恩替卡韋對(duì)HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者的免疫調(diào)節(jié)作用

藺詠梅，楊雪亮，葉 峰，張 曦，孔 穎，唐甜甜，張 健，藺淑梅

(1.三二○一醫(yī)院傳染科，陜西漢中 723000；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院傳染科，陜西西安 710061)

恩替卡韋對(duì)HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者的免疫調(diào)節(jié)作用

藺詠梅1，楊雪亮2，葉 峰2，張 曦2，孔 穎2，唐甜甜2，張 健2，藺淑梅2

(1.三二○一醫(yī)院傳染科，陜西漢中 723000；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院傳染科，陜西西安 710061)

目的探討恩替卡韋對(duì)HBeAg陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。方法30例HBe Ag陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者每日給予0.5 mg恩替卡韋治療，于治療0、12、24、48周分別檢測(cè)血清HBV DNA、IFN-γ及IL-4水平，并檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中B7-H1 mRNA水平。結(jié)果①應(yīng)答組患者PBMCs中B7-H1 mRNA水平在治療過程中呈進(jìn)行性下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.005)，而無(wú)應(yīng)答組該指標(biāo)在治療過程中無(wú)顯著變化(P=0.466)；②應(yīng)答組患者的血清IFN-γ水平在治療過程中呈上升趨勢(shì)(P＜0.05)，無(wú)應(yīng)答患者的血清IFN-γ水平在治療過程中雖也呈上升趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；③應(yīng)答組患者的血清IL-4水平在治療過程中表現(xiàn)為持續(xù)下降，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，無(wú)應(yīng)答組患者的血清IL-4水平在治療過程中雖然有下降趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論恩替卡韋治療HBeAg陽(yáng)性的慢性乙肝患者不僅具有抑制病毒作用，而且具有促進(jìn)免疫恢復(fù)和調(diào)節(jié)的功能，其機(jī)制可能是通過降低患者體內(nèi)的病毒載量、減少抑制性共刺激分子B7-H1的表達(dá)而發(fā)揮作用。

恩替卡韋；HBeAg陽(yáng)性；免疫調(diào)節(jié)；B7-H1；慢性乙型肝炎；IFN-γ；IL-4

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是目前威脅人類健康的重要疾病之一，全球3.5～4億人為慢性HBV感染者［1］。HBV感染人體后易慢性化的機(jī)制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2細(xì)胞功能失衡可能是HBV感染慢性化的主要原因［2-4］，而抑制性共刺激分子B7-H1(the programmed death-1 ligands)是誘發(fā)免疫細(xì)胞功能失衡的重要因素［5-8］。

核苷類似物作為一種直接抗病毒藥物不僅可以顯著抑制病毒復(fù)制，而且有研究顯示這類藥物可能具有調(diào)節(jié)慢性HBV感染者體內(nèi)的免疫狀態(tài)的能力，從而促使患者發(fā)生HBe Ag血清學(xué)轉(zhuǎn)換，乃至HBs Ag血清學(xué)轉(zhuǎn)換，但機(jī)制尚未明了［9-12］。

為了解恩替卡韋對(duì)慢性乙型肝炎患者的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，本研究以應(yīng)用恩替卡韋治療的HBe Ag陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者為研究對(duì)象，動(dòng)態(tài)觀察治療過程中血清B7-H1水平的變化，以及由Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4的變化，探討這些細(xì)胞因子的變化與抗病毒療效的關(guān)系，進(jìn)一步明確恩替卡韋對(duì)HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2007年～2011年在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的接受恩替卡韋治療的HBeAg陽(yáng)性的慢性乙型肝炎(CHB)患者作為研究對(duì)象。HBe Ag陽(yáng)性CHB診斷符合2010年《中國(guó)慢性肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)，并同時(shí)滿足以下條件：①年齡18周歲以上；②HBV DNA≥105copies/m L；③血清ALT為80～400 U/L；④血清總膽紅素＜85.5μmol/L；⑤未曾接受抗乙肝病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)劑治療；⑥所有病例排除HAV、HCV、HEV、HDV及HIV的感染，并排除自身免疫性、酒精性肝病。所有患者均在了解研究方案的基礎(chǔ)上自愿簽署知情同意書。選擇10例健康志愿者作為正常對(duì)照組。

