急性白血病患者HPA-1～6，15基因多態(tài)性與血小板輸注療效的相關(guān)性研究

苗菁，曾小菁

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科，貴州貴陽(yáng) 550004）

·論著·

急性白血病患者HPA-1～6，15基因多態(tài)性與血小板輸注療效的相關(guān)性研究

苗菁，曾小菁

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科，貴州貴陽(yáng) 550004）

目的通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)血小板抗原1～6,15系統(tǒng)(Human platelet alloantigen，HPA-1～6,15)，探討HPA多態(tài)性與血小板輸注療效的相關(guān)性。方法(1)收集30例輸注2次以上血小板的急性白血病患者外周血標(biāo)本，根據(jù)血小板回收率（Percentage platelet recovery，PPR)判定輸注效果；(2)采用酚/氯仿方法提取DNA；(3)采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（Polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）方法在相同條件下對(duì)血小板抗原HPA-1～6,15進(jìn)行基因分型，分析HPA抗原與血小板輸注療效的關(guān)系。結(jié)果(1)HPA-1～3、HPA-5～6、HPA-15系統(tǒng)等位基因呈多態(tài)性分布；HPA-4呈aa純合子單態(tài)性分布，HPA-1、5、6基因以aa純合子為主，僅HPA-3、15見(jiàn)bb純合子，b等位基因頻率以HPA-2最高(0.65)，其次依次為HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)。(2)30例急性白血病患者中有21例血小板輸注無(wú)效，無(wú)效率為70%，多集中于輸注3次及以上組。結(jié)論(1)抗-HPA引起血小板輸注無(wú)效概率較小，主要發(fā)生在HPA-2、3、15系統(tǒng)，對(duì)需作HPA配型的患者只要針對(duì)此3個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，就可提高輸注效果。(2)臨床應(yīng)注重血小板輸注治療的個(gè)體化，減少輸注次數(shù)，提高輸注療效。

血小板輸注；療效；急性白血??；血小板特異抗原；基因多態(tài)性

隨著輸血醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，成分輸血的推廣使用，血小板輸注已成為臨床輸血治療疾病的重要手段之一。但部分患者在輸注血小板后出血癥狀仍無(wú)改善，血小板計(jì)數(shù)水平仍舊很低。而只要2次及2次以上給予足量血小板，血小板增值未達(dá)預(yù)期值，即可定義為血小板輸注無(wú)效(Platelet transfusion refractoriness，PTR)[1]。近年來(lái)隨著血小板輸注的日益增加，PTR成為制約臨床治療的一大難題。在臨床血小板輸注過(guò)程中，如果血小板同種抗原不合．可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生血小板同種抗體，引起PTR。人類(lèi)血小板抗原系統(tǒng)(Human platelet alloantigen，HPA)為血小板特有，具有獨(dú)特的遺傳多態(tài)性，可介導(dǎo)同種免疫性抗體的產(chǎn)生。為了研究血小板基因遺傳多態(tài)性在血小板輸注療效的影響，我們應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)一序列特異性引物(Polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)技術(shù)，選取急性白血病患者，對(duì)HPA1-6, 15系統(tǒng)在同一擴(kuò)增條件下進(jìn)行同步擴(kuò)增，用病例間比較的方法，探討HPA1-6,15基因多態(tài)性與血小板輸注療效的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料考慮到急性白血病為臨床接受血小板輸注最多的人群，故選取30例急性白血病患者為研究對(duì)象，均為2012年6～10月在貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科住院患者。其中急性淋巴細(xì)胞白血病4例，急性髓細(xì)胞白血病26例，均符合各型急性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，男性17例，女性13例，年齡12～63歲，平均(43±7.31)歲。

1.2 血小板懸液輸注所用血小板懸液均由貴州省血液中心提供。制劑懸液均達(dá)到國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。機(jī)采1個(gè)治療量單采血小板為200～250 ml，含血小板數(shù)≥2.5×1011；手工制備血小板1 U由200 ml全血分離25～30 ml，含血小板數(shù)2.5×1010，輸入10 U相當(dāng)于機(jī)采血小板1個(gè)治療量[1]。

1.3 血小板輸注指征及用法血小板輸注指征：入選患者化療后血小板＜10×109/L或≥10×109/L但伴感染發(fā)熱或有出血傾向時(shí)輸注血小板[3]，每次輸注濃縮血小板10 U或單采血小板一個(gè)治療量。

1.4 血小板輸注效果評(píng)價(jià)血小板輸注效果評(píng)價(jià)用血小板回收率PPR(Percentage platelet recovery)來(lái)評(píng)價(jià)，輸注后24 h PPR＞20%即判斷為輸注血小板有效[1]。

