HIV病毒核酸載量檢測方法研究進(jìn)展

李育芬 李婕 李艷君

HIV病毒載量是機(jī)體每毫升血漿中含HIV-RNA[7]的拷貝數(shù)。是病毒復(fù)制和機(jī)體免疫清除機(jī)制共同作用結(jié)果，直接反應(yīng)機(jī)體血液內(nèi)游離病毒含量。

HIV病毒載量檢測主要用于已診斷的HIV感染者或艾滋病人抗病毒治療療效觀察[5]。此外還應(yīng)用于HIV疫苗研究、試劑的研發(fā)生產(chǎn)等。其次在個(gè)體診斷方面還可以彌補(bǔ)HIV抗體檢測局限性：窗口期、疾病終末期以及HIV感染孕婦所生18個(gè)月內(nèi)嬰兒的個(gè)體診斷；自身免疫疾病、血液透析、懷孕、肝病、藥物、疫苗等導(dǎo)致的HIV抗體不確定結(jié)果樣本的個(gè)體診斷。本文就HIV病毒載量檢測方法做一綜述。

1 HIV病毒核酸載量檢測的常用方法

1.1 bDNA法定量檢測： 分枝DNA信號(hào)放大系統(tǒng)（bDNA）技術(shù)，樣本用特定裂解液裂解樣本后，經(jīng)探針雜交與信號(hào)放大可迅速得到基因定量結(jié)果。有靈敏度高、檢測范圍大和準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)。亦可通過離心將HIV RNA從病毒顆粒中釋放，再用捕獲探針1將其捕獲到微孔中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結(jié)合，又與預(yù)放大探針結(jié)合。后者再與放大探針即bDNA探針雜交。兩套靶探針分別與病毒RNA的pol基因的不同區(qū)域特異結(jié)合。形成HIVRNA寡核苷酸復(fù)合物。再加入化學(xué)發(fā)光底物孵育后放大信號(hào)。通過發(fā)光強(qiáng)度來定量。該技術(shù)的獨(dú)特分支DNA（人工合成）信號(hào)放大系統(tǒng)，其分支可結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)記物，將捕獲的靶標(biāo)信號(hào)放大以便于檢測。此檢測技術(shù)不涉及核酸擴(kuò)增。根據(jù)固相雜交的原理，采用了放大標(biāo)記探針，目標(biāo)物不被擴(kuò)增，但檢測信號(hào)被放大，提高了靈敏度。bDNA檢測步驟[1]：（1）將患者血清或血漿連同含有特異的合成寡聚核苷酸靶探針的裂解液加入微孔；（2）孵育?？舍尫挪《竞怂?，降解RNA酶或使DNA變性，然后靶探針結(jié)合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷卻洗板；（4）加信號(hào)放大探針 （bDNA）到各孔內(nèi)；（5）孵育。此步驟使bDNA雜交到靶探針的相應(yīng)部位；（6）冷卻洗板；（7）加標(biāo)記探針到各孔內(nèi)；（8）孵育，此步驟使酶標(biāo)記的探針雜交到bDNA上；（9）冷卻洗板；（10）加化學(xué)發(fā)光底物到各孔中；（11）孵育，酶和底物相互作用，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。產(chǎn)生的光強(qiáng)與樣品病毒RNA或DNA的載量成正比。各樣品中病毒核酸的含量由與樣品一同處理的標(biāo)準(zhǔn)所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。

1.2 NASBA檢測法：依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）法，由一對(duì)特異的引物介導(dǎo)、三種酶催化的以單鏈RNA為模板的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，有操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、不易被污染等優(yōu)點(diǎn)[3]。其步驟為：

1.2.1 核酸提取：按常規(guī)RNA提取方法，亦可根據(jù)需要自選。

1.2.2 核酸擴(kuò)增：將純化RNA加到標(biāo)準(zhǔn)NASBA反應(yīng)體系，在65℃下作用5min去除RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，再在恒溫的42℃下開始擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.3 產(chǎn)物的檢測：

1.2.3.1 直接檢測：是早期方法。反應(yīng)產(chǎn)物直接在瓊脂糖甲醛變性凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察單鏈RNA片段的長度。

1.2.3.2 寡核苷酸檢測法：將NASBA和ELISA結(jié)合，把與檢測信號(hào)有關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記在核酸探針上，檢測該信號(hào)從而間接檢測RNA。通過探針捕獲將地高辛標(biāo)記的探針和NASBA產(chǎn)物的復(fù)合物吸附到微量反應(yīng)板，作用于底物顯色，分析吸光度檢測RNA產(chǎn)物。

