金龍膠囊抗腦腫瘤的系統(tǒng)生物學研究

黃 卉 曲育瑩 王秋玲 岳貴娟 李 娜 李建生

·基礎(chǔ)研究·

金龍膠囊抗腦腫瘤的系統(tǒng)生物學研究

黃 卉①②曲育瑩①②王秋玲①②岳貴娟①②李 娜①②李建生①②

目的：利用系統(tǒng)生物學技術(shù)分析中藥復(fù)方金龍膠囊抗腦腫瘤的分子機制。方法：取金龍膠囊組及空白對照組小鼠的原位腦腫瘤組織樣本進行基因芯片檢測，通過比對獲取差異基因；使用一步過連通測算和多步驟隱藏節(jié)點測算獲得拓撲基因；采用富集分析法分析其生物功能；借助MetaCore平臺構(gòu)建分子機制網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果：與對照組相比，金龍膠囊組共有37個差異基因（倍數(shù)＞2），106個拓撲基因。金龍膠囊的靶點主要集中在細胞粘附和凋亡、免疫應(yīng)答、神經(jīng)組織發(fā)育等。結(jié)論：金龍膠囊通過誘導神經(jīng)細胞特有基因表達和抑制干擾素信號轉(zhuǎn)導發(fā)揮抗腦腫瘤作用。

金龍膠囊 基因芯片 系統(tǒng)生物學 腦腫瘤 機制

中藥成分復(fù)雜，作用整體性強，具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多通路的特點，其藥效發(fā)生機制一直是研究者長期從事的熱點課題之一。

金龍膠囊是由守宮、金錢白花蛇和蘄蛇組成用于血瘀郁結(jié)型腫瘤的治療，也可用于晚期癌癥的姑息治療。動物實驗結(jié)果表明，金龍膠囊具有較好的抑制原位腦腫瘤動物模型中顱內(nèi)腫瘤生長的作用［1］，但其藥理機制尚不清楚。本研究選取金龍膠囊干預(yù)后顱內(nèi)腫瘤組織，實驗組為金龍膠囊給藥組，對照組為給予溶媒的空白組，進行基因芯片檢測，采用系統(tǒng)生物學方法［2］對基因組學結(jié)果進行分析，最終獲取金龍膠囊抗腦腫瘤的分子作用機制，為中藥藥理機制研究方法提供新的途徑和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

金龍膠囊（北京建生藥業(yè)有限公司）批號為100945；5～6周齡雌性裸鼠，合格證號：SCXK京2009-0004（北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司）；Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片（美國Affymetrix公司）；MetaCore系統(tǒng)生物學分析平臺（湯森路透科技集團）。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片檢測 應(yīng)用外科原位移植方法［3］，建立裸鼠原位腦腫瘤動物模型。將裸鼠隨機分為對照組（給予溶媒）和金龍膠囊組，連續(xù)灌胃給藥28 d后處死動物，取顱內(nèi)腫瘤組織，提取總RNA，使用RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標記的cRNA，并進行cRNA的純化。cRNA經(jīng)片段化處理后，與Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片雜交。雜交16 h后取出芯片，在Affymetrix公司的專用設(shè)備Affymetrix Fluidids Station 450中完成清洗和染色。使用Affymetrix公司的GeneChip Scanner 3000掃描儀對雜交信號進行掃描，獲取基因表達的熒光信號強度。掃描圖像采用Affymetrix GenChip Command Console Software（AGCC）軟件進行數(shù)字化處理，取得金龍膠囊藥物干預(yù)后的差異基因表達譜。

1.2.2 數(shù)據(jù)前處理 運用多陳列對數(shù)健壯算法（RMA）對上述取得的基因表達原始數(shù)據(jù)信息進行歸一化處理［4］，并采用最新版本的探針注釋系統(tǒng)，使每1個探針都能對應(yīng)1個獨立的基因。通過這些前處理，將會獲得1個非冗基因標準化信號表達的數(shù)據(jù)集，此數(shù)據(jù)集中分別包含了2個樣本的基因表達信息。將金龍膠囊藥物干預(yù)組樣品基因表達信息與空白對照組樣品基因表達信息進行比對，取得差異基因表達譜，同時計算每個差異表達基因的差異倍數(shù)。