1.5 主要儀器和試劑梯度PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)，PE9700擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，Taq聚合酶(大連寶生物工程有限公司)；PCR引物序列設(shè)計(jì)參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]，每一個(gè)HPA系統(tǒng)設(shè)計(jì)三條引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成提供。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)電泳條帶確定每個(gè)標(biāo)本的基因型，等位基因頻率用直接采用基因計(jì)數(shù)法，計(jì)算HPA-1～6,15系統(tǒng)的各基因型、基因頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，組間比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPA基因分型擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定內(nèi)對(duì)照帶引物為人類(lèi)生長(zhǎng)激素，均為429 bp，電泳結(jié)果顯示每孔均可見(jiàn)清晰的內(nèi)對(duì)照帶，陰性孔中無(wú)特異性擴(kuò)增帶，表明無(wú)相應(yīng)的基因。陽(yáng)性孔中除外內(nèi)對(duì)照帶可見(jiàn)清晰、特異的擴(kuò)增帶(片段大小參照表中目的條帶的堿基數(shù))，表示有相應(yīng)的基因。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 一例樣本的HPA 1-6,15分型

圖2 HPA 2、3、15圖例

2.2 輸注血小板次數(shù)與輸注效果的比較按輸注次數(shù)分為＜3次及≥3次組，計(jì)算24 h PPR后結(jié)果：30例中僅9例達(dá)到輸注有效標(biāo)準(zhǔn)，總有效率為30%，且大多集中于輸注＜3次組。證明血小板輸注次數(shù)與輸注效果有關(guān)，血小板輸注有效率隨輸注次數(shù)增加而下降。

2.3 30例樣本HPA-1～6,15等位基因分布比較結(jié)果顯示，可見(jiàn)僅HPA-4均表現(xiàn)aa純合子，呈單態(tài)性表現(xiàn)，其余均表現(xiàn)有多態(tài)性；HPA-1、5、6以aa純合子基因型為主；b等位基因頻率以HPA-2最高(0.65)，其次依次為HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)，見(jiàn)表1。

表1 HPA-1～6,15等位基因分布比較

2.4 輸注有效組與無(wú)效組HPA-1～6,15等位基因頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)除無(wú)效組中HPA-2基因頻率(P＜0.05)不符合Hardy-Weinberg平衡定律外，其他系統(tǒng)實(shí)際基因頻率與理論基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，均符合Hardy-Weinberg平衡定律，見(jiàn)表2。

2.5 血小板輸注有效組和無(wú)效組的HPA-1～6, 15基因型和基因頻率比較血小板輸注有效組和無(wú)效組基因型頻率、基因頻率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

注：aP＜0.05，即不符合Hardy-Weinberg平衡定律。NA，無(wú)效。

表3 血小板輸注有效組、無(wú)效組的HPA-1～6,15基因型和基因頻率的比較

3 討論

臨床上，血小板輸注對(duì)預(yù)防和治療血小板減少或功能缺陷患者的出血是一種有效治療方法。由于血小板來(lái)源少，保存困難，費(fèi)用高，輸注過(guò)多不僅增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，浪費(fèi)血源，還可能引起與血小板輸注相關(guān)的不良反應(yīng)而導(dǎo)致PTR。有研究認(rèn)為反復(fù)多次的血小板輸注可使HLA和HPA類(lèi)抗原刺激患者機(jī)體產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)，導(dǎo)致外源性血小板破壞，且輸注次數(shù)越多，檢出血小板抗體的陽(yáng)性率就越高，這是引起血小板輸注無(wú)效的重要原因[5]。本研究結(jié)果顯示輸注3次及以上血小板輸注無(wú)效率明顯上升，血小板輸注無(wú)效率達(dá)70%，與文獻(xiàn)報(bào)道血小板輸注無(wú)效率30%～70%[6]相符。

根據(jù)一份綜合調(diào)查報(bào)告表明，盡管輸注血小板無(wú)效涉及因素甚多，但認(rèn)為與血小板抗體密切相關(guān)[7]。國(guó)外血小板抗體高發(fā)頻率調(diào)查結(jié)果顯示，同種人類(lèi)白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)抗體的頻率最高，其次是HPA抗體。選擇HLA配合的血小板，或HLA以及HPA都配合的血小板，是一個(gè)減少血小板輸注無(wú)效的方法之一[8-9]。發(fā)生HPA免疫機(jī)會(huì)的多少與人群中HPA抗原分布頻率有關(guān)，HPA系統(tǒng)中對(duì)偶抗原不配合的比例越高，產(chǎn)生HPA抗體的機(jī)會(huì)越多，產(chǎn)生PTR的可能性越大。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道白種人易引起PTR的血小板特異性抗原有HPA-1a、HPA-lb、HPA-2b、HPA-3a、HP-3b、HPA-4a、HPA-5b等[10]；我國(guó)青島、上海、南京、石家莊和成都等地血液中心已開(kāi)展血小板抗原基因分型檢測(cè)，通過(guò)血小板抗原基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)各地HPA多態(tài)性分布均表現(xiàn)有一定的地域性差異，但以HPA-15a/b、HPA-3a/b、HPA-2a/b、HPA-5a/b、HPA-4a/b的不配合率較高，此外國(guó)內(nèi)研究曾經(jīng)在PTR患者中檢出HPA-2b抗體[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組HPA-4呈aa純合子單態(tài)性分布，HPA-1～3、5～6、15等位基因頻率均呈多態(tài)性分布，以HPA-2雜合度最高；HPA-1、5、6以aa純合子基因型為主，僅HPA-3、15見(jiàn)bb純合子；b等位基因頻率以HPA-2最高(0.65)，其次依次為HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)，與文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)大部分地區(qū)漢族人群b等位基因頻率表達(dá)前三位依次為HPA-15、HPA-2、HPA-3的抗原系統(tǒng)一致，但順序略有不同[12-13]。由此可推論：HPA-15、HPA-2、HPA-3系統(tǒng)有高度多態(tài)性，較易發(fā)生由基因不相合引起的免疫反應(yīng)，是HPA多態(tài)性導(dǎo)致PTR的主要影響抗原系統(tǒng)。

