人附睪分泌蛋白4在卵巢上皮性腫瘤中的表達及其臨床意義

石少鳳，田德明，黃文斌，懷建國，王勁松

(1.蕪湖市第一人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科,安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市第一人民醫(yī)院 病理科,安徽 蕪湖 241000；3.南京市第一醫(yī)院 病理科，江蘇 南京 210006)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率雖然低于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但病死率卻居婦科惡性腫瘤的首位[1]。大多數(shù)卵巢癌患者出現(xiàn)臨床癥狀時已處于進展期，而早期卻沒有特異性臨床診斷標記物，因而開發(fā)新的卵巢癌診斷標記物是早期發(fā)現(xiàn)和診斷卵巢癌的重要措施。人附睪分泌蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的卵巢癌早期診斷的標志物，與CA125聯(lián)合檢測是提高卵巢癌的診斷率，監(jiān)測術(shù)后治療效果以及預測是否復發(fā)的重要指標[2-4]。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于HE4與卵巢癌的研究，大多集中于血清學檢測，而在卵巢癌組織中的研究相對較少。本文應用免疫組化EnVision法檢測卵巢上皮性良惡性腫瘤中HE4表達，探討HE4在卵巢癌中的表達及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集蕪湖市第一人民醫(yī)院病理科和南京市第一醫(yī)院病理科2009年1月～2013年9月間經(jīng)病理確診的卵巢良性、交界性和惡性上皮性腫瘤存檔蠟塊共90例。其中卵巢上皮性良性腫瘤20例(漿液性囊腺瘤和黏液性囊腺瘤各10例)、交界性腫瘤15例(漿液性交界性腫瘤10例、黏液性交界性腫瘤5例)和惡性上皮性腫瘤55例(漿液性癌25例、子宮內(nèi)膜樣腺癌15例、透明細胞癌10例和黏液性腺癌5例)。55例卵巢癌根據(jù)FIGO進行臨床分期，其中Ⅰ期28例、Ⅱ期20例、Ⅲ期7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。所有病例術(shù)前均未行放療和化療。

1.2 試劑 兔抗人HE4多克隆抗體為英國Abcam公司產(chǎn)品，抗體稀釋度為1∶40，購自廈門泉輝生物有限公司。EnVision檢測試劑盒為美國Dako公司產(chǎn)品，購自南京大鳥科技有限公司。DAB顯色液購自福建邁新生物公司。

1.3 免疫組織化學方法 所有標本均采用10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片后行免疫組化染色。免疫組化采用EnVision法，切片脫蠟、梯度酒精脫水后，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性生物素酶，高壓鍋高溫高壓抗原修復，抗原修復液為枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)，滴加一抗，4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜；滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固，鏡下觀察。以附睪組織作為HE4陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 HE4免疫組化陽性表達為腫瘤上皮細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒狀信號。HE4陽性結(jié)果的評價根據(jù)染色強度和陽性細胞百分比采用二次計分法進行評分。先根據(jù)HE4陽性信號強度進行打分，即陰性為0分、淡黃色為1分、黃色為2分、棕黃色為3分；然后觀察整個切片，根據(jù)陽性細胞百分比進行打分，0分為陰性、陽性細胞數(shù)≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。上述二者評分的乘積作為最終積分，積分≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，HE4表達與臨床病理指標之間的關(guān)系采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 HE4在良性、交界性和惡性卵巢上皮性腫瘤中的表達 HE4陽性信號位于腫瘤性上皮的細胞質(zhì)(圖1)。由表1可知，HE4在卵巢癌中的陽性表達率為83.6%(46/55)，明顯高于交界性腫瘤(53.3%，8/15)和良性腫瘤(15.0%，3/20)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.032；χ2=30.507，P<0.01)。卵巢交界性腫瘤中HE4表達高于良性腫瘤，二者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)。

A：HE4在卵巢良性上皮性腫瘤中表達陰性；B：HE4在卵巢交界性上皮性腫瘤中表達陽性；C：HE4在卵巢惡性上皮性腫瘤中表達陽性

圖1 HE4在卵巢良性、交界性和惡性上皮性腫瘤中的表達(Envision×400)

表1 HE4在良性、交界性和惡性上皮性腫瘤中的表達

2.2 HE4在卵巢上皮性腫瘤中的表達分布 由表2可知，在卵巢良性和交界性上皮性腫瘤中，HE4僅見于漿液性腫瘤，而黏液性腫瘤均不表達。卵巢惡性上皮性腫瘤中，HE4主要表達于卵巢漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌，而黏液性癌僅1例局灶陽性表達，透明細胞癌中HE4表達介于漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌與黏液性癌之間。

表2 HE4在卵巢上皮性腫瘤的表達分布

2.3 卵巢癌中HE4表達與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系 隨著卵巢癌FIGO分級提高，HE4陽性表達率也逐漸增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.104)。HE4在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌中的表達與不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.585)。卵巢癌中HE4表達與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系見表3。

表3 HE4表達與卵巢癌FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系

臨床病理指標例數(shù)HE4表達+-陽性率(%)FIGO分期Ⅰ2821775Ⅱ2018290Ⅲ770100淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有770100無4839981 3