1.2.3 拓撲基因的獲取 為了將在分析差異基因的過程中被忽視但實際上有可能是藥物發(fā)揮調(diào)控作用的靶點基因挖掘出來，采用了2種網(wǎng)絡(luò)拓撲評分算法（一步過連通測算和多步驟的隱藏節(jié)點測算），從而挖掘?qū)Σ町惢蛑苯影l(fā)揮調(diào)控作用的因子和間接發(fā)揮調(diào)控作用的重要遠端因子，“拓撲重要基因”（topologically significant genes）。1）一步過連通測算［5-6］，采用以下公式：

其中N為GeneGo數(shù)據(jù)庫（GeneGo Global NetworkTM）中的蛋白總數(shù)；R為輸入文件中的基因總數(shù)；n為與輸入文件中某特定基因連通的連通總數(shù)；r為與輸入文件中某特定基因有一步連通性的化合物的總數(shù)。對差異基因與數(shù)據(jù)庫中的各化合物連通水平的高低進行分析，并評價其統(tǒng)計學顯著性水平，旨在尋找與差異基因有一步連通性的重要調(diào)控因子。2）多步驟隱藏節(jié)點分析：采用了拓撲評分測算方法［7-8］，將差異基因整合入一個網(wǎng)絡(luò)，來構(gòu)建這些基因之間通過最短路徑互相連通的網(wǎng)絡(luò)圖，同時計算出在這個最短路徑網(wǎng)絡(luò)圖中穿過某基因的路徑數(shù)量以及在GeneGo Global NetworkTM數(shù)據(jù)庫中穿過此基因的路徑數(shù)量。根據(jù)這些路徑數(shù)目以及與之相對應(yīng)的原始數(shù)據(jù)，評估某基因通過多步驟與輸入文件中特定基因相連通的統(tǒng)計學顯著性。統(tǒng)計學顯著性高的節(jié)點被認為是拓撲重要節(jié)點。

1.2.4 通路及生物學功能分析 采用富集分析的方法來探討差異基因和拓撲基因的各項生物功能。其中GeneGo數(shù)據(jù)庫中的功能分析項目為：1）范式通路；2）生物學過程網(wǎng)絡(luò)；3）疾病表面標志物；4）毒理網(wǎng)絡(luò)；公共數(shù)據(jù)庫中的功能分析為：1）生物學過程；2）分子功能；3）細胞定位，每個項目的富集程度用以下公式進行計算：

其中N為檢測所用的基因芯片上的基因總數(shù)；R為差異基因和拓撲基因總數(shù)；n為某方面中具體某一個條目中所包含的基因總數(shù)；r為某方面中具體某一個條目中所包含的差異基因和拓撲基因總數(shù)。

1.2.5 機制網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 以細胞或組織的特定響應(yīng)為依據(jù)，將以上對差異基因、拓撲基因、通路和生物學功能的分析內(nèi)容進行整合，借助使用MetaCore平臺上的人工注釋系統(tǒng)（蛋白、蛋白間相互作用關(guān)系、通路）、運算工具包和濾器構(gòu)建一個涵蓋疾病、毒理、藥物響應(yīng)、分子過程等信息的可視化模型，即藥物機制網(wǎng)絡(luò)圖。機制網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建主要涉及以下2個方面：1）對多個信號通路綜合進行構(gòu)建，來揭示組織或細胞對藥物的特定響應(yīng)是如何產(chǎn)生的；2）將與產(chǎn)生這種特定響應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵條目整合入通路中，來構(gòu)建一個系統(tǒng)的機制模型圖。

2 結(jié)果

2.1 差異基因

利用GeneGo數(shù)據(jù)庫對芯片檢測得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，獲得金龍膠囊作用后的差異基因表達譜。結(jié)果顯示，0.75 g/kg金龍膠囊組與模型組相比，差異倍數(shù)上調(diào)2倍以上的差異表達基因前10個（表1），差異倍數(shù)下調(diào)2倍以上的差異表達基因前15個（表2）。