董偉群等[14]對(duì)PTR的免疫性因素的相關(guān)研究提示：免疫因素所致PTR中90%是由抗-HLA引起，黃種人產(chǎn)生抗-HPA僅占10%左右。李志強(qiáng)等[15]曾對(duì)49名反復(fù)輸血的惡性血液病患者進(jìn)行抗-HLA與抗-HPA篩查試驗(yàn)報(bào)道，多數(shù)患者相繼出現(xiàn)抗-HLA，而始終未檢出抗-HPA，故認(rèn)為抗-HPA非血小板輸注無(wú)效的主要原因。而本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，血小板輸注有效組和無(wú)效組之間HPA-1～6,15系統(tǒng)基因型和基因頻率的差異未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，也證實(shí)抗-HPA在導(dǎo)致PTR各因素中所占比例不大，可不考慮其為導(dǎo)致PTR的主要原因，擴(kuò)大樣本例數(shù)還可進(jìn)一步論證。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)輸注無(wú)效組HPA-2基因頻率不符合Hardy-Weinberg平衡法則。根據(jù)既往文獻(xiàn)理論：Hardy-Weinberg平衡本質(zhì)上是一種理想狀態(tài)，其假設(shè)條件在一般人群中很難得到滿足，因此Hardy-Weinberg平衡是相對(duì)的，主要針對(duì)正常無(wú)疾病人群，因?yàn)榧膊”旧砭褪且环N選擇限制，不屬于隨機(jī)選擇，不平衡是正常的[16-17]。本實(shí)驗(yàn)樣本均選自急性白血病患者，進(jìn)行的是病例間療效比較，所以出現(xiàn)不平衡仍可進(jìn)行結(jié)果分析。

綜上所述，在未來(lái)的臨床工作中，輸注血小板應(yīng)防范多因素所致輸注無(wú)效的風(fēng)險(xiǎn)，其中因抗-HPA引起PTR的比例很小，對(duì)反復(fù)多次發(fā)生PTR患者即使考慮與HPA基因多態(tài)性有關(guān)，需作HPA配型時(shí)，多數(shù)人只需檢測(cè)供者與受者HPA-2、3、15基因就可有效減少血小板輸注無(wú)效的發(fā)生。這樣既縮短試驗(yàn)時(shí)間，降低試驗(yàn)成本、又保證患者能夠及時(shí)、有效地接受輸注血小板治療。

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Correlation between polymorphism of HPA-1～6,15 and the effect of platelet transfusion in patients with acute leukemia.

MIAO Jing,ZENG Xiao-jing.Department of Hematology,the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo study the correlation between polymorphism of Human platelet antigens(HPA) and the effect of platelet transfusion,through testing the gene of the HPA-1～6,15.Methods(1)The peripheral blood simples of 30 patients with acute leukemia who had accepted platelet transfusion for two or more times were collected. The effect of platelet transfusion was evaluated by percentage platelet recovery(PPR).(2)The method of phonelic/ chloroform was applied to extract DNA.(3)PCR with sequence specific primers(PCR-SSP)was used to type HPA1～6,15 under the same conditions.The curative effect of platelet transfusion was observed.Results(1)The system alleles of HPA-1～3,HPA-5～6,HPA-15 showed polymorphism distribution;HPA-1,5,6 mainly showed aa homozygous genotype,HPA-4 presented homozygous single-state distribution,only HPA-3,15 presented bb homozygous genotype;HPA-2 had the highest heterozygous level(0.65),followed by HPA-15(0.349),HPA-3(0.3).(2)Platelet transfusion refractoriness(PTR)was found in 21 of the 30 patients of acute leukemia,with the rate of inefficiency of 70%, mainly concentrated in the patients undergoing 3 or more times of platelet transfusion.Conclusion(1)A few case of PTR is caused by anti-HPA,and testing HPA-2,3,15 genes maybe enough to improve the effect of platelet transfusion for patients of HPA matching.(2)Patients individualization should be taken into consideration in clinical practice, in order to reduce the chance of repeated transfusion and increase the effective rate.

Platelet transfusion;Effect;Acute leukemia;Human platelet antigens(HPA);Polymorhism

R733.71

A

1003—6350（2014）03—0313—05

2013-05-07)

曾小菁。E-mail：gymj0218@163.com