1.3 RT-PCR檢測法： 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增（real-time PCR），用熒光基團(tuán)標(biāo)記探針，5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)R，3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)Q，在沒有PCR擴(kuò)增時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離很近，使熒光基團(tuán)被淬滅，不發(fā)熒光；而PCR擴(kuò)增時(shí)，引物與熒光標(biāo)記的特異性探針同時(shí)結(jié)合在模板上，熒光標(biāo)記的探針與模板的結(jié)合位置位于上下游引物之間，用Taq酶的5′-3′外切酶活性，熒光探針?biāo)?，熒光基團(tuán)被釋放出來，由于空間上與淬滅基團(tuán)分開，則發(fā)出熒光[2]。發(fā)出的熒光被熒光探頭檢測到，邊擴(kuò)增，邊檢測，實(shí)現(xiàn)了“實(shí)時(shí)”檢測[4]。最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。因此，獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。該法步驟為[1]：（1）樣品制備，抽提和濃縮目標(biāo)RNA，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，檢測PCR的產(chǎn)物使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針。（3）RT-PCR反應(yīng)，病毒RNA利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用DNA聚合酶對(duì)特定片段進(jìn)行擴(kuò)增。（4）檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)病毒載量高時(shí)，低循環(huán)數(shù)即能檢測到熒光信號(hào)，當(dāng)病毒載量低時(shí)，高循環(huán)數(shù)時(shí)才能檢測到熒光。循環(huán)數(shù)與樣品載量成線性關(guān)系。利用標(biāo)準(zhǔn)品制作循環(huán)數(shù)與載量的標(biāo)準(zhǔn)曲線就能對(duì)樣品載量進(jìn)行定量。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)： 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是將RNA逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的PCR相結(jié)合的技術(shù)。它先用反轉(zhuǎn)錄酶把RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。該技術(shù)靈敏且用途廣泛，作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。整過程可粗略分為三個(gè)階段：1.從細(xì)胞或組織中提取總RNA。標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理中，HIV-1RNA是用裂解液裂解病毒顆粒直接從血漿中分離，再用乙醇沉淀RNA。超敏感的樣品制備法是高速離心濃縮血漿中HIV-1病毒顆粒，再用裂解病毒顆粒。然后用乙醇沉淀RNA。 2.逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)； 3.擴(kuò)增內(nèi)參和目的基因并比較基因表達(dá)差異。逆轉(zhuǎn)錄PCR步驟為[2]：試劑準(zhǔn)備；樣品制備；靶RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；用HIV-1特異互補(bǔ)引物進(jìn)行靶cDNA PCR擴(kuò)增；通過比色與探針結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物的測定。將已知拷貝數(shù)的HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品加到每一個(gè)樣品中和HIV-1靶序列共同進(jìn)行樣品制備、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、雜交和檢測并和HIV-1靶序列一起擴(kuò)增。根據(jù)HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)計(jì)算樣品的HIV-1RNA含量。定量標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)償了抑制因素的影響，擴(kuò)增過程的質(zhì)控使樣品的HIV–1RNA得以準(zhǔn)確定量。Amplicor HIV-1 Monitor 1.0版能定量400～750000 cp/mL的HIV RNA，需0.2mL血漿。超敏試驗(yàn)?zāi)軝z測更低水平HIV RNA，改進(jìn)包括增加標(biāo)本用量（0.5mL血漿）、超速離心病毒顆粒、減少重懸液體的體積等，這使檢測敏感性提高50cp/mL。但檢測上限也下降了（7.5萬）。目前應(yīng)用最廣泛的儀器COBAS AMPLICOR在全自動(dòng)診斷儀上定量測定HIV-1RNA，試劑盒有標(biāo)準(zhǔn)的和超敏感兩種樣品處理程序，能定量測定含量50-750，000 cp/mL HIV-1RNA。兩個(gè)版本的程序結(jié)合檢測范圍是50～750000 cp/mL。

2 其它HIV-1病毒載量的方法

除了分枝DNA信號(hào)放大系統(tǒng)技術(shù)外，核酸擴(kuò)增技術(shù)定量測定血漿HIV-1RNA是使用最廣泛方法。近年也對(duì)其它方法作了探索。

2.1 HIV-1 RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）活性的定量檢測： 逆轉(zhuǎn)錄酶的活性與活病毒顆粒的數(shù)量有很好的相關(guān)性，測定RT的活性可反映HIV-1活病毒顆粒的數(shù)量。以前RT活性測定方法復(fù)雜且需同位素，使用受到很大限制。最近發(fā)展ELISA法測定RT活性試驗(yàn)，操作簡便，價(jià)格低廉 [13]。

實(shí)驗(yàn)包括病毒顆粒分離和RT活性測定兩部分。前者用能結(jié)合病毒顆粒的凝膠把病毒從血漿中分離出來，然后把病毒顆粒裂解，收集裂解物用于RT檢測。檢測程序是：在包被了polyA的孔板中加入RNA模板結(jié)合在板底，再加入含有引物和RT底物的混合物，如果有RT活性，將催化合成DNA鏈，然后加堿性磷酸酶標(biāo)記的α-BrdU的抗體檢測合成產(chǎn)物，再加底物，測定光密度值確定合成的DNA鏈的量，間接推測RT的活性[14]。經(jīng)過初步驗(yàn)證，檢測靈敏度是0.5gRT∕mL，病毒載量越高，檢測RT的陽性率越高。該檢測可望用于替代病毒測定。