2.2 拓撲基因

2.2.1 一步過連通拓撲基因 通過一步過連通測算，共獲得9個一步過連通拓撲基因（表3），其中基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員（MMP-2、Stromelysin-2、MMP-25、Stromelysin-1）對生理、病理過程以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的細胞外基質(zhì)降解即發(fā)揮重要作用［9］，另外還包括與腫瘤相關(guān)的基因GlyT1、Sno-N、TXNDC5、AP-1以及Plasmin。

2.2.2 多步驟拓撲基因 拓撲評分測算分析得到作為細胞粘附分子家族的成員之一整合素（alpha-2/beta-1 integrin、ITGA2、ITGB1）扮演著介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)之間的相互粘附的角色，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵調(diào)控作用［10］；得到了對神經(jīng)元存活、生長和功能有重要影響并與肺癌細胞的增殖活動相關(guān)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）［11］；以及正黏蛋白MUC1和與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因Stromelysin1等97個多步驟拓撲基因。

2.3 通路及生物學功能分析

將差異基因在7個項目中分別進行富集分析，選取顯著性高的條目（P＜0.05）；將拓撲基因在7個項目中分別進行富集分析，選取顯著性高的條目（P＜0.05）；選取上述結(jié)果中對差異基因和拓撲基因顯著性都高的條目（P＜0.05）；將差異基因和拓撲基因整合在一起對7個項目的每項分別進行富集分析，選取顯著性高的條目（P＜0.05），最終得到6條范式通路和4個關(guān)鍵生物學網(wǎng)絡(luò)（表3）。

2.4 機制網(wǎng)路圖的構(gòu)建

金龍膠囊組與對照組比對分析構(gòu)建機制網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），對這一網(wǎng)絡(luò)圖進行簡化處理（圖2）可見，金龍膠囊能誘導神經(jīng)細胞特有基因的表達，抑制干擾素信號傳導。IFI17（IFIM1）、IFITM2、SERPINA3（ACT）與免疫和炎癥應(yīng)答相關(guān)，而免疫應(yīng)答在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，其中IFI17可通過抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）的激活以及將細胞周期阻滯在G1期而在IFN-γ抗細胞增殖過程中起到關(guān)鍵作用［12］。

表1 差異2倍以上的上調(diào)基因列表Table 1 Genes upregulated for more than twofold

表2 差異2倍以上的下調(diào)基因列表Table 2 Genes downregulated for more than twofold

表3 關(guān)鍵范式通路圖（6個）和關(guān)鍵生物學網(wǎng)絡(luò)（4個）列表Table 3 Key pathways and process networks

?1.Differential gene；2、3.Hidden nodes圖1 金龍膠囊組與對照組比對后構(gòu)建的機制網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Comparison of the network diagram mechanism of the Jinlong capsule group and the control group

?1.Differential gene；2、3.hidden nodes圖2 金龍膠囊的機制網(wǎng)絡(luò)簡化圖Figure 2 A simplified diagram of mechanism of Jinlong capsule

3 討論

系統(tǒng)生物學在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛，為多環(huán)節(jié)藥物作用機制的研究提供了有力手段。目前抗腫瘤藥物的研究已從傳統(tǒng)的細胞毒性向多環(huán)節(jié)作用機制的新型藥物方向發(fā)展。中藥的作用機制較為復(fù)雜，因此如何利用新型技術(shù)發(fā)掘抗腫瘤藥物的分子作用機制成為焦點。應(yīng)用系統(tǒng)生物學技術(shù)分析復(fù)方中藥金龍膠囊作用前后mRNA表達水平的改變，從分子水平了解中藥的多作用靶點、方式及代謝途徑，并進一步了解其作用機制。

