jié)扎斷端，然后將皮膚、肌腱、神經(jīng)、骨質(zhì)離斷，環(huán)形離斷皮膚，然后分別將離斷肢體用冰水浸泡1 h、2 h、4 h、6 h。

1.2.3 觀察冰水浸泡后及復(fù)溫后的血管變化將每一組血在冰水浸泡所需的時(shí)間后，切取少段動(dòng)脈組織，制作成病理切片，并記錄鏡下的情況。然后將大鼠斷肢的動(dòng)脈與近端吻合，經(jīng)復(fù)溫10 min后，取下少段動(dòng)脈組織，再次制作成病理切片觀察。

1.2.4 觀察各組再植肢體的成活率將各組斷肢吻合動(dòng)靜脈后，縫合皮膚，然后用夾板固定雙下肢，麻醉蘇醒后放回籠子，放置食物和水，觀察再植肢體的成活率。

2 結(jié)果

分別對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠血管的復(fù)溫前后取樣，制作成標(biāo)本后在電子顯微鏡下觀察血管損傷的變化，以血管舒張、紅細(xì)胞滲出、血栓形成、內(nèi)皮細(xì)胞破裂、內(nèi)皮下層損傷、中膜彈性纖維損傷為闡述血管損傷程度的指標(biāo)，做好相應(yīng)的記錄和對(duì)比。結(jié)果顯示，復(fù)溫前后血管損傷程度隨著時(shí)間的推移而加重。分別將各試驗(yàn)組的斷肢進(jìn)行再植，結(jié)果顯示，隨著浸泡時(shí)間的推移，斷肢成活率明顯降低，見表1。

表1 各個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠離斷肢體在不同時(shí)段冰水浸泡后血管損傷情況及再植成活率

3 討論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，被冰水浸泡的肢體對(duì)血管是有損傷的，在不同時(shí)間的復(fù)溫也均有不同的損傷程度。在凍傷時(shí)由于凍-融過程的物理因素及一系列生化改變導(dǎo)致凍傷組織循環(huán)及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷已被證實(shí)[1]。國內(nèi)盧學(xué)春等[2]通過對(duì)凍傷大鼠內(nèi)皮細(xì)胞國內(nèi)改變的研究表明，在血管凍傷后ACE活性增高、人抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)含量及活性降低，這些指標(biāo)改變與凍傷的程度有密切關(guān)系，表明凍傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞有不同程度的損傷。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞這些改變，使血液凝固性增強(qiáng)，血管收縮而促進(jìn)凍傷組織血液循環(huán)及代謝障礙，進(jìn)而導(dǎo)致凍傷組織壞死。就內(nèi)皮細(xì)胞而言，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞在凍傷后的1 h、2 h、4 h內(nèi)未見明顯損傷，但在通過恢復(fù)血流復(fù)溫后，內(nèi)皮細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生不同程度的損傷，這就說明由于凍-融這個(gè)過程會(huì)因?yàn)楦鞣N化學(xué)物質(zhì)的大量釋放后，導(dǎo)致細(xì)胞的破裂死亡。這個(gè)機(jī)理目前也有報(bào)道是胞漿中的PGI2釋放到血液中所致[3]。所以為減少復(fù)溫后凍傷血管對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度，可能可通過抑制PGI2實(shí)現(xiàn)，但有關(guān)這方面的論據(jù)還需要進(jìn)一步的論證。

實(shí)驗(yàn)表明，隨著時(shí)間的推移，血管纖維層的損傷也進(jìn)一步的加強(qiáng)，隨著肌纖維的變性，橫紋消失，大片壞死，血管壁部分壞死，部分彈性纖維的斷裂，有較多纖維素性和混合性血栓形成。在浸泡后4 h開始出現(xiàn)血管的擴(kuò)張，經(jīng)血液復(fù)溫后，情況加重，血管失去彈性張力，不利于血流的輸送。

在1 h組及2 h組中，斷指再植的成活率較高，這與斷肢浸泡時(shí)間比較短有關(guān)，經(jīng)復(fù)溫后，血管損傷程度較輕，組織能自行修復(fù)，未出現(xiàn)組織不可逆性損傷。我們認(rèn)為，在此類斷指(肢)再植中，成活率較高，應(yīng)該盡一切努力進(jìn)行再植，術(shù)后常規(guī)治療會(huì)得到較好的效果。

在4 h組斷肢再植成活率低，我們認(rèn)為，隨著時(shí)間的推移，血管損傷的程度加重，大部分已出現(xiàn)不可逆性損傷。即使在手術(shù)中顯微鏡下觀察血管內(nèi)壁的大致形體無太大的變化，但在接通血管復(fù)位后，血管的缺血再灌注損傷明顯，乃至發(fā)生了血管逆損傷，血管出現(xiàn)明顯擴(kuò)張、內(nèi)膜細(xì)胞的破裂導(dǎo)致血栓的廣泛形成。此類斷肢再植成活率不高，或者有必要進(jìn)一步解決再灌注損傷的難題，更有利于斷肢再植的成活。

