PPAR-γ激動劑吡咯列酮對卵蛋白激發(fā)氣道變應(yīng)性炎癥的調(diào)節(jié)作用

方 萍，吳曉明，李滿祥，史紅陽，張永紅，盧佳美

(西安交通大學(xué)：1. 醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西西安 710004；2. 生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710049)

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流阻塞是其主要臨床特征。哮喘患者的氣道炎癥具有多種炎性細胞浸潤，其中以嗜酸粒細胞、肥大細胞為主。上述炎癥細胞激活將會導(dǎo)致一系列前炎癥介質(zhì)和細胞因子釋放，繼而誘發(fā)氣道高反應(yīng)性、基質(zhì)血管通透性增加、炎癥細胞募集以及黏液高分泌。

過氧化物酶增殖激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR)是核激素受體超家族成員之一，廣泛存在于機體的各個器官和組織。目前依據(jù)編碼基因的不同，主要分為3個亞型，PPAR-α、PPAR-β以及PPAR-γ。其中PPAR-γ的激活可下調(diào)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的多種細胞因子。在肺組織中主要表達于氣道上皮細胞、平滑肌細胞、肌成纖維細胞、肺血管內(nèi)皮細胞以及部分炎癥細胞，例如巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞以及肥大細胞[1]。既往研究提示，PPAR-γ可能參與了氣道炎癥的調(diào)節(jié)過程，哮喘患者的氣道黏膜下組織、氣道上皮細胞和平滑肌細胞PPAR-γ表達也較健康人有所增加，已有假說提出哮喘患者PPAR-γ表達增高預(yù)示著機體可能存在某種自身調(diào)節(jié)機制[2-4]。這預(yù)示PPAR-γ激動劑在防治哮喘氣道變應(yīng)性炎癥反應(yīng)方面具有一定應(yīng)用前景。

本研究將采用卵蛋白(OVA)激發(fā)制備氣道變應(yīng)性炎癥反應(yīng)模型，在此基礎(chǔ)上給予PPARγ激動劑吡格列酮(PGZ)干預(yù)，探討其潛在的調(diào)節(jié)作用及機制。

1材料與方法

1.1動物和試劑SPF級Balb/c小鼠42只，雌性，7周齡，體重(18±2)g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

雞卵清蛋白(OVA，Ⅴ級)購于Sigma-Aldrich 公司。PGZ購于日本武田制藥公司。白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素13(IL-13)、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素17A(IL-17A)、嗜酸粒細胞趨化因子(eotaxin)以及巨噬細胞趨化因子-1(MCP-1)的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測(ELISA)試劑盒購于美國R&D公司。血清總IgE、IgG1、IgG2a和OVA特異性IgE、IgG1、IgG2a檢測試劑購自美國BD公司，OVA特異性IgE、IgG1、IgG2a檢測均采用OVA包被的ELISA專用96孔板。

1.2實驗分組將小鼠隨機分3組，PBS對照組(A組)、哮喘模型組(B組)、PGZ干預(yù)組(C組)。

分別于第0天和第7天采用200 μL含有100 μg OVA和2 mg氫氧化鋁的PBS溶液腹腔注射致敏，第14、15、16天采用2.5 g/L OVA 20 μL 經(jīng)鼻給藥進行攻擊。干預(yù)組于第12天至第17天開始給予PGZ 200 μL(10 mg/kg)灌胃。對照組均使用PBS溶液。于最后1次攻擊48 h后處死動物，取血、肺泡灌洗液(BAL)及肺組織待測。

1.3有創(chuàng)方法檢測哮喘小鼠氣道反應(yīng)性采用FlexiVent(美國)有創(chuàng)肺功能儀檢測小鼠肺功能。在最后1次攻擊24 h后，行腹腔注射麻醉，行氣管插管有創(chuàng)機械通氣。采用濃度梯度的乙酰甲膽堿溶液霧化，測定給藥前后小鼠肺阻力和氣道阻力的變化情況。