3 討論

HE4首次在人遠端附睪上皮中被發(fā)現(xiàn)，最初被預測為一種參與精子成熟的蛋白酶抑制因子[5-6]。該基因也稱為WFDC2，編碼具有一個WAP型4二硫鍵核心(WFDC)結(jié)構(gòu)域的蛋白。HE4因與WFDC蛋白家族中已知的白細胞蛋白酶抑制因子具有同源性和相當?shù)霓D(zhuǎn)錄譜，而被認為在天然免疫中也具有作用。HE4與卵巢癌的關(guān)系最近得到了較多的研究和重視，與正常卵巢組織相比，HE4在卵巢癌中呈持續(xù)的過表達。然而，目前關(guān)于HE4和卵巢癌中的相關(guān)研究大多集中于血清學方面，而關(guān)于組織中HE4表達情況的研究較少。

Drapkin等[7]最早對HE4在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達進行了研究，他們研究發(fā)現(xiàn)HE4不表達于卵巢表面上皮，而表達于卵巢包涵囊腫，他們同時研究發(fā)現(xiàn)在卵巢外其他正常組織中，HE4可表達于呼吸道上皮，偶爾見于腎近曲小管和涎腺導管上皮，而胃腸道、肝臟、胰腺、脾臟、淋巴結(jié)和間葉組織、乳腺和腦組織中不表達。在該研究中，作者們還發(fā)現(xiàn)HE4高度表達于卵巢漿液性腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌中，而在10例黏液性癌中，僅有1例表達，透明細胞癌中HE4表達介于它們之間。Galgano等[8]應用免疫組化結(jié)合組織微陣列技術(shù)研究了HE4在人類正常和惡性腫瘤組織中的表達，結(jié)果顯示HE4在女性生殖道正常上皮表達陽性，乳腺上皮中不同程度表達，前列腺、腎小管、支氣管、輸精管、涎腺、淚腺、汗腺、結(jié)腸和胰腺腺泡細胞可有HE4表達。在惡性腫瘤中，HE4主要表達于卵巢漿液性腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌，而黏液腺癌表達陰性，在非卵巢惡性腫瘤中，HE4主要見于子宮內(nèi)膜樣腺癌和肺腺癌。我們的研究結(jié)果也顯示，HE4主要表達于卵巢漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌，而黏液性腫瘤中僅有1例黏液性癌局灶性表達，這些研究結(jié)果提示HE4可相對特異性表達于卵巢上皮性惡性腫瘤中，可作為診斷卵巢來源的一個相對比較特異性標記物。由于漿液性腫瘤和子宮內(nèi)膜樣腺癌均屬于苗勒上皮來源的腫瘤，我們的研究結(jié)果提示HE4表達可能是苗勒上皮來源腫瘤的一個相對特異性標記物，對于臨床上手術(shù)無法切除的卵巢癌患者，小活檢標本中腫瘤細胞表達HE4，結(jié)合其他標記物可有助于卵巢癌的組織學分型，從而更好地指導臨床治療。

我們應用免疫組化方法研究了HE4在卵巢良性、交界性和惡性腫瘤中的表達，結(jié)果顯示HE4在卵巢癌中的表達明顯高于良性和交界性腫瘤，交界性腫瘤高于良性腫瘤，差異具有統(tǒng)計學意義。Georgakopoulos等[9]最近研究發(fā)現(xiàn)HE4高度表達于惡性卵巢腫瘤和一些良性與交界性卵巢腫瘤中。國內(nèi)王丹丹等[10]研究結(jié)果顯示HE4在正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤中不表達或部分表達，在卵巢癌組織中表達明顯增高。根據(jù)國內(nèi)外文獻結(jié)合本文研究結(jié)果，提示HE4在早期卵巢癌中表達，大量表達的HE4可能通過EGFR-MAPK信號通路的活化而促進了卵巢上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化[10]。

HE4表達與卵巢癌臨床病理指標之間的關(guān)系研究中，王丹丹等[11]研究發(fā)現(xiàn)早期卵巢癌中HE4表達高于中晚期，中、低分化卵巢癌高于高分化卵巢癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。周留林等[12]研究了卵巢漿液性腫瘤中HE4表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HE4表達與卵巢漿液性癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。郭冰沁等[13]研究結(jié)果也顯示HE4陽性表達隨卵巢癌病理分級增高而增高，臨床分期越高，其陽性表達率也越高，且有腹腔擴散或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者卵巢癌中HE4表達明顯高于無腹腔擴散和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者。最近周磊等[14]應用RNA干擾技術(shù)對HE4干擾后的卵巢癌細胞系的生物學行為進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HE4干擾所致的HE4表達下調(diào)可降低卵巢癌細胞的粘附和侵襲能力，這些研究結(jié)果高度提示HE4表達是卵巢癌具有高度侵襲性行為的一個標志。雖然我們的實驗結(jié)果未能發(fā)現(xiàn)HE4表達與卵巢癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，但我們目前的實驗結(jié)果顯示HE4表達隨著臨床分期增高而增高，一定程度上提示HE4表達可能反映卵巢癌的臨床生物學行為，需待以后擴大病例數(shù)進一步分析研究。

總之，我們的研究結(jié)果顯示HE4主要表達于卵巢漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌，且在卵巢惡性上皮性腫瘤表達明顯高于卵巢交界性和良性上皮性腫瘤，提示HE4不僅是卵巢惡性上皮性腫瘤的一個診斷標記物，還可能是卵巢苗勒管起源的上皮性腫瘤標志物。

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