2.2 血漿HIV-1定量培養(yǎng)：系列稀釋的待測血漿與活化的正常人外周血單核細(xì)胞（PBMC）共同孵育，用特定的方法，監(jiān)測病毒的生長狀況，從而測定培養(yǎng)病毒的數(shù)量[12]。結(jié)果以TCID50（半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量），及50﹪組織培養(yǎng)感染劑量來表示。這種方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且不敏感。應(yīng)仔細(xì)處理標(biāo)本、盡快送檢、選擇對(duì)HIV易感性強(qiáng)的PBMC。比較可培養(yǎng)的病毒數(shù)量與血漿HIV-1 RNA，通常后者是前者的100～10000倍?？赡芤驒z測核酸病毒載量實(shí)驗(yàn)可檢測缺陷的病毒而培養(yǎng)法只檢測活病毒。兩者在外周血中數(shù)量比換算及更可靠、更簡便的培養(yǎng)模型的建立是將來該方法發(fā)展要解決的難點(diǎn)。

2.3 PBMC的定量培養(yǎng)：測量PBMC中HIV-1感染的細(xì)胞數(shù)目，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。將待檢樣中的PBMC與活化的正常人PBMC共同培養(yǎng)，監(jiān)測病毒的生長狀況，結(jié)果表示為IUPM（即每百萬單核細(xì)胞的感染單位）。該法需要復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)試劑和設(shè)備以及更為復(fù)雜的樣本收集處理方法且變異度比核酸擴(kuò)增大[15]。

2.4 血漿P24抗原檢測： 病毒載量可通過ELISA檢測HIV-1核心蛋白P24抗原測得。除HIV感染急性期和疾病進(jìn)展到后期，P24抗原一般測不到的。P24抗原的水平與血漿HIV-1RNA并沒有很好的相關(guān)[7]。故其應(yīng)用受限。

3 前景展望

隨著艾滋病防治工作的深入，HIV核酸檢測得到了充分的重視，那么相關(guān)技術(shù)有望在哪些方面取得突破？

3.1 （bDNA）檢測法無擴(kuò)增物的交叉污染，這較PCR是大進(jìn)步。bDNA有數(shù)十個(gè)覆蓋整個(gè)基因組的探針，方便檢測HIV某些變異株，但靈敏度不及PCR，提高bDNA靈敏度是未來發(fā)展大難點(diǎn)[12]。

3.2 （NASBA）法是由一對(duì)引物介導(dǎo)連續(xù)均一體外特異性核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增RNA的新技術(shù)。但還存在由于敏感性高造成的假陽性和特異性高造成的假陰性的問題[13]。如何在檢測方法上改進(jìn)使NASBA標(biāo)準(zhǔn)化，是今后的發(fā)展方向。

3.3 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TMA）是利用RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶等溫條件下擴(kuò)增RNA或DNA的系統(tǒng)。最近研究表明，該方法用于HIV定量檢測，靈敏度高于RT-PCR和bDNA方法。

3.4 連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR）是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴(kuò)增技術(shù)，是繼PCR后新發(fā)展的一種體外擴(kuò)增技術(shù)[10]。LCR擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高。產(chǎn)物檢測方便、敏感。因此是檢測已知序列中點(diǎn)突變的最佳方法。有望用于HIV遺傳學(xué)研究[11]。

3.5 多聚酶鏈反應(yīng)檢測法：檢測HIV-RNA，先利用逆轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR技術(shù)特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物[6]。每完成1個(gè)循環(huán)需2～4 min，2～3 h就能將待擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。此方法非常敏感，極微量的污染即可導(dǎo)致假陽性，尤其用于檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，用雜交方法來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是鑒定特異性擴(kuò)增最好的方法。今后建立一種非同位素的敏感而又簡單快速的PCR產(chǎn)物雜交檢測方法將進(jìn)一步推動(dòng)PCR的應(yīng)用。

3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量。實(shí)現(xiàn)了PCR從半定量到定量的飛躍，它具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、有效解決了PCR污染問題等特點(diǎn)。但是無論是相對(duì)定量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法仍存在PCR普遍存在的問題有待解決，在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，標(biāo)準(zhǔn)品的制備目前無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性[8]。另外，由于運(yùn)用了封閉檢測，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測，因此不能檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。灰?yàn)闊晒馑氐姆N類以及檢測光源的局限性，限制了該技術(shù)復(fù)合式檢測的應(yīng)用能力，使用成本較高限制推廣。

目前有基因擴(kuò)增（PCR）或信息擴(kuò)散（bDNA）兩大類方法來檢測機(jī)體血漿或血清中HIV含量。前一種方法的敏感性優(yōu)于后一種，但后一種檢測操作簡便，省去基因擴(kuò)增步驟，假陽性概率大大減少。同一病人或感染者不同時(shí)間盡量采用同一方法以便于比較[9]。

總之， HIV病毒載量的方法各有優(yōu)勢，在允許的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)結(jié)果有高度相關(guān)性，也具有較高的敏感性和重復(fù)性。但同一份樣本的不同檢測方法測得的絕對(duì)值卻不能直接比較，提示不同的實(shí)驗(yàn)室和方法之間仍有很大的差別，因此檢測病毒載量必須始終在相同實(shí)驗(yàn)室使用相同的方法。

參考文獻(xiàn)

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