高分辨率熔解曲線分析對(duì)38例孤獨(dú)癥DRD2基因外顯子突變檢測(cè)*

劉苗 陳星 翟靜 劉金同 張燕 劉兆云 龍逢 楊樹林 陳剛

高分辨率熔解曲線分析對(duì)38例孤獨(dú)癥DRD2基因外顯子突變檢測(cè)*

劉苗1，2陳星1翟靜3劉金同3張燕3劉兆云1，2龍逢2楊樹林4陳剛1

目的對(duì)孤獨(dú)癥患者DRD2基因全部外顯子進(jìn)行突變篩查。方法構(gòu)建孤獨(dú)癥患者納入研究組(38例)和對(duì)照組(95例和1 000例)3個(gè)DNA混合池，對(duì)DRD2基因的9個(gè)外顯子合成了15對(duì)引物，將3個(gè)DNA混合池樣本分別進(jìn)行聚合酶鏈擴(kuò)增及COLDPCR擴(kuò)增，用Light Scanner高分辨率熔解曲線分析系統(tǒng)進(jìn)行兩次熔解曲線對(duì)比。結(jié)果在孤獨(dú)癥患者DRD2基因外顯子未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論孤獨(dú)癥的病因并非源于DRD2基因外顯子的突變。

孤獨(dú)癥DRD2基因突變低變性溫度下的復(fù)合PCR高分辨率熔解曲線分析

孤獨(dú)癥(autism)是一種始發(fā)于嬰幼兒期(通常在3歲以內(nèi))的廣泛性發(fā)育障礙，以社交、言語(yǔ)障礙及刻板重復(fù)行為為主要特征，并且這些特征不會(huì)隨孤獨(dú)癥兒童的成長(zhǎng)而消失，多數(shù)患者伴有精神發(fā)育遲滯，預(yù)后差［1］。近年來孤獨(dú)癥的發(fā)病呈上升趨勢(shì)，國(guó)外報(bào)道兒童孤獨(dú)癥的患病率為0.6%［2］。孤獨(dú)癥病因尚不清楚，可能是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果，是一種多基因遺傳病。迄今，許多基因被發(fā)現(xiàn)與孤獨(dú)癥關(guān)聯(lián)，我們用AffymetrixSNP6.0芯片對(duì)孤獨(dú)癥的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與DRD2基因存在關(guān)聯(lián)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，本研究采用了低變性溫度下的復(fù)合PCR、DNA混合和高分辨率熔解曲線分析相結(jié)合的技術(shù)方法，對(duì)DRD2基因的全部外顯子區(qū)域，在38例孤獨(dú)癥患者和1 095例正常對(duì)照者進(jìn)行了突變篩查，結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象選擇了2000～2002年在山東省精神衛(wèi)生中心就診的孤獨(dú)癥患者(研究組)38例;其中男性36例，女性2例，男女之比為18∶1，年齡2～10歲，平均年齡(5.10±1.61)歲，患者間均無血緣關(guān)系。正常對(duì)照者1 095例(對(duì)照組)，分為95例與1 000例兩組，均取自山東省血液中心獻(xiàn)血者。95例對(duì)照者中，男性48例，女性47例，男女之比為1.02∶1，年齡18～55歲，平均年齡(26.03±6.84)歲;1 000例對(duì)照者中，男性569例，女性431例，男女之比為1.32∶1，年齡17～55歲，平均年齡(23.08±5.67)歲。所有患者均符合國(guó)際疾病分類第10版(ICD-10)孤獨(dú)癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究得到了山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了患者與對(duì)照者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備取研究組與對(duì)照組的外周靜脈血，分別放入抗凝試管與抗凝袋中-20℃冷凍保存。DNA采用廈門百維信生物科技有限公司(Bio-V)的Lab-Aid 820自動(dòng)核酸提取儀與500 μl全血磁珠提取核酸試劑盒提取。DNA濃度用美國(guó)賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)的NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)，每個(gè)樣本測(cè)定兩次，如果兩次誤差超過10%，則進(jìn)行第3次測(cè)定，取兩個(gè)相近數(shù)值的平均值。而后，將所有DNA樣品稀釋至終濃度20 ng/μl。

1.2.2DNA混合池(DNA pooling)制作將研究組與對(duì)照組的每個(gè)個(gè)體取20 ng/μl濃度的DNA溶液10 μl進(jìn)行混合，制成DNA混合池，將研究組患者的DNA構(gòu)建1個(gè)DNA混合池樣本;將對(duì)照組的DNA分別構(gòu)建了2個(gè)DNA混合池樣本(95例與1 000例)。最后，將所有DNA樣品稀釋至終濃度1 ng/μl，用96孔深孔板(2 ml)-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA模板分裝用美國(guó)APRICOT DESIGNs Personal Pipette PP-550N-XD移液工作站將終濃度1 ng/μl的DNA溶液分裝5 μl至96孔PCR板(寧波)。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成用美國(guó)加州大學(xué)的基因組生物信息學(xué)網(wǎng)站UCSC Genome Bioinformatics(http:// genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)，輸入DRD2基因，在眾多轉(zhuǎn)錄本中選擇最長(zhǎng)(外顯子最多)的一個(gè)，在Human Gene DRD2(uc010pxh.2)Description and Page Index頁(yè)面，通過Exon Primer(外顯子引物)，選擇Entire(全部)cDNA后生成;引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。見表1。