1.4血清、BAL收集及細胞分類計數(shù)每只小鼠心臟取血約0.7 mL，4 ℃放置過夜，8 000 r/min離心15 min，血清移至另一干凈Eppendorf管，-20 ℃保存待測。心臟取血后立即行氣管插管支氣管肺泡灌洗，分2次緩慢注入PBS液，每次1.0 mL，緩慢收集，回收率約為80%。將回收的BAL 4 000 r/min離心10 min，收集上清液-20 ℃保存待測。細胞沉渣用0.2 mL PBS液重懸，取100 μL細胞懸液進行離心甩片，室溫晾干后進行Diff-quick染色，光學(xué)顯微鏡下進行細胞分類計數(shù)，數(shù)200個細胞，計算BAL中各類白細胞百分比。另取10 μL細胞懸液進行錐蟲藍(臺盼藍)染色，采用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)。

1.5支氣管肺組織病理學(xué)檢查取小鼠支氣管肺組織用100 mL/L甲醛固定。HE染色觀察氣道炎癥細胞浸潤。分別由2位研究者采用半定量評分法(0～3)評價支氣管周圍炎癥細胞的浸潤情況。

1.6血清免疫球蛋白的測定檢測血清總IgE和OVA特異性IgE時，血清標本分別做1∶2和1∶100倍稀釋；檢測血清總IgG1和OVA特異性IgG1時，血清標本分別做1∶10 000和1∶50 000稀釋；檢測血清總IgG2a和OVA特異性IgG2a時，血清標本分別做1∶1 000和1∶100稀釋。分別用IgE、IgG1、IgG2a捕獲抗體或OVA抗原包被酶標板4 ℃過夜孵育，洗板3次，30 mL/L小牛血清(BSA)室溫封閉1 h，加入待測樣品室溫孵育2 h，洗板3次后加入抗小鼠IgE、IgG1、IgG2a的二抗室溫孵育1 h，洗板6次，再加入辣根過氧化物酶(HRP)室溫孵育1 h。洗板7次后加入TMB底物顯色液，室溫避光孵育30 min，最后加入終止液。30 min內(nèi)采用紫外分光光度計在450 nm處檢測吸光度A值，根據(jù)標準曲線計算待測樣品濃度。總IgE和OVA特異性IgE檢測時，HRP與二抗同時加入，室溫避光共育1 h。

1.7BAL中細胞因子及化學(xué)因子的測定細胞因子及化學(xué)因子測定按照ELISA試劑盒說明書進行。依次進行捕獲抗體包被、BSA封閉，標準品及待測樣品上樣，室溫孵育2 h，洗板后加入二抗100 μL，室溫孵育2 h，洗板5次后加入100 μL HRP室溫孵育20 min，洗板7次，再加入底物工作液TMB 100 μL，室溫避光反應(yīng)20 min；加入100 μL終止液終止反應(yīng)。在450 nm讀取A值，繪制出A450 nm對應(yīng)細胞因子濃度標準曲線，根據(jù)待測樣品A450 nm值，計算出樣品中待測指標濃度。

2結(jié)果

2.1PGZ抑制OVA激發(fā)哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性PGZ干預(yù)組小鼠氣道阻力、肺阻力在較高濃度乙酰甲膽堿霧化吸入下較哮喘模型組有所降低(P<0.05)，肺順應(yīng)性較相同條件下模型組未見明顯變化(P>0.05，圖1)。

圖1 PGZ對哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性的影響

2.2PGZ抑制OVA激發(fā)哮喘小鼠BAL炎癥細胞的增殖哮喘模型組小鼠出現(xiàn)了典型的哮喘特征，BAL中炎癥細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞百分比明顯增加(P<0.01)。PGZ干預(yù)組小鼠BAL細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞百分比較對照組有不同程度的增加，但其增加幅度均低于哮喘模型組(P<0.05,圖2)。

圖2 PGZ對哮喘小鼠BAL細胞總數(shù)及白細胞分類計數(shù)的影響

2.3PGZ對OVA激發(fā)哮喘小鼠血清免疫球蛋白的影響哮喘模型組及PGZ干預(yù)組小鼠血清T-IgE、T-IgG1及s-IgE、sIgG1、s-IgG2a較PBS對照組均明顯升高(P<0.01)，而血清T-IgG2a與對照組比較未見明顯變化。但PGZ干預(yù)組小鼠血清免疫球蛋白T-IgE、T-IgG1及s-IgE、sIgG1、s-IgG2a升高幅度與哮喘模型組小鼠比較未見明顯差異(P>0.05，圖3)。

