低分子肝素、N-乙酰半胱氨酸干預(yù)對(duì)COPD大鼠氣道重塑的影響

衛(wèi)小紅，王軍輝，Asmitanand Thakur，馬愛群，張?jiān)鲨F

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院內(nèi)科急診科，河北邢臺(tái) 054031；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 7100614. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院地方病研究所，陜西西安 710061)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)反復(fù)急性發(fā)作導(dǎo)致的氣道重塑使病情不斷進(jìn)展，最終引起呼吸衰竭和肺源性心臟病[1]。低分子肝素(low molecular weight heparin, LMWH)及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)干預(yù)對(duì)COPD氣道重塑的影響引起了人們的關(guān)注。本研究通過對(duì)COPD動(dòng)物模型支氣管形態(tài)學(xué)和膠原纖維沉積的觀察，探討LWMH、NAC干預(yù)下COPD的氣道重塑情況。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源實(shí)驗(yàn)用普通級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，鼠齡6～8周，平均體質(zhì)量(219±32)g。由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑及儀器富露施(NAC)購自海南贊邦制藥有限公司；脂多糖(LPS)購自美國SIGMA公司；自制大鼠氣管插管、吸煙三通管及大鼠熏煙箱(53 cm×38 cm×31 cm)；高速低溫離心機(jī)購自Centifuge 5180R Eppendorf；旋渦振蕩儀購自上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；大鼠灌胃器由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；Leica QWin圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)購自德國LEICA公司。

1.3方法

1.3.1COPD動(dòng)物的分組、模型制備及藥物干預(yù) 按照每組8只隨機(jī)分5組，包括健康對(duì)照組(C組)(室內(nèi)正常喂養(yǎng)，不予任何干預(yù))、COPD模型組(M組)、低分子肝素干預(yù)組(L組)(對(duì)模型鼠行LMWH干預(yù))、NAC干預(yù)組(N組)(對(duì)模型鼠行NAC干預(yù))、低分子肝素聯(lián)合NAC干預(yù)組(LN組)(對(duì)模型鼠行LMWH和NAC干預(yù))。

①COPD模型鼠的制備。第1、8、15、21天向大鼠氣管內(nèi)灌注LPS。先向腹腔內(nèi)注射100 g/L水合氯醛0.3 mL/100g，鉗夾四肢無反應(yīng)后固定，牽舌，氣管插管插入后使另一端入液面下，見液平隨呼吸上下運(yùn)動(dòng)視為插管成功，隨后氣管內(nèi)快速灌注LPS 200 μL(1 μg/μL)后將操作臺(tái)豎起、旋轉(zhuǎn)數(shù)周。第2～7、9～14、16～20、22～28天將大鼠置入熏煙箱中熏4支香煙，每日1次，每次30 min。

②藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)大鼠。L組：煙熏前半小時(shí)LMWH(100 U/mL)皮下注射(200 U/kg)。N組：煙熏前半小時(shí)NAC(10 mg/mL)灌胃(50 mg/只)。LN組：同時(shí)上兩種方法處置。

1.3.2動(dòng)物處死、標(biāo)本采集及處理 ①動(dòng)物處死：第28天同前方法麻醉并固定大鼠，腹部去毛及皮膚消毒后打開腹腔，以一次性10 mL注射器進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血至大鼠失血而死亡。②肺組織標(biāo)本采集及處理：結(jié)扎右肺中葉以外其它肺葉。以12 cm H2O壓力向右肺中葉灌注中性甲醛溶液，余右肺葉分別裝入凍存管，液氮處理后，-70 ℃冰箱凍存。右肺中葉經(jīng)甲醛溶液固定48 h后，沿右肺中葉支氣管走行垂直方向肺葉最寬處切取厚度8 mm的肺組織備用。蒸餾水浸泡2 h，700 mL乙醇保存。常規(guī)梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋。③切片制備及染色：中性甲醛液固定標(biāo)本，切片厚度5 μm，常規(guī)脫臘至水。蘇木精-伊紅(HE)染色、天狼猩紅染色。脫水、透明、中性樹膠封片。

1.3.3主要觀察指標(biāo)和方法 ①大鼠的一般情況：外觀、活動(dòng)能力、體質(zhì)量的改變。②肺組織標(biāo)本：肉眼及光鏡下病理學(xué)改變，以圖像分析系統(tǒng)采集圖像。③支氣管形態(tài)學(xué)改變：每張切片中隨機(jī)選取3個(gè)內(nèi)周長(zhǎng)<1 000 μm、長(zhǎng)徑/短徑≤2且較規(guī)整的小支氣管橫截面，依據(jù)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量氣道外壁所圍面積(outer adventitial area, Ao)和管腔內(nèi)側(cè)的面積(inner adventitial area, Ai)及內(nèi)周長(zhǎng)(inner perimeter, Pi)。管壁總面積(WAt)=Ao-Ai。以管壁內(nèi)周長(zhǎng)(Pi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以單位長(zhǎng)度的管壁面積(WAt/Pi,μm2/μm)表示管壁厚度。④氣道膠原沉積：在偏振光顯微鏡下觀察天狼猩紅染色后氣道黏膜下膠原沉積。Ⅰ型膠原纖維排列緊密、粗大，呈強(qiáng)雙折光黃色或橘紅色(纖維直徑越粗紅色越明亮)；Ⅲ型膠原纖維排列疏松、纖細(xì)，呈弱雙折光亮綠色。在偏振光顯微鏡下底片成像(×100)。

