Sp2對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響及Cyclin D1的表達(dá)變化

袁 淵，鄭鵬生，周 敏，姚安梅，王 靜

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061；2.陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，陜西西安 710061)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐漸上升和年輕化[1]。全世界每年有50萬患者發(fā)病，其中我國為10萬人。目前，盡管采取了包括手術(shù)切除、化學(xué)治療、放射治療以及其他綜合性的治療措施，但是其治療效果仍不盡人意。宮頸癌的發(fā)生涉及癌基因/抑癌基因的異常激活/雜合性丟失、免疫改變、表觀遺傳學(xué)改變等，是一個多因素、多階段的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程。從分子水平闡述宮頸癌的發(fā)病機制，篩選治療的分子指標(biāo)，為宮頸癌治療提供新的分子靶標(biāo)，是目前宮頸癌研究的熱點和難點之一。

轉(zhuǎn)錄因子Sp2(transcription factor 2, Sp2)是Sp蛋白家族中的一員。Sp家族蛋白是一類DNA結(jié)合蛋白，通過調(diào)控富含GC/TC序列的啟動子的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種功能的調(diào)節(jié)[2]。研究表明Sp1可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)從而影響多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。而轉(zhuǎn)錄因子Sp2與腫瘤的關(guān)系鮮見報道。本研究旨在檢測Sp2在宮頸癌組織中的表達(dá)并應(yīng)用siRNA沉默Sp2基因表達(dá)，分析其對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響，觀察細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1表達(dá)的變化，探討Sp2對宮頸癌細(xì)胞增殖影響的分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑及儀器宮頸癌組織和正常宮頸組織樣本均收集于陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科；宮頸癌Hela細(xì)胞由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院教育部環(huán)境與基因相關(guān)疾病重點實驗室提供。RPMI-1640和新生牛血清購于美國Gibco公司；MTT、RnaseA、胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)購于美國Sigma公司；Sp2 siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計與合成；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒購于美國BD Bioscience公司；Sp2一抗、Cyclin D1一抗、β-actin一抗及二抗均購于美國Santa Cruz公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購于美國Pierce公司；RIPA裂解液購于碧云天公司；Lipofectamine2000和Trizol Reagent購自于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa ExTaqHS和SYBR Premix ExTaqTM kit購于中國TaKaRa公司。高通量多功能微板測試系統(tǒng)(德國BMG Labtechnologies公司)；FASCalibar流式細(xì)胞儀(美國FALS CALIBAR BD公司)；GBOX-HR全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(英國SYNGENE公司)；iQ5 Multicolor Real-Time PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2宮頸癌HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。胰酶消化、傳代。

1.3siRNA轉(zhuǎn)染依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將HeLa細(xì)胞用無抗生素含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度接種于96或6孔板中，置37 ℃孵箱中培養(yǎng)過夜。將Sp2 siRNA(sense-5′GCUUAAGCAAAGGAAAUCUUU-3′，antisense-5′AGAUUUCCUUUGCUUAAGCUU-3′)和negative siRNA(NC-siRNA，sense-5′UUCUCCGA-ACGUGUCACGUTT-3′，antisense-5′ACGUGACA-CGUUCGGAGAATT-3′)瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，在無血清、無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)4～6 h后，換新鮮的含100 mL/L血清的RPMI-1640全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3 d后備用。

1.4MTT比色法檢測細(xì)胞增殖將對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞以1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，次日瞬時轉(zhuǎn)染。實驗分組：對照、NC-siRNA(50 nmol/L)、siRNA(25、50、75 nmol/L)組。每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3 d后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，在POLARstar+OPTIMA微板測試儀上檢測光吸收值，檢測波長為490 nm。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期收集轉(zhuǎn)染2 d后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次。加入250 μL PBS重懸細(xì)胞，再逐滴加入750 μL無水乙醇并同時不斷搖動離心管，在4 ℃過夜固定；PBS洗滌1次；加入100 μg/mL的無DNase的RNaseA 0.3 mL，重懸細(xì)胞；再加入100 μg/mL PI染液0.3 mL，混合均勻，室溫下避光孵育20 min；流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，PI的紅色熒光通過630 nm的濾光片收集，用BD FACSort Cellquect軟件獲取數(shù)據(jù)，用Modfit LT軟件分析DNA含量變化。

1.6Annexin-PI染色檢測細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染2 d后收集細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次。用結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞使其細(xì)胞密度為1×105/mL。取100 μL的細(xì)胞懸液入5 mL流式管中，再加入Annexin V/FITC和20 μg/mL PI各5 μL，避光混勻，孵育20 min。加入400 μL PBS，用流式細(xì)胞儀檢測，光源為488 nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光，結(jié)果用隨機軟件分析。

