Toll樣受體4信號通路過度激活在大鼠激素性股骨頭壞死中的作用

田 雷，周東生，孫 水，張 晨，樊立宏，王坤正

(1.山東大學附屬山東省立醫(yī)院骨外科，山東濟南 250021；2.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院骨科，陜西西安 710004)

Toll樣受體4信號通路過度激活在大鼠激素性股骨頭壞死中的作用

田 雷1，周東生1，孫 水1，張 晨2，樊立宏2，王坤正2

(1.山東大學附屬山東省立醫(yī)院骨外科，山東濟南 250021；2.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院骨科，陜西西安 710004)

目的建立大鼠激素性股骨頭壞死模型并研究Toll樣受體4(TLR4)信號通路在激素性股骨頭壞死中的作用機制。方法成年雄性SD大鼠隨機分為模型組、干預(yù)組，每組各24只，按照甲強龍20 mg/kg的劑量給予雙側(cè)臀大肌交替肌注造模，1周1次，共8周。其中干預(yù)組在每次激素注射后，同時給予10 mg/kg TAK242藥物靜脈注射；另12只大鼠設(shè)為對照組，僅在同等條件下給予生理鹽水肌注。在激素注射后的8、10、12周時分別以過量麻醉法處死各組動物，采用ELISA測定血清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的含量，并對股骨頭進行組織病理學觀察和TRAP特異性染色觀察。分別提取各組大鼠股骨頭總mRNA和總蛋白，采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測TLR4、髓樣細胞分化因子88(MyD88)、NF-κB p65和單核細胞趨化蛋白(MCP-1)的m RNA及蛋白的表達。結(jié)果模型組股骨頭壞死的組織病理學表現(xiàn)明顯，其中血清TRAP含量、TRAP特異性染色面積、各因子的m RNA和蛋白含量表達均較其他兩組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。干預(yù)組與空白對照組的各指標檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論

大劑量激素的使用可以引起TLR4信號通路過度激活從而介導激素性股骨頭壞死的發(fā)生。

股骨頭壞死；Toll樣受體4(TLR4)；破骨細胞；激素；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)；髓樣細胞分化因子88 (My D88)；NF-κB p65；單核細胞趨化蛋白(MCP-1)；大鼠

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死常常導致進行性的關(guān)節(jié)塌陷甚至發(fā)生創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎。激素類藥物的臨床應(yīng)用產(chǎn)生肥胖、高脂血癥、骨質(zhì)疏松癥和Cushing綜合征等副作用［1］。長期使用大劑量激素是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的最常見誘因，并逐漸成為首要發(fā)病原因，而激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制迄今仍未完全明晰［2-5］，也缺乏得到證實的預(yù)防及治療方法。研究表明，激素性骨壞死的發(fā)病機制可能為多因素相互聯(lián)系、互為影響的結(jié)局，包括骨質(zhì)疏松學說、脂肪栓塞學說、血管內(nèi)凝血異常學說、基因及蛋白表達異常學說等［6］。

Toll樣受體4(TLR4)是Toll樣受體家族中最重要和研究最廣泛的成員。作為一種模式識別受體，TLR4與自身免疫性疾病或炎性疾病聯(lián)系緊密［7］。骨骼系統(tǒng)的穩(wěn)定依賴于成骨細胞參與的骨形成和破骨細胞參與的骨吸收之間的動態(tài)平衡，而這個平衡受機體多個系統(tǒng)的嚴格調(diào)控。長期大劑量應(yīng)用激素類藥可能會干擾正常的免疫反應(yīng)，導致骨代謝失衡，造成病理性骨吸收增加。本實驗通過研究TLR4信號通路以進一步闡明激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用成年雄性SD大鼠(年齡8～12周)，體質(zhì)量230～250 g，購自西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心。所有大鼠均為無特定病原動物(SPFA)，清潔飼養(yǎng)，溫度控制在室溫(22±2)℃，相對濕度為(50±5)%，不限制食物和供水，光照每隔12 h循環(huán)給予。