表1 孤獨(dú)癥DRD2基因外顯子突變檢測(cè)引物序列

1.2.5 PCR反應(yīng)DNA 5 μl(1 ng/μl)，10×EasyTaq buffer 2.0 μl(Trans Gen Biotech全式金)，10 mM dNTPs 0.8 μl，5 μM Primer(左右)各0.8 μl，5 μM SYTO9(飽和熒光染料)1.5 μl，Easy Taq polymerase (Trans Gen Biotech全式金)(5 U/μl)0.2 μl，加ddH2O 8.9 μl使總反應(yīng)體系為20 μl。PCR反應(yīng)在美國(guó)Applied Biosystem，ABI公司的GeneAmp PCR System 9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，56～59℃退火2 min，72℃延伸30 s，共50個(gè)循環(huán);然后72℃保溫7 min，最后保存于25℃。從PCR產(chǎn)物中取15 μl用于高分辨率熔解曲線分析，先確定PCR產(chǎn)物的Tm值，再制定相應(yīng)PCR產(chǎn)物的Tc值(臨界解鏈溫度)(Tc=Tm-1)。將剩余的5 μl PCR產(chǎn)物加三蒸水200 μl稀釋后混勻，取5 μl用作Cold-PCR的DNA模板，試劑與PCR配方相同，總反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性15 s、56℃退火2 min、72℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán);95℃變性15 s、70℃2 min(形成雜交異源雙鏈)、Tc=Tm-1，每個(gè)具體PCR產(chǎn)物有所不同，變性10 s、56℃退火30 s、72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán);最后保存于25℃。

1.2.6 高分辨率熔解曲線分析基因突變檢測(cè)(High Resolution Melting for Gene Scan)采用高分辨熔解曲線基因突變/基因分型檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Idaho Technology，Light Scanner HI 96)，溫度從65℃升至95℃。飽和熒光染料結(jié)合于DNA雙鏈之中，隨著溫度的逐漸上升，雙鏈PCR產(chǎn)物就會(huì)發(fā)生解鏈，熒光染料則會(huì)隨之開始脫落，直至DNA完全解鏈后全部脫落。此過程會(huì)通過熒光曲線的下降反映出來，如果對(duì)照組與研究組患者在這一段PCR產(chǎn)物的DNA序列完全一致，那么二者的熔解曲線的形狀就會(huì)完全吻合;若研究組的DNA存在突變，就會(huì)形成DNA異源雜合雙鏈，解鏈溫度會(huì)提前，或者呈現(xiàn)兩次解鏈，熔解曲線形狀也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，通過與對(duì)照組熔解曲線做對(duì)比，便可發(fā)現(xiàn)患者的這一段DNA序列是否存在突變。Erali等［3］對(duì)此有非常全面而詳盡的論述。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析所有15對(duì)引物擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物的基因掃描通過Instrument＆Analysis軟件(Light Scanner wit Call-IT 2.0)完成。另外，研究組與對(duì)照組的一般統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)通過Microsoft Office Excel軟件完成。

2 結(jié)果

對(duì)多巴胺受體2基因(dopamine D2receptor，DRD2)全部9個(gè)外顯子的序列，用DNA混合池的方法，分別經(jīng)過PCR與Cold PCR擴(kuò)增后，對(duì)研究組與兩個(gè)對(duì)照組的高分辨率熔解曲線逐一對(duì)比之后均未發(fā)現(xiàn)突變。見圖1。

圖1DRD2基因第3外顯子(Exon 3)研究組與對(duì)照組高分辨率熔解曲線圖

3 討論

孤獨(dú)癥(Autism)的病因涉及遺傳學(xué)、圍產(chǎn)期危險(xiǎn)因素、腦器質(zhì)性疾病、神經(jīng)生化等，一般認(rèn)為是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。遺傳學(xué)因素在目前病因?qū)W的研究中占主要方面，認(rèn)為孤獨(dú)癥是多基因遺傳性疾病［4］。孤獨(dú)癥譜系障礙顯示出顯著的性別差異，特發(fā)性自閉癥男女之比約為(4～10)∶1，并且這一比例還會(huì)有增加的趨勢(shì)［5］。