機制網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建是整個機制分析中非常重要的一環(huán)。在生物醫(yī)學領(lǐng)域，構(gòu)建機制網(wǎng)絡(luò)圖的方法差別較大［13］，但大體上均是以細胞或組織的特定響應(yīng)為依據(jù)，將之前的分析內(nèi)容進行整合，構(gòu)建一個網(wǎng)絡(luò)圖［14-15］。本研究借助MetaCore平臺上的人工注釋系統(tǒng)（蛋白、蛋白間相互作用關(guān)系、通路），同時也基于真核生物的信號通路來完成。為了探究核心的信號通路，本研究也納入了一部分不在關(guān)鍵通路里但是功能明確的效應(yīng)基因群，使核心通路發(fā)揮功能效應(yīng)的來龍去脈更加明晰，也使得整個功能模型更加完整。因此，整個構(gòu)建機制網(wǎng)絡(luò)圖的分析過程是以關(guān)鍵通路圖為基礎(chǔ)，作為搭建的主要框架。由于GeneGo范式通路圖是以實驗驗證為基礎(chǔ)而搭建的一個數(shù)據(jù)庫平臺，因此為機制網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建提供了更高的可信度。

本研究肯定了金龍膠囊對小鼠腦腫瘤的治療作用，通過使用基因組學及系統(tǒng)生物學分析方法，獲得了金龍膠囊干預(yù)后腦腫瘤組織的差異基因表達譜，并通過分析測算得到了與之相關(guān)聯(lián)的發(fā)揮調(diào)控作用的隱藏節(jié)點（即拓撲基因），通過對其生物功能的分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的生物功能主要集中在細胞黏附和凋亡、免疫應(yīng)答、神經(jīng)組織的發(fā)育等方面。基于對差異基因、拓撲基因以及其生物功能的富集分析，本研究構(gòu)建出金龍膠囊發(fā)揮抗腦腫瘤作用的機制網(wǎng)絡(luò)圖，將金龍膠囊的作用靶點、通路以及這些靶點通路之間的關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖的形式展現(xiàn)出來，充分體現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究理念，也顯示出系統(tǒng)生物學分析方法的可行性和優(yōu)勢。該網(wǎng)絡(luò)圖顯示，金龍膠囊可以刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及相關(guān)信號，促進神經(jīng)元的分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞骨架的重構(gòu)。這種行為提示，受金龍膠囊抗腦腫瘤作用的影響，一部分腦腫瘤細胞可能會分化為神經(jīng)細胞。金龍膠囊的另一個重要作用機制是下調(diào)干擾素相關(guān)信號，這些與免疫應(yīng)答和抗炎反應(yīng)關(guān)系密切。由于炎癥在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，金龍膠囊對干擾素相關(guān)信號的下調(diào)作用應(yīng)當是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要方面。當然，這種預(yù)測性的分析結(jié)果還需要一系列實驗來進行驗證，但其對后續(xù)實驗的設(shè)計和開展具有極其重要的指導意義，為機理的深入闡釋奠定了基礎(chǔ)。

1 Huang H,Cui XW,Yue GJ,et al.Treatment of gliomatosis cerbri growth with Jinlong Capsules[J].Chinese traditional patent medicine,2013,35(9)：39.［黃 卉,崔向微,岳貴娟,等.金龍膠囊治療腦腫瘤藥理機制研究[J].中成藥,2013,35(9)：39.］

2 Li SW.Application of systems biology in cancer research[J].Chinese Bulletin of life sciences,2011,10：41-46.［李升偉.癌癥研究中的系統(tǒng)生物學應(yīng)用[J].生命科學,2011,10：41-46.］

3 Wei SZ,Sun Y,Yang ZJ,et al.Establishment of orthotopic lung cancer model expressing enhanced green fluorescent protein[J].Chin J Lung Cancer,2010,13(7)：670-675.

4 Lee WH.Interferon-alpha induces the growth inhibition of human T-cell leukaemia line Jurkat through p38alpha and p38beta[J].J Biochem,2010,147(5)：645-650.

5 Chang J.Differential response of canner cells to HDAC inhibitors trochostatin A and depsipetide[J].Br J Cancer,2012,106(1)：116-125. 6 Dimopoulos MA.Tanespimycin as antitumor therapy[J].Clin Lymphoma Leuk,2011,11(1)：17-22.