2結(jié)果

2.1大鼠的一般情況及肺組織大體標(biāo)本所見各實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)時(shí)體質(zhì)量最高224 g，最低217 g，之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。C組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)最為迅速，余4組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，以M組體質(zhì)量增長(zhǎng)最為緩慢，但組間外觀差異不明顯(圖1)。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體質(zhì)量的變化趨勢(shì)

C組大鼠毛發(fā)白凈潤(rùn)澤、光澤度高，活動(dòng)能力強(qiáng)，飲食量正常；余4組大鼠毛發(fā)枯黃干澀，神情倦怠，活動(dòng)減少，飲食量亦減少。實(shí)驗(yàn)中N組1只雄性大鼠第3天因NAC灌胃時(shí)誤入氣管致死；M組1只雄性大鼠在第23天熏煙時(shí)卡在分隔鐵絲網(wǎng)與箱壁之間窒息死亡；LN組第26天1只雌性大鼠因灌胃時(shí)損傷咽部致不能飲水及進(jìn)食后死亡。其余實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。C組大鼠兩肺表面光滑，呈淡粉色，打開胸腔后很快萎縮；M組兩肺體積明顯增大，顏色蒼白，開胸后肺臟萎陷不明顯；L組、N組和LN組大鼠肺組織呈輕度膨脹狀態(tài)，顏色蒼白，開胸后肺臟萎陷遜于C組。

2.2大鼠肺組織HE染色所見C組支氣管黏膜上皮細(xì)胞完整，纖毛排列整齊，未見腺體增生及明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔未見病理性擴(kuò)大。M組支氣管黏膜上皮部分脫落，皺襞增多變長(zhǎng)，突入管腔。管壁大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞；肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，壁變薄或斷裂，部分呈囊狀擴(kuò)張，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合，支氣管壁及肺血管壁增厚。L組、N組及LN組支氣管少量上皮脫落，支氣管黏膜皺襞及管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較前減輕；肺泡輕度膨大，肺泡壁變薄，部分形成大泡(圖2)。

圖2 各組大鼠肺組織標(biāo)本的HE染色Fig.2 HE specimens of rat lung tissue under the microscope in each group (×200)A:健康對(duì)照組;B:COPD模型組;C:LM-WH干預(yù)組;D:NAC干預(yù)組;E:NAC聯(lián)合LMWH干預(yù)組。

2.3大鼠支氣管的形態(tài)學(xué)改變各實(shí)驗(yàn)組管壁厚度均大于C組(P<0.01)。L組、LN組管壁厚度小于M組(P<0.01)，其中以LN組減少最為明顯，N組亦有管壁厚度減少但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

各實(shí)驗(yàn)組管壁內(nèi)周長(zhǎng)之間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.4支氣管黏膜下膠原纖維的沉積于偏振光顯微鏡下可見呈粗大黃色或橘紅色的Ⅰ型膠原沉積。L組和N組與M組比較，氣道膠原沉積減少，而LN組更趨減少(圖3)。

圖3 各組偏振光顯微鏡下支氣管壁膠原纖維的沉積情況Fig.3 Collagen deposition under the polarization microscope in each group (×100)A:健康對(duì)照組;B:COPD模型組;C:LM-WH干預(yù)組;D:NAC干預(yù)組;E:NAC聯(lián)合LMWH干預(yù)組。

表1 各組大鼠支氣管形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果的比較

與C組比較，*P<0.01；與M組比較，▲P<0.01；與L組比較，■P<0.01；與N組比較，△P<0.01。

3討論

氣道重塑是COPD病情不斷進(jìn)展最終引起呼吸衰竭和肺源性心臟病的主要原因。鼠與人類基因極為相似，實(shí)驗(yàn)操作易于操控，以熏香煙[2]及LPS灌注[3]模擬人類COPD發(fā)病的環(huán)境因素使其成為COPD動(dòng)物模型的最佳選擇。本實(shí)驗(yàn)各組大鼠排除了性別及體重對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，采用時(shí)間和劑量不同于他人的氣管內(nèi)注入LPS和熏香煙的方法，在較短的時(shí)間內(nèi)成功地制備了一般情況及病理改變符合COPD的大鼠模型。

支氣管肺組織的炎癥、損傷、修復(fù)、重塑是COPD不斷進(jìn)展的病理基礎(chǔ)，以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和小氣道平滑肌層增厚作為氣道重塑的主要表現(xiàn)，其結(jié)果導(dǎo)致肺功能持續(xù)和進(jìn)行性損害[4]。COPD氣道重塑的機(jī)制尚未闡明，一般認(rèn)為與炎癥[5]、氧化應(yīng)激[6]、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及細(xì)胞凋亡[7]等導(dǎo)致的損傷和修復(fù)有關(guān)。目前，認(rèn)為對(duì)氣道組織學(xué)直接評(píng)估是評(píng)估COPD氣道重塑較準(zhǔn)確的方法[8]。本研究通過HE染色觀察COPD大鼠氣道壁病理學(xué)改變，以圖像采集分析系統(tǒng)檢測(cè)氣道壁厚度以及天狼猩紅染色觀察氣道壁總膠原量，發(fā)現(xiàn)了M組大鼠氣道壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、管壁厚度和膠原沉積都超過了對(duì)照組。