1.2 研究分組所有患者均接受恩替卡韋0.5 mg，口服，1次/d。根據(jù)治療24周時(shí)HBV DNA應(yīng)答情況，分為應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組，選取應(yīng)答組15例，無(wú)應(yīng)答組15例。(治療24周HBV DNA＜50 IU/m L則為應(yīng)答組，HBV DNA≥50 IU/m L為無(wú)應(yīng)答組)

1.3 標(biāo)本的獲取治療前獲取正常對(duì)照者及患者的血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，治療12、24、48周獲取患者的血清和PBMCs。

1.4 血清HBV DNA水平的檢測(cè)采用Lightcycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)，檢測(cè)血清HBV DNA(瑞士羅氏)含量。檢測(cè)下限為HBV DNA＜50 IU/m L。

1.5 血清IFN-γ、IL-4及B7-H1 mRNA水平的檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)IFN-γ及IL-4(美國(guó)Bender)。提取PBMC中總RNA，將B7-H1 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因，并回收檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料表示，HBV DNA載量、血清IFN-γ和IL-4水平的比較，采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)HBV DNA載量、血清IFN-γ和IL-4水平的比較采用Bonferroni法，校正后P＜0.008 3為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的臨床特征治療前患者及正常對(duì)照組的性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組在ALT及HBV DNA水平上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，表1)。

表1 研究對(duì)象的基線資料Tab.1 Baseline characteristics of the patients and the controls

2.2 HBV DNA的動(dòng)態(tài)變化恩替卡韋治療期間，血清HBV DNA定量檢測(cè)的結(jié)果在兩組均呈下降趨勢(shì)，但應(yīng)答組的下降幅度遠(yuǎn)大于無(wú)應(yīng)答組(P=0.000，表2)。

2.3 PBMCs中B7-H1 mRNA的檢測(cè)結(jié)果患者PBMCs中的B7-H1 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組［(8.23±0.06)logIU/m L vs.(1.00±0.03) logIU/m L，P=0.000)］。

應(yīng)答組患者PBMCs中B7-H1 mRNA水平在治療過程中呈進(jìn)行性下降(F=10.915，P=0.005)。治療12周時(shí)PBMCs中B7-H1 mRNA表達(dá)水平較治療前下降(P=0.02)，24周較12周也有所下降(P= 0.003)，48周較24周稍有下降(P=0.080，圖1)。

表2 恩替卡韋治療過程中HBV DNA的動(dòng)態(tài)變化Tab.2 Dynamic changes of HBV DNA during entecavir treatment

圖1 應(yīng)答組PBMCs中B7-H1 mRNA水平的變化Fig.1 Changes of B7-H1 mRNA of PBMCs in responding group

無(wú)應(yīng)答組PBMCs中B7-H1 m RNA水平在治療過程中無(wú)顯著變化(F=0.628，P=0.466)。治療12周時(shí)PBMCs中B7-H1表達(dá)水平較治療前無(wú)顯著下降(P=0.303)，24周與12周、48周與24周比較均無(wú)顯著變化(P=0.124，P=0.964)，而且治療48周時(shí)該指標(biāo)與基線比較仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.126，圖2)。

圖2 無(wú)應(yīng)答組PBMCs中B7-H1 mRNA水平的變化Fig.2 Changes of B7-H1 m RNA of PBMCs in non-responding group

2.4 血清IFN-γ水平的變化治療前CHB患者血清IFN-γ水平明顯低于正常對(duì)照組［(1.80±0.91) pg/m L vs.(6.24±1.45)pg/m L，P=0.02］。

應(yīng)答組患者的血清IFN-γ水平在治療過程中處于上升趨勢(shì)，且不同時(shí)間點(diǎn)IFN-γ比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=180.09，P=0.000)，其中12、24、48周和基線比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；24周與12周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；48周與24周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，圖3)。

圖3 應(yīng)答組與無(wú)應(yīng)答組血清IFN-γ水平的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of serum IFN-γin responding group and non-responding group