1.2 大鼠激素性股骨頭壞死模型的建立及TAK242干預(yù)所有實驗操作均遵照國家衛(wèi)生部以及科技部制定的規(guī)章制度執(zhí)行。本動物實驗也已經(jīng)通過了西安交通大學醫(yī)學院倫理委員會的批準。各組間動物經(jīng)方差分析檢驗無統(tǒng)計學差異。48只大鼠隨機分為干預(yù)組和模型組，均給予甲強龍20 mg/kg左右臀大肌交替注射，1周1次，共8周。干預(yù)組大鼠在每次激素注射后均給予10 mg/kg TAK242(瑞沙托維)靜脈注射，所用劑量參照TAK 242在人類Ⅲ期藥物臨床試驗中所使用的劑量，通過人與大鼠按體表面積藥物劑量換算公式計算得出?？瞻讓φ战M12只大鼠在相同條件下飼養(yǎng)，但每次僅給予同等劑量生理鹽水注射。

1.3 動物取材及標本處理所有動物分別在第1次激素注射后8、10、12周時采用過量麻醉法處死，下腔靜脈采血2 mL并立即離心，取上清液保存在—70℃低溫冰箱中以備進行酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定。

無菌條件下取雙側(cè)股骨頭，其中左側(cè)股骨頭取出后立即保存于—70℃冰箱，右側(cè)股骨頭又隨機分為2個亞組，分別用100 mL/L中性甲醛溶液或25 mL/L戊二醛溶液固定備用。

1.4 ELISA檢測TRAP含量所有血清樣品均采用ELISA試劑盒進行測定。各組取50μL血清樣品至微量培養(yǎng)板中，然后加入50μL生物素共軛抗體，37℃孵育2 h。棄去各孔內(nèi)液體，20～22℃繼續(xù)孵育2 h。去離子水清洗3次，然后加入100μL辣根過氧化物酶標記物，再次孵育1 h。將培養(yǎng)板清洗干凈后加入100μL底物染色液。再次孵育1 h并清洗培養(yǎng)板，加入90μL底物溶液，室溫下孵育30 min。最后向各孔內(nèi)加入50μL反應(yīng)終止液。讀取各孔內(nèi)波長為λ450 nm的吸光度(A)值，然后計算出每一標準品和樣品的平均A值，采用零標準品作為平均值對照。最后根據(jù)所得數(shù)據(jù)利用Graph Pad Prism 5.0軟件繪制出曲線方程式并計算出抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的實際質(zhì)量濃度(pg/m L)。

1.5 組織病理學觀察及TRAP染色將取出后選定好的新鮮股骨頭用磷酸鹽緩沖液清洗干凈，立即浸入100 m L/L中性甲醛溶液中固定24～48 h，之后放入100 g/L中性EDTA溶液中進行脫鈣處理，時間為3～4周。脫鈣后石蠟包埋，沿冠狀面切成厚度4μm薄片。部分切片進行蘇木素-伊紅染色并觀察組織病理學改變。將其余石蠟切片進行TRAP染色，嚴格按照說明書操作步驟執(zhí)行。用eclipse 50i光學顯微鏡進行圖像采集，用Image-Pro-plus圖像分析軟件進行圖像分析。