研究發(fā)現(xiàn)在孤獨(dú)癥患者中，大約75%的出現(xiàn)精神發(fā)育遲滯，15%～30%出現(xiàn)癲癇，20%～50%出現(xiàn)腦電圖異常。此外，大約5%～14%的患者有染色體異常［6］。Lainhart等［7］的研究表示，大約有20%的孤獨(dú)癥患者在12～24個(gè)月的成長(zhǎng)過程中發(fā)育相對(duì)正常，隨后逐漸或突然出現(xiàn)變化，緊隨其后的一段時(shí)間語(yǔ)言能力出現(xiàn)嚴(yán)重喪失，孤獨(dú)癥的癥狀變得非常明顯。Ritvo等［8］對(duì)40對(duì)雙生子的研究顯示，同卵雙生子的同病率為95.7%(23對(duì)同卵雙生子有22對(duì)發(fā)病)，異卵雙生子同病率僅為23.5%(17對(duì)異卵雙生子有4對(duì)發(fā)病)。研究還發(fā)現(xiàn)7、13、15、17及18號(hào)染色體上的某些區(qū)域與孤獨(dú)癥的易感性有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)的孤獨(dú)癥的易感基因包括EN2、FOXP2、RELN、MET、Reelin、CNTNAP2等［9］。

人類DRD2受體基因位于11q23.1，包含9個(gè)外顯子，數(shù)個(gè)內(nèi)含子及短核苷酸重復(fù)序列(STR)，位于全基因組掃描所發(fā)現(xiàn)的與孤獨(dú)癥關(guān)聯(lián)區(qū)域。St Clair等［10］的研究表明11q21-q22區(qū)域可能包含大部分精神疾病易感基因，而DRD2的異常表達(dá)可能是孤獨(dú)癥的發(fā)病原因之一。多巴胺D2受體信號(hào)與多項(xiàng)生理功能有關(guān)，如運(yùn)動(dòng)、激素分泌和藥物成癮等，同時(shí)，多巴胺D2受體也是已知的抗精神病藥物治療靶點(diǎn)之一，也是精神疾病研究的熱點(diǎn)之一。Basu等［11］報(bào)道了多巴胺選擇性地抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，揭示了神經(jīng)系統(tǒng)和血管生成之間的聯(lián)系，并指出多巴胺D2受體可能對(duì)抗血管生成治療有作用。DRD2基因在人腦內(nèi)尾狀核表達(dá)最高，可抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，使cAMP水平降低。DRD2是多巴胺受體的一個(gè)亞型，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，位于多巴胺能神經(jīng)元突觸后膜［12］。大多數(shù)抗精神病藥物的藥理作用是通過阻斷多巴胺受體及拮抗多巴胺敏感性腺苷酸環(huán)化酶的功能而發(fā)揮作用。多巴胺受體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)“自我獎(jiǎng)賞”效應(yīng)，DRD2是精神活性物質(zhì)依賴及成癮形成的一個(gè)重要候選基因。TaqIA是DRD2基因的多態(tài)性標(biāo)志，研究表明，TaqIA RFLP與酗酒和吸煙行為的成癮性有關(guān)［13］，DRD2基因TaqIA1等位基因見于69%的酗酒者，相比之下僅發(fā)生在20%的對(duì)照者中。Comings等［14］比較研究了酗酒與多巴胺能神經(jīng)傳遞缺陷有關(guān)的疾病，為了降低基因頻率的種族差異，研究?jī)H限于非西班牙裔白人;結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抑郁癥、驚恐發(fā)作、帕金森病以及肥胖患者中的A1等位基因頻率無明顯增加。該研究還表明DRD2基因A1等位基因與許多精神疾病有關(guān)，可能是一個(gè)修飾基因，而不是主要致病基因。

DNA混合池(DNA pooling)是將許多患者與正常對(duì)照者的DNA樣本分別加以混合后對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較不同組合混合樣本之間等位基因頻率的差異，其優(yōu)點(diǎn)是提高研究效率，縮短研究周期。陳剛等［15］利用此技術(shù)對(duì)雙相情感障礙等疾病進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。

Boisselier等［16］在對(duì)異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)基因突變檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，低變性溫度下的復(fù)合PCR (COLD-PCR)與高分辨率熔解曲線(High resolution melting curve analysis，HRM)相結(jié)合的方法是一種高靈敏度的突變檢測(cè)方法，能夠從大量野生型DNA中選擇性擴(kuò)增低豐度的未知突變，提高低豐度突變檢測(cè)靈敏度［17］。每一段雙鏈DNA都有一個(gè)Tm值，即指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度;不同序列的DNA，Tm值不同。而單核苷酸的突變會(huì)稍微降低雙鏈DNA的熔解溫度，而COLD-PCR正是利用這一特性，使用較低的變性溫度TC(TC=Tm-1)，優(yōu)先擴(kuò)增在序列上含有突變的DNA。再對(duì)COLD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過HRM技術(shù)進(jìn)行突變篩選。