無(wú)應(yīng)答組患者的血清IFN-γ水平在治療過程中雖然有下降趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3)。

2.5 血清IL-4水平的變化CHB患者血清IL-4水平顯著高于正常對(duì)照組［(5.83±3.49)pg/m L vs. (4.38±0.37)pg/m L，P=0.04］。

應(yīng)答組患者的血清IL-4水平在治療過程中表現(xiàn)為持續(xù)下降，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療12周時(shí)血清IL-4水平較治療前顯著下降(P=0.013)，24周較12周下降明顯(P=0.012)，48周較24周下降且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034，圖4)。

圖4 應(yīng)答組與無(wú)應(yīng)答組血清IL-4水平的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of serum IL-4 in responding group and non-responding group

無(wú)應(yīng)答組患者的血清IL-4水平在治療過程中雖然有下降趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。12周時(shí)血清IL-4水平與治療前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.069)，24周時(shí)血清IL-4水平與12周相比也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.060)，48周時(shí)血清IL-4水平較24周時(shí)有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048，圖4)。

3 討 論

HBV感染是一個(gè)全球關(guān)注的健康問題，也是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致慢性肝臟疾病的最常見原因。正常情況下，免疫功能健全的成人感染HBV后可通過天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答清除病毒，并獲得對(duì)HBV再次感染的抵抗力，但是有相當(dāng)一部分患者由于難于形成針對(duì)HBV的有效免疫從而導(dǎo)致感染慢性化［13］，TH1和TH2細(xì)胞免疫失衡被認(rèn)為是其中的重要原因。能夠影響TH1/TH2細(xì)胞功能的因素有很多。近年研究發(fā)現(xiàn)，抑制性共刺激分子B7-H1可能是影響HBV感染者T細(xì)胞功能的重要因素［14-16］。例如，CHEN等［16］研究發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染者的T淋巴細(xì)胞和mDC細(xì)胞上B7-H1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)升高。因此，作者認(rèn)為PD-1/B7-H1途徑具有抑制T細(xì)胞的功能，包括誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡、降低T細(xì)胞的殺傷作用、抑制T細(xì)胞的增殖等作用。MAIER等［17］利用特異性B7-H1Ab處理HBV轉(zhuǎn)基因小鼠后，使轉(zhuǎn)基因鼠的IFN-γ表達(dá)延遲，進(jìn)一步證實(shí)B7-H1通路能夠影響分泌IFN-γ細(xì)胞因子的TH1細(xì)胞的功能。

本研究也證實(shí)，與正常對(duì)照組比較，慢性乙型肝炎患者的PBMCs中B7-H1 mRNA表達(dá)顯著升高，而代表TH1細(xì)胞功能的細(xì)胞因子IFN-γ在血清中的表達(dá)則顯著低于正常對(duì)照者，代表TH2細(xì)胞功能的細(xì)胞因子IL-4在血清中的表達(dá)則顯著高于正常對(duì)照者。

但更有意義的研究結(jié)果是，隨著研究的進(jìn)展發(fā)現(xiàn)隨著恩替卡韋抗病毒療效的發(fā)揮，HBV DNA水平呈下降趨勢(shì)，PBMCs中B7-H1 mRNA表達(dá)水平也表現(xiàn)為進(jìn)行性下降趨勢(shì)，血清IL-4水平同時(shí)下降，而血清中IFN-γ則逐漸上升趨于正常，更重要的是上述這3種因子趨于正常的動(dòng)態(tài)變化在病毒得到良好控制的應(yīng)答組更加明顯。上述結(jié)果提示，在慢性HBV感染者的免疫系統(tǒng)中確實(shí)存在TH1/TH2細(xì)胞免疫失衡，而且抑制性共刺激分子可能與這種失衡有關(guān)，恩替卡韋治療能夠促使這種免疫失衡趨于正常，其機(jī)制可能是通過降低患者體內(nèi)病毒載量實(shí)現(xiàn)的。也就是說(shuō)，該結(jié)果提示，恩替卡韋通過降低機(jī)體的HBV病毒含量而減少了HBV對(duì)機(jī)體免疫的刺激，進(jìn)一步減少抑制性共刺激分子B7-H1的表達(dá)，從而促使負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用減弱，間接地促進(jìn)機(jī)體清除病毒免疫能力的加強(qiáng)而進(jìn)一步減少病毒含量，進(jìn)而使慢性HBV感染者針對(duì)HBV的免疫趨于平衡，最終達(dá)到免疫控制的目的。其中恩替卡韋抗病毒是始動(dòng)因素，而真正起作用的可能是機(jī)體的免疫系統(tǒng)的自平衡作用。核苷類抗病毒制劑能夠間接促使HBV感染者免疫恢復(fù)在替比夫定及拉米夫定的研究中也有報(bào)道［18-19］。