TRAP陽性染色結(jié)果按照說明書給予的結(jié)果作為對照，其一般定位于軟骨下區(qū)域的骨髓組織及骨小梁表面，顏色為肉眼可見的紅色或粉紅色。另設(shè)染色過程中未加入酒石酸溶液的標本組作為陰性對照。染色區(qū)域盡量選擇相近的位置進行觀察。利用染色面積吸光度值進行分析評估，即在一個設(shè)定區(qū)域內(nèi)的所有陽性染色強度或密度值的總和［8］。每個樣本隨機選取10個不同視野觀察，取其平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.6 RT-PCR技術(shù)檢測TLR4、MyD88、NF-κB p65和MCP-1的mRNA表達PCR引物合成設(shè)計由大連Ta KaRa生物技術(shù)公司完成，采用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參對照，引物見表1。各樣本在冷的磷酸緩沖液中徹底清洗2次，Trizol法提取股骨頭內(nèi)總RNA。吸取0.5μg樣品總RNA，利用SuperScript TM II Rnase H逆轉(zhuǎn)錄酶100 U和0.5 μg引物片段來合成c DNA第一鏈。DNA擴增采用25μL包含100 ng cDNA模板反應(yīng)混合物的PCR Master Mix試劑盒來完成。PCR所有反應(yīng)試劑包括熒光染料SYBR green均選自DNA Engine Opticon RT-PCR反應(yīng)體系。每個樣本最后的結(jié)果均通過與內(nèi)參GAPDH進行標準化比較。

表1 各因子PCR引物序列Tab.1 The PCR primer sequence of each factor

1.7 Western blot檢測TLR4、MyD88、NF-κB p65和MCP-1的蛋白表達RIPA蛋白裂解液裂解股骨頭后，液體放入離心管12 000 r/min 4℃下離心10 min，收集上清液即為股骨頭總蛋白溶液。每次取約10μL總蛋白溶液，按4∶1比例加入SDS上樣緩沖液(62.5 mmol/L Tris/HCl，p H 6.8，20 g/L SDS，100 m L/L甘油，50 mmol/L二硫蘇糖醇，0.1 g/L溴酚藍)，聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳并進行蛋白半干轉(zhuǎn)膜后，50 g/L脫脂牛奶的TBS/Tween20(0.05 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，p H 7.6；10 m L/L Tween20)室溫下封閉膜1 h，加入各因子一抗(rabbit anti-rat，1∶1 000)4℃孵育過夜。將膜在TBS/ Tween20溶液中清洗3次，避光下加入辣根過氧化酶標記的二抗(goat anti-rabbit，1∶5 000)室溫下?lián)u床孵育2 h。采用辣根過氧化物酶標記的β-actin作為內(nèi)參對照。利用化學發(fā)光試劑盒進行暗室下發(fā)光并采集圖像信息，利用圖像分析軟件進行圖像分析處理。

1.8 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析處理。所有數(shù)據(jù)采用均值±標準差表示，3組間的比較先采用方差分析，當P＜0.05時，可采用LSD t檢驗進行組間的兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清中TRAP含量測定圖1顯示根據(jù)A值計算得出的各組各時間點TRAP濃度值，且可信度高(R2=0.988 7)。與空白對照組相比較，模型組TRAP濃度隨時間延長增加(P＜0.05)，但干預(yù)組的TRAP濃度雖然也有增長，但與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組與干預(yù)組相比較，TRAP含量在各時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠外周血清TRAP含量Fig.1 The concentration of TRAP in the peripheral serum of all rats

與對照組比較，*P＜0.01，#P＜0.05；與干預(yù)組比較，ΔP＜0.01，★P＜0.05。

2.2 骨壞死組織病理學觀察股骨頭壞死的組織病理學診斷依據(jù)為骨小梁內(nèi)骨細胞核固縮、消失，空骨陷窩形成且伴隨有骨髓組織壞死纖維化。激素注射后干預(yù)組和模型組骨壞死發(fā)生率分別為20.8%(5只)和45.8%(11只)，其中7只出現(xiàn)了雙側(cè)股骨頭壞死。兩組出現(xiàn)壞死的股骨頭內(nèi)空骨陷窩率分別為10.21%和36.97%。各組股骨頭的組織病理學觀察(圖2)顯示，干預(yù)組骨小梁內(nèi)出現(xiàn)了少數(shù)空骨陷窩，髓腔內(nèi)有輕度脂肪細胞堆積，并出現(xiàn)少數(shù)骨髓造血細胞壞死及骨髓纖維化，多核巨細胞及破骨細胞增加不明顯。模型組骨小梁變得稀疏，部分斷裂，骨小梁內(nèi)空骨陷窩較多；骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)造血細胞的壞死，骨髓纖維化；大量脂肪細胞變性聚集，部分融合成泡；破骨細胞大量活化增殖，可以觀察到部分破骨細胞附著在骨小梁表面吞噬壞死骨質(zhì)。模型組骨壞死表現(xiàn)隨時間延長逐漸加重。空白對照組內(nèi)未觀察到明顯的骨壞死表現(xiàn)，空骨陷窩及骨髓壞死均不明顯。