圖3 PGZ對哮喘小鼠血清免疫球蛋白的影響

2.4PGZ對OVA激發(fā)哮喘小鼠BAL中Th亞型細胞因子及化學(xué)因子的影響PGZ干預(yù)組哮喘小鼠BAL中細胞因子及化學(xué)因子IL-4、IL-13、eotaxin、IFN-γ、IL-17A均較對照組明顯升高(P<0.01)，但升高幅度低于哮喘模型組(P<0.05)，MCP-1兩組比較未見明顯差異(P>0.05，圖4)。

2.5PGZ對OVA激發(fā)哮喘小鼠支氣管肺組織病理的影響支氣管肺組織病理學(xué)檢查提示，PGZ可部分抑制哮喘模型組小鼠氣道炎癥反應(yīng)，PGZ干預(yù)組小鼠氣道炎癥細胞浸潤程度介于對照組和哮喘模型組之間(P<0.05，圖5)。

圖5 PGZ對哮喘小鼠氣道炎性細胞浸潤的影響

3討論

已有很多研究表明，PPAR-γ激動劑作為PPAR-γ受體的配體在許多炎癥性疾病如變應(yīng)性鼻炎、銀屑病、心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病中發(fā)揮著抗炎作用；但也有部分研究認為PPAR-γ激動劑在某些情況下具有促炎作用。因此，有關(guān)PPAR-γ激動劑對氣道變應(yīng)性炎癥反應(yīng)的作用及機制研究尚存在爭議[5-7]。本研究采用經(jīng)典的OVA激發(fā)方法制備哮喘氣道變應(yīng)性炎癥反應(yīng)模型，并分別從組織、細胞及分子水平驗證模型的可靠，并給予PGZ干預(yù)，結(jié)果顯示，PGZ可抑制氣道高反應(yīng)性和嗜酸粒細胞炎癥。但血清中代表Th2免疫反應(yīng)的特異性IgE和IgG1未受到明顯影響。而BAL中代表Th2免疫反應(yīng)的細胞因子IL-4、IL13以及化學(xué)因子eotaxin以及代表Th17反應(yīng)的細胞因子IL-17A受到不同程度抑制，其中以IL-13為著。這種改變與BAL中細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞百分比以及細胞因子、化學(xué)因子改變相平行。PGZ是噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物，它可激動PPAR-γ受體發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。上述結(jié)果提示，PPARγ激動劑對氣道變應(yīng)性炎癥具有一定的抑制作用。

PPARγ受體廣泛表達于機體的各類組織器官與細胞，具有廣泛的生物學(xué)作用。已有研究表明，它在上皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等多種組織細胞和免疫細胞均有表達，生物學(xué)作用涉及呼吸、消化、泌尿等多個系統(tǒng)[1]。我們的研究進一步驗證了PPARγ激動劑在抑制Th2免疫反應(yīng)的同時，對Th17免疫反應(yīng)也有部分抑制作用，后者是近年備受關(guān)注的Th免疫反應(yīng)的新亞型。這與PARK等[8]的研究結(jié)果一致。然而與之研究不同的是，我們的實驗體系中并未發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑PGZ能夠明顯抑制血清免疫球蛋白IgE、IgG1的產(chǎn)生，分析原因可能與我們采用的ELISA檢測方法的敏感性有關(guān)，但不能完全除外PPARγ激動劑PGZ主要影響T淋巴細胞和氣道上皮細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的可能，而對B淋巴細胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)影響較為微弱。由此提示，在氣道變應(yīng)性炎癥反應(yīng)體系中，PPARγ激動劑可能主要通過抑制T細胞增殖和分化以及上皮細胞分泌發(fā)揮抗炎效應(yīng)的，并且以局部作用為主，但其深入的細胞分子機制仍需進一步探討，可能與抑制炎癥反應(yīng)因子NF-κB有關(guān),有學(xué)者提出調(diào)節(jié)性T細胞介導(dǎo)了該作用[9-10]。

綜上，PPARγ激動劑最早因其對脂代謝的調(diào)節(jié)作用被廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療，近年因其廣泛抗炎作用的特點而倍受關(guān)注[11]。目前已有新一代副作用更小的PPARγ激動劑如KR62980、15d-PGJ2逐漸進入臨床前研究階段，它們具有相似的臨床療效和更小的副作用[12-13]。相信在不久的將來，這些新型的PPARγ激動劑將會在哮喘氣道變應(yīng)性炎癥防治方面發(fā)揮重要作用。

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