高分辨率熔解曲線是近年來國(guó)際上興起的一種SNP及突變研究工具，即可以進(jìn)行SNPs的分型，又可以進(jìn)行突變篩查。其原理是在DNA片段擴(kuò)增過程中加入飽和熒光染料，并使其鑲嵌在DNA雙鏈之間，飽和了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的溝。不同的雙鏈DNA分子在被加熱變性時(shí)，在不同的溫度下解鏈釋放出飽和熒光染料，從而形成不同的熔解曲線。因?yàn)椴煌珼NA序列的GC含量有所不同，因此在相同溫度下雙鏈DNA的解鏈情況是不同的，因此熔解曲線的形狀也不相同。與傳統(tǒng)方法相比，HRM檢測(cè)不受突變位點(diǎn)和種類的限制，既能檢測(cè)已知突變，又能檢測(cè)未知突變，并且具有敏感性高，操作簡(jiǎn)便，成本低的優(yōu)勢(shì)。然而由于HRM的敏感性高，所以結(jié)果容易受各種因素的影響，因此優(yōu)化擴(kuò)增過程和擴(kuò)增引物非常重要［18］。雖然HRM可以檢測(cè)到突變，但是不能最終明確突變的性質(zhì)［19］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)38例孤獨(dú)癥樣本DRD2基因的全部9個(gè)外顯子都進(jìn)行了檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)突變的原因可能有以下兩點(diǎn):(1)孤獨(dú)癥患者中，DRD2基因外顯子中根本就不存在突變，而突變可能存在于外顯子之外的其他DNA序列中(如內(nèi)含子)。目前，內(nèi)含子突變與疾病關(guān)系的研究逐漸增多，基因內(nèi)含子的核苷酸序列并不參與轉(zhuǎn)錄，雖然與蛋白產(chǎn)物無關(guān)但卻影響著相應(yīng)的基因的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子具有許多功能，既有增強(qiáng)子作用，也有抑制作用，還與RNA編輯有關(guān);研究還發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)含子突變及多態(tài)性與多種疾病的易感性相關(guān)。(2)DRD2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化有待于探查。DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DMT)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程。在哺乳動(dòng)物中DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5 mC)。基因啟動(dòng)子區(qū)是基因表達(dá)的重要調(diào)控區(qū)域，也是甲基化的集中區(qū)域，該區(qū)域CpG島甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制之一［20，21］。CpG島在正常組織中處于非甲基化狀態(tài)，DNA甲基化異常與許多中樞系統(tǒng)疾病，腫瘤等密切相關(guān)，CpG位點(diǎn)是發(fā)生自發(fā)突變的重要位點(diǎn)。(3)用于研究的患者樣本數(shù)量不夠大。(4)HRM敏感性不足。

總之，本文系統(tǒng)地對(duì)38例孤獨(dú)癥的DRD2基因全部9個(gè)外顯子進(jìn)行了突變檢測(cè)，未能發(fā)現(xiàn)突變。這對(duì)以后孤獨(dú)癥病因的研究以及臨床治療具有參考意義，以后的研究既要考慮到基因外顯子區(qū)域，同時(shí)更要考慮到基因內(nèi)含子區(qū)域和調(diào)控區(qū)域的甲基化問題。

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Mutation screening of exons in DRD2gene by using high-resolution melting curve analysis in 38 patients with autism．

LIU Miao，CHEN Xing，ZHAI Jing，et al． Laboratory of Medical Genetics，Institute of Basic Medicine，Shandong Academy ofMedical Sciences，Jinan 250062，China

ObjectiveTo screen the exons in DRD2 gene in autistic patients to find the mutations.Methods3 DNA poolswere constructed in 38 cases with autism，95 healthy controls and 1000 healthy controls. 15 pairs of primer were synthesized for9 exons in DRD2 gene. DAN in 3 pools was amplified with polymerase chain reaction ( PCR) and Cold-PCR. Mutation detectionwas performed by using Light Scanner high-resolution melting curve ( HRM) analysis system to compare the melting curvebetween autistic patients and healthy controls.ResultNo mutation was found in all the 9 exons of DRD2 gene in autisticpatients.ConclusionMutations on exons of DRD2 gene is not involved in the etiology of autism.

Autism DRD2Gene Mutation Cold-PCR HRM

R749.94

A

1009-7201(2014)-01-0008-04

10.3969/j.issn.1009-7201.2014.01.003

2013-08-08)

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):ZR 2010HQ051);山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2011GSF11821)

1.250062濟(jì)南，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所2.濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院3.山東省精神衛(wèi)生中心4.泰山醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院

陳剛，導(dǎo)師，研究員，E-mail:chengang 560515@163.com