另外，應(yīng)答組患者的血清IFN-γ水平48周時(shí)在數(shù)值上與24周的水平有所下降，原因可能是隨著病毒水平的下降，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)刺激作用減弱，相應(yīng)的細(xì)胞因子的表達(dá)也有所下降，而無(wú)應(yīng)答組因?yàn)椴《据d量仍較高，因此仍處于高表達(dá)；另一種原因也可能是影響IFN-γ產(chǎn)生的因素非常多，隨著病毒水平的下降，免疫網(wǎng)絡(luò)中的多種因素相互作用而使IFN-γ的表達(dá)水平下降，但具體機(jī)制仍然需要在后續(xù)試驗(yàn)中繼續(xù)研究［20］。

總之，恩替卡韋用于治療HBeAg陽(yáng)性的CHB患者不僅具有直接抑制病毒作用，而且具有促進(jìn)免疫恢復(fù)和調(diào)節(jié)的功能，其機(jī)制可能是通過降低患者體內(nèi)的病毒載量，減少抑制性共刺激分子B7-H1的表達(dá)而發(fā)揮作用，但更深一步的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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(編輯 卓選鵬)

Immunoregulation of entecavir for patients with HBeAg-positive chronic hepatitis B

LIN Yong-mei1，YANG Xue-liang2，YE Feng2，ZHANG Xi2，KONG Ying2，TANG Tian-tian2，ZHANG Jian2，LIN Shu-mei2
(1.Department of Infectious Diseases，No.3201 Hospital，Hanzhong 723000；2.Department of Infections Diseases，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo study the immunoregulation and mechanism of entecavir for patients with HBe Agpositive chronic hepatitis B.MethodsThirty patients with HBe Ag-positive chronic hepatitis B took 0.5 mg entecavir every day.Then we detected the levels of serum HBVDNA，IFN-γ，IL-4 and B7-H1 m RNA of PBMCs in baseline at12，24，48 and weeks，respectively.Results①The level of B7-H1 m RNA of PBMCs after treatment decreased progressively in responding group，with a significant difference(P=0.005).It decreased slowly in nonresponding group，without significant difference(P=0.466).②The level of serum IFN-γafter treatment increased progressively in responding group，with a significant difference(P＜0.05).But it increased slowly in nonresponding group，with no significant difference(P＞0.05).③The level of serum IL-4 after treatment decreased progressively in responding group，with a significant difference(P＜0.05)，but decreased slowly in non-responding group with no significant difference(P＞0.05).ConclusionEntecavir used to treat patients with HBe Ag-positive chronic hepatitis B not only suppressed HBVDNA replication but also promoted the recovery and regulation of the immune system.The mechanisms may be related to reducing HBVDNA loads and decreasing B7-H1 expression.

entecavir；HBe Ag-positive；immunoregulation；B7-H1

R512.6

A

1671-8259(2014)05-0655-04

10.7652/jdyxb201405017

2013-12-26

2014-03-269

國(guó)家“十二五”重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX10002004-007) Supported by the Major Infectious Diseases Prevention and Control Science and Technology Project of the Major National“Twelfth Five-Year”(No.2012ZX100020004-007)

藺淑梅，教授.E-mail：linshumei123@126.com

藺詠梅(1968-)，女(漢族)，副主任醫(yī)師.研究方向：肝臟疾病.E-mail：linym35@163.com

時(shí)間：2014-05-16 15∶56 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140730.1848.001.html