在6 h組中，可見無一斷肢成活，可見此時(shí)段的血管損傷最重，甚至在復(fù)溫前已出現(xiàn)明顯的血管損傷現(xiàn)象，經(jīng)接通血管復(fù)溫后，由于灌注的進(jìn)一步損傷，另血管結(jié)構(gòu)徹底的破壞，導(dǎo)致血管栓塞，肢體壞死。

目前在血管凍傷微循環(huán)變化方面有很多研究[4-9]，但由于各家的方法、條件及動(dòng)物的模型不同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性，甚至相互矛盾。事實(shí)證明凍傷微循環(huán)的研究已不限于微血管結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)的改變以及血流狀態(tài)的改變，同時(shí)與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞的功能及二者之間的相互作用。通過以上實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果，只能重某方面闡明局部冰水直接凍傷血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的后果，可以得出該種模式下的血管凍傷與時(shí)間段的關(guān)系。對(duì)于整體的血管凍傷微循環(huán)變化還有待于進(jìn)一步的研究。

[1]Bourne MH,Piepkorn MW,Clayton F,et al.Analysis of micro vas-cular change in frostbite injury[J].J Surg Res,1986,40(1):26.

[2]盧學(xué)春,李鳳芝,遲小華,等.免疫復(fù)合物參與凍傷大鼠凍結(jié)-融化損傷的研究[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2006,22(4):645-646.

[3]孔煒,方華豐,王迪潯,等.急性缺氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞血栓素合酶基因表達(dá)及PGI2、TXA2代謝產(chǎn)物的影響[J].同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,30(4):295-297.

[4]楊增仁,杜桂仙.凍傷微循環(huán)研究概況[J].循環(huán)醫(yī)學(xué)雜志,l996,6 (4):43-45.

[5]李鳳芝,顏培華、劉友梅,等.凍傷大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變的研究[J].中華創(chuàng)傷雜志,1994,10(6):280-281.

[6]張中興,辛素賢,彭長(zhǎng)營(yíng).重度凍傷試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯縖J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1980,60(11):673-675.

[7]閻紅,賴西南,葛衡江,等.兩種復(fù)合戰(zhàn)傷合并海水浸泡對(duì)血管內(nèi)皮損傷的比較研究[J].中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志,2010, 31(4):521-522.

[8]苗衛(wèi)東,曹湘豫,張韶民,等.橈動(dòng)脈腕背支為蒂的手背逆行島狀筋膜皮瓣的臨床應(yīng)用[J].局解手術(shù)學(xué)雜志,2004,13(2):83-84.

[9]姜忠華,王少春,王全平,等.低溫海水淹溺大鼠血?dú)馀c額葉皮層前列腺術(shù)和降鈣素基因相關(guān)肽的變化[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2003,21(5):381-382.

Experimental study of rat limb replantation of ice water immersion.

ZHOU Jian-hui,LI Xiu-wen,WANG Fu-ping,LENG Shu-li.Department of Hand Surgery,Xiaolan People's Hospital Affiliated to Southern Medical University, Zhongshan 528415,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the effect of different periods of ice water immersion on the vessel injury degree,and to provide scientific theoretical support for rat limb replantation of ice water immersion.MethodsTwenty adult rats,regardless of gender,were selected and randomly divided into four groups,which were soaked in ice water for 1 hour,2 hours,4 hours,6 hours after the left leg in 1/3 horizontal ring off,respectively.Then pathological analysis was performed on each limb vessel,then the limb was replanted.The blood flow was observed,and the vessel was cut off again after half an hour.Based on pathological analysis,the limb blood circulation was restored and the skin was sutured.Then the rats were sent back to laboratory to observe the survival rate of limb replantation.ResultsVascular endothelial cells were found no obvious damage after 1 h,2 h,4 h of ice water immersion,but showed different degrees of damage after rewarming by the restoration of blood flow.The survival rate of replantation was relatively higher in 1 h group and 2 h group,lower in 4 h group,with no limb survival in 6 h group.ConclusionThe vascular inju-ry degree increases with the time of ice water immersion.The longer the immersion time,the easier the formation of blood vessels after reset thrombosis,The damage is irreversible after 6 hours ice water immersion.

Ice water immersion;Severed limb;Replantation;Blood vesse Injury

R-332

A

1003—6350（2014）03—0317—03

2013-05-29)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.03.0124

周健輝。E-mail：zjhlxw@163.com