7 Kim H.Gene expression changes in patient-matched in patient-matched gastric normal mucosa,adenomas,and carcinomas [J].Exp Mol Pathol,2011,90(2)：201-209.

8 Blalock EM.Gene expression analysis of urine sediment：evaluation for potential noninvasive markers of interstitial cystitis/bladder pain syndrome[J].J Urol,2012,187(2)：725-732.

9 Kam SH.Perpheral blood gene expression changes during allergen inhalation challenge in atopic asthmatic individuals[J].J Asthma,2012, 49(3)：219-226.

10 Ricci A.Neurotrophin and neurotrophin receptor protein expression in the human lung[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2004,30(1)：12-19.

11 Palermo AT.Transcriptional response to GAA deficiency(Pompe disease)in infantile-onset patients[J].Mol Genet Metab,2012,106 (3)：287-300.

12 Tam CS.An early inflammatory gene profile in visceral adipose tissue in children[J].Int J Pediatr Obes,2011,6(2-2)：e360-363.

13 Zhang QC.Histone deacetylase inhibitor trichostatin A and depsipeptide[J].Br J Cancer,2012,106(1)：116-125.

14 Deker TJ,Hood L.Boosting signal-to-noise in complex biology：prior knowledge is power[J].Cell,2011,144(6)：860-863.

15 Gialeli C,Theocharis AD,Karamanos NK.Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting[J].FEBS J,2011,278(1)：16-27.

（2014-02-20收稿）

（2014-04-24修回）

（本文編輯：楊紅欣）

Study of anti-cancer traditional Chinese medicine using systems biology technology

Hui HUANG1,2,Yuying QU1,2,Qiuling WANG1,2,Guijuan YUE1,2,Na LI1,2,Jiansheng LI1,2
Correspondence to:Jiansheng LI;E-mail:lyz988@gmail.com

1Beijing Vital Medicine Research&Development Centre,Beijing 100039;2Beijing Jiansheng Pharmaceutical Co.Ltd,Beijing

100039,China.

Objective:This article focuses on the research of molecular mechanism of brain tumor treatment using the Jinlong capsule via system biology technology.Methods:Human Genome U133 Plus 2.0 gene chip was used to detect the genes of samples,including the brain tumor tissues of nude mice after Jinlong capsule intervention and those of blank control group mice.Differentially expressed genes were identified based on fold change between the two groups.To identify the upstream regulators of the response signatures,the differentially expressed genes were subjected to interactome analysis by one-step overconnectivity test and multi-step hidden node algorithm.A set of genes preferentially connected to differentially expressed genes via direct interactions and pathways(called topologically significant genes)was generated.Concurrent pathway enrichment analysis on key pathways,processes,and functional units of both differentially expressed genes and topologically significant genes was performed to identify the most likely signaling pathways connecting regulators and effector genes.Finally,condition-specific networks(called causal network)were built to model molecular events by using a set of manually annotated protein interactions,pathways,and proteins and a toolkit of algorithms and filters on Meta-Core platform.Results:A total of 37 differentially expressed genes have been identified between Jinlong capsule-treated sample and vehicle sample with fold change of 2.Connection analysis identified 106 topologically significant genes.The main feature of the causal network is stimulation of neural cell specific genes that regulate normal cell physiology,particularly developmental processes and apoptosis.Another important effect of the Jinlong capsule is its inhibition of the gene markers of interferon response,suggesting signaling inhibition,followed by de-activation of immune response.Conclusion:Jinlong capsule exerts an anti-neoplastic effect by inducing stimulation of neural cell and by inhibiting interferon signal transduction.

Jinlong capsules,gene chip,systems biology,brain tumor,mechanism

10.3969/j.issn.1000-8179.20140305

黃卉 博士，副研究員。研究方向為腫瘤藥理學，包括重組蛋白表達、未知基因功能預(yù)測等。

①北京鮮動物藥研制中心（北京市100039）；②北京建生藥業(yè)有限公司

李建生 qiuling0915@163.com

E-mail：huanghui_phd@yeah.net