1.7Real-timePCR檢測Sp2和CyclinD1表達(dá)臨床組織標(biāo)本和轉(zhuǎn)染2 d后的各組細(xì)胞用Trizol法提取總RNA。取總RNA 2.0 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，oligo(dT)18 1 μL(0.5 μg)，5×Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，Rnase 0.5 μL，補去離子水至20 μL，MMuLV 2 μL。42 ℃ 15 min；95 ℃ 2 min；終止反應(yīng)。依據(jù)人HeLa細(xì)胞Sp2和Cyclin D1 cDNA序列，設(shè)計Real time PCR引物。Sp2上游引物：5′-AGCGCATATTGCAAAAGTTCAGA-3′，Sp2下游引物：5′-TCGTTACAGCCGCATGCCAATACT-3′；Cyclin D1上游引物：5′-TGATGCTGGGCACTTCATCTG-3′，Cyclin D1下游引物：5′-TCCAATCATCCCGAATGAGAGTC-3′；β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，β-actin下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。Real-time PCR擴增條件：94 ℃變性2 min，按94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s；30個循環(huán)，再于72 ℃延伸10 min。用2-△△Ct法對Real-time PCR的結(jié)果進(jìn)行相對定量統(tǒng)計，2-△△Ct表示處理組相對于對照組的擴增倍數(shù)。其中ΔΔCt=(實驗組Ct值―內(nèi)參Ct值)―(對照組Ct值―內(nèi)參Ct值)。

1.8免疫蛋白印跡(Westernblot)檢測Sp2和CyclinD1表達(dá)收集臨床組織標(biāo)本和轉(zhuǎn)染2 d后的各組細(xì)胞，置入RIPA細(xì)胞裂解液中提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。變性后取50 μg蛋白，在100 g/L十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝膠( SDS-PAGE)電泳后，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，依分子質(zhì)量大小切取條帶，脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h，分別加入Sp2鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、Cyclin D1鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、β-actin兔單克隆抗體(1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次。然后與HRP標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗(1∶2 500稀釋) 室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑，置于Syngene G Box凝膠成像儀的暗箱中拍照。應(yīng)用英國SYNGENE公司的GeneTools軟件分析，計算條帶的積分吸光度(A)值進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1Sp2在人宮頸癌組織中的表達(dá)的變化與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中Sp2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P=0.004，n=35，圖1A)，同樣Sp2蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)(P<0.007，n=35，圖1B)。

圖1人宮頸癌組織中Sp2表達(dá)的變化

Fig.1Expression of Sp2 in human cervical cancer tissues

A：Real time PCR結(jié)果；B：Western blot結(jié)果。1：正常宮頸組織；2：宮頸癌組織。與正常宮頸組織比較，*P<0.05，n=35。

2.2Sp2對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖活力的影響MTT比色法檢測Sp2 siRNA(25、50、75 nmol/L)分別在轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞1、2、3 d后對細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果顯示與對照組相比較，Sp2 siRNA(50 nmol/L)在作用2、3 d后降低了宮頸癌HeLa增殖活力(P=0.006，n=3×5)；Sp2 siRNA(75 nmol/L)在作用1、2、3 d后降低了HeLa增殖活力(P<0.004，n=3×5，圖 2)。

圖2MTT比色分析Sp2對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響

Fig.2 MTT assay of effects of Sp2 on the proliferation of human cervical carcinoma HeLa cells

與對照組比較，*P<0.05。

2.3流式細(xì)胞儀檢測Sp2對宮頸癌HeLa細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響Sp2 siRNA(50 nmol/L)組與對照組相比，G1/G0期細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.004，n=3×5)，S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P=0.006，n=3×5)，G2/M期細(xì)胞數(shù)量也顯著減少(P<0.008，n=3×5)，說明Sp2 siRNA(50 nmol/L)將HeLa細(xì)胞阻滯在G1/G0期，抑制了細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂(圖3)。

圖3Sp2對人宮頸癌HeLa細(xì)胞周期的影響

Fig.3 Effects of Sp2 on cell cycle of human cervical carcinoma HeLa cells

與對照組比較，*P<0.05。

應(yīng)用Annexin V+PI試劑盒染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，顯示Sp2 siRNA(50 nmol/L)組與對照組相比，正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞均沒有顯著差異(圖4)。

圖4Sp2對人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響

Fig.4 Effects of Sp2 on apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells

1：正常細(xì)胞；2：早期凋亡細(xì)胞；3：晚期凋亡細(xì)胞；4：壞死細(xì)胞。

2.4宮頸癌HeLa細(xì)胞Sp2和CyclinD1表達(dá)變化與對照組相比，Sp2 siRNA組的Sp2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P=0.006，n=3×5，圖5A)，Cyclin D1 mRNA的表達(dá)也顯著下調(diào)(P=0.007，n=3×5，圖5B)；同時，Sp2 siRNA組的Sp2和Cyclin D1在蛋白水平的表達(dá)也顯著下調(diào)(圖5C)。

3 討 論

Sp家族成員包括Sp1-9，均具有相似的結(jié)構(gòu)域，能夠識別并作用于DNA序列的G-豐富元件，如GC2盒(GGGGCGGGG) 及其相近的GT/CACCC2盒(GGTGTGGGG)，作為轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄[5-7]。GC/GT盒是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中重要的順式作用元件[8]，常以多拷貝形式分布于基因的啟動子和/或增強子中。Sp1對GC盒有很強的親和力，是眾多基因的基本轉(zhuǎn)錄因子，參與包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化和新生物的轉(zhuǎn)化等。

圖5Sp2對CyclinD1表達(dá)的影響

Fig.5 Effects of Sp2 on the expression of Cyclin D1

A：Sp2 mRNA表達(dá)變化；B：Cyclin D1 mRNA表達(dá)變化；C：Sp2和Cyclin D1蛋白表達(dá)的變化。1：對照組；2：NC-siRNA；3：siRNA(50 nmol/L)。與對照組比較，*P<0.05。

Sp1是調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長的重要轉(zhuǎn)錄因子，其異常表達(dá)通過復(fù)雜機制正向調(diào)節(jié)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。研究報道Sp1在胰腺癌、胃癌、乳腺癌和甲狀腺腫瘤等多種腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá)[9]。研究發(fā)現(xiàn)在同一患者體內(nèi)，腫瘤組織中的Sp1表達(dá)水平顯著高于正常組織，并與腫瘤的浸潤程度呈正相關(guān)，Sp1高表達(dá)的患者中位生存時間明顯短于低表達(dá)或不表達(dá)Sp1的胃癌患者，而下調(diào)Sp1的過表達(dá)能抑制癌細(xì)胞形成腫瘤[10-11]。在不同腫瘤細(xì)胞中，Sp1往往顯示出特異性的作用。例如，在前列腺癌細(xì)胞中，它可以增加基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅰ的表達(dá)水平，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]；在結(jié)腸癌細(xì)胞中，它能增強骨橋蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[13]；在乳腺癌細(xì)胞中，它可以通過與雌激素受體α的相互作用對胰島素樣生長因子產(chǎn)生影響，進(jìn)而作用于癌細(xì)胞[14]；還可以通過與垂體腫瘤轉(zhuǎn)換基因共同作用，促進(jìn)細(xì)胞由靜息態(tài)的G1期進(jìn)入DNA合成的S期[15]，從而啟動細(xì)胞有絲分裂。Sp2在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)，并調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。本研究結(jié)果顯示Sp2在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而采用RNA干擾技術(shù)對Sp2基因進(jìn)行沉默，MTT實驗結(jié)果表明Sp2基因敲除后宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖活力顯著下調(diào)，說明了Sp2能夠促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖。以上均表明Sp家族在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖方面起著非常重要的作用。

細(xì)胞周期中從G1到S期的轉(zhuǎn)換是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的最主要作用節(jié)點[17-18]。M期細(xì)胞比例可說明處于增殖分裂期細(xì)胞的多少；S期細(xì)胞所占比例可表明開始新一輪DNA復(fù)制合成和分裂的細(xì)胞數(shù)量。本研究表明，在正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中，大部分細(xì)胞處于靜息期，少數(shù)細(xì)胞處于DNA復(fù)制合成期和分裂期。在Sp2 siRNA處理HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞的DNA復(fù)制合成與細(xì)胞分裂顯著減少，這說明了Sp2可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的DNA復(fù)制合成與細(xì)胞分裂，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子主要包括D型的Cyclins-Cdk4和Cdk6蛋白激酶復(fù)合體，它們支配通過細(xì)胞周期G1期的細(xì)胞進(jìn)程[19-20]。研究報道，Sp1可通過調(diào)控Cyclin D1的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤生長[10,15]。本研究用siRNA沉默Sp2表達(dá)后，Cyclin D1的表達(dá)顯著下調(diào)。因此，推測Sp2可能通過促進(jìn)Cyclin D1的表達(dá)，調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的DNA復(fù)制合成與細(xì)胞分裂，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。

總之，Sp2在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并可能通過上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。但是，Sp2下游的通路機制非常復(fù)雜，尚需進(jìn)一步研究明確其具體分子機制。

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