LMWH除具有抗凝血、抗血栓作用外，還具有抗炎、抗臟器纖維化及抗平滑肌增生等作用，其中抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用是因?yàn)槠湟种屏巳祟惣按笫笾夤芷交〖?xì)胞DNA的合成，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合生長(zhǎng)因子受體或直接與生長(zhǎng)因子結(jié)合而抑制生長(zhǎng)因子的調(diào)控作用而致[9-11]。NAC通過抑制NF-κB、TNF-β的激活，從而阻斷炎性因子的釋放而起到抗炎的作用[12]，并通過參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子( TGF-β)信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)面調(diào)節(jié)，降低MMP對(duì)支氣管組織ECM的降解和破壞作用，從而減輕氣道壁細(xì)胞外基質(zhì)重塑和預(yù)防吸煙導(dǎo)致的大鼠小氣道管壁的增厚和通氣彌散的降低[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠的氣道管壁厚度均大于C組，而各藥物干預(yù)組大鼠管壁厚度均小于M組；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后的各組大鼠氣道膠原沉積均少于模型鼠，其中以聯(lián)合用藥組的減少更為顯著。提示LMWH和NAC的干預(yù)可以減輕COPD氣道重塑且以LMWH聯(lián)合NAC更為明顯，LMWH和NAC在作用機(jī)制上的差異可能使其聯(lián)合應(yīng)用更有意義。

綜上所述，以熏香煙和脂多糖法可在較短的時(shí)間制備出滿意的COPD大鼠模型。 LMWH、NAC干預(yù)尤其是聯(lián)合應(yīng)用可通過不同作用機(jī)制減輕COPD發(fā)病過程中氣道壁厚度及氣道膠原沉積，進(jìn)而減輕COPD氣道重塑。

參考文獻(xiàn)：

[1] VESTBO J, HURD SS, AGUSTI AG, et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(4):347-365.

[2] MIZUTANI N, FUCHIKAMI J, TAKAHASHI M, et al. Pulmonary emphysema induced by cigarette smoke solution and lipopoly saccharide in guinea pigs [J]. Biol Pharm Bull, 2009, 32(9):1559-1564.

[3] BRASS DM, HOLLINGSWORTH JW, CINQUE M, et al. Chronic LPS inhalation causes emphysema-like changes in mouse lung that are associated with apoptosis[J]. Am J Resp Cell Mol Biol, 2008, 39(5):584-590.

[4] TAM A, SIN DD. Pathobiologic mechanisms of chronic obstructive pulmonary disease [J]. Med Clin North Am, 2012, 96(4):681-698.

[5] LAPPERRE TS, WILLEMS LN, TIMENS W, et al. Small airways dysfunction and neutrophilic inflammation in bronchial biopsies and BAL in COPD[J]. Chest, 2007, 131(1):53-59.

[6] FOSCHINO BARBARO MP, CARPAGNANO GE, SPANEVELLO A, et al.Inflammation, oxidative stress and systemic effects in mild chronic obstructive pulmonary disease[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2007, 20(4):753-763.

[7] BRAJER B, BATURA-GABRYIL H, NOWIEKA A, et al. Concentration of matrix etalloproteinase-9 in serum of patients with chronic obstructive pulmonary disease and degree of airway obstruction and disease progression[J]. Physiol Pharmacol, 2008, 59(6):145-152.

[8] 莫碧文，張貞貞，韋江紅，等. 脂多糖對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥、氣道重塑及TLR4表達(dá)的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(2):153-157.

[9] WAN MX, ZHANG XW, TRKVIST L, et al. Low molecular weight heparin inhibits tumor necrosis factor alpha-induced leukocyte rolling[J]. Inflamm Res, 2001, 50(12):581-584.

[10] KUBO H, NAKAYAMA K, YANAI M, et al. Anticoagulant therapy for idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Chest, 2005, 128(3):1475-1482.

[11] CAO G, WU JX, WU QH. Low molecular weight heparin suppresses lymphatic endothelial cell proliferation induced by vascular endothelial growth factor Cinvitro[J]. Chin Med J (Engl), 2009, 122(13):1570-1574.

[12] WANG HW, YANG W, LU JY, et al. N-acetylcysteine administration is associated with reduced activation of NF-κB and preserves lung dendritic cells function in a zymosaninduced generalized inflammation model[J]. J Clin Immunol, 2013, 33(3):649-660.

[13] LI HM, CUI DI, TONG X, et al. The effect of N-acetylcysteine and other agents on the role of matrix metalloproteinases in airway remodeling of COPD rat models[J]. Med J Chin PLA, 2002, 27(7):593-596.