圖2 HE染色觀察造模后股骨頭壞死表現(xiàn)Fig.2 Femoral head osteonecrosis observed by HE staining

2.3 TRAP染色觀察空白對照組陽性染色面積較少，干預(yù)組較多，而模型組陽性染色結(jié)果最強(圖3)。干預(yù)組與空白對照組相比，在8周時差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但10周和12周時差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組與空白對照組相比在各時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組與干預(yù)組相比較，在8周時差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但在10周和12周時差異明顯(P＜0.05)。

2.4 各組各時間點TLR4、MyD88、NF-κB p65和MCP-1的mRNA表達變化與空白對照組相比較，模型組股骨頭內(nèi)所有因子mRNA表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；干預(yù)組內(nèi)各時間點各因子mRNA表達差異均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；模型組與干預(yù)組相比較，TLR4和單核細胞趨化蛋白(MCP-1)在各時間點差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，NF-κB p65在12周時有差異(P＜0.05)，而髓樣細胞分化因子88(My D88)在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖4)。

2.5 各組各時間點股骨頭內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB p65和MCP-1的蛋白表達Western blot檢測顯示，模型組內(nèi)各因子蛋白表達隨時間延長顯著增加。與空白對照組相比較，模型組各因子在各時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而干預(yù)組與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；模型組與干預(yù)組相比較，TLR4蛋白表達在8周、12周時差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，My D88、NF-κB p65在各時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，MCP-1在10周、12周差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖5)。

3 討 論

國內(nèi)外眾多學者研究了多種動物模型以進一步闡明激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制。目前最常用的造模方法是脂多糖(LPS)聯(lián)合甲強龍［9］。然而，這種造模方法與臨床上激素性股骨頭壞死患者的發(fā)病機制存在一定的偏倚，并不能精確反映出骨壞死患者的實際病理學特征。大鼠股骨頭擁有和人類相同的前傾角和頸干角結(jié)構(gòu)，因此股骨頭的生物力學較其他造模動物與人類更為相近。本實驗采用對成年SD大鼠大劑量單純注射臨床上最常用的大劑量激素類藥物甲強龍方法進行股骨頭壞死造模，從而使動物模型盡量與人類發(fā)生骨壞死相近。

圖3 各組大鼠股骨頭內(nèi)TRAP陽性染色結(jié)果Fig.3 The TRAP positive staining in the femoral head of all rats(×100)

本實驗成功構(gòu)建了大鼠激素性股骨頭壞死模型，模型組骨壞死病理學表現(xiàn)和破骨細胞活化增殖均比較明顯。而干預(yù)組骨壞死表現(xiàn)及破骨細胞活性均較模型組明顯減輕，并且與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，從而反向證實了免疫學信號通路在激素性股骨頭壞死中的重要意義，通過抑制可以減緩骨壞死的發(fā)生。從8周到12周，可以明顯觀察到模型組骨壞死的組織病理學表現(xiàn)逐漸加重，壞死骨細胞增多，骨小梁稀疏變細，部分斷裂，骨髓組織壞死纖維化明顯；軟骨下骨骺區(qū)域也出現(xiàn)了壞死后修復(fù)的表現(xiàn)。而應(yīng)當指出的是，大鼠的股骨頭骨骺線是終身存在而不閉合的，此結(jié)構(gòu)和人類是有一定區(qū)別。此外，大鼠股骨頭壞死后很難出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)面塌陷，而在人類則較為常見，這可能跟大鼠組織修復(fù)能力較強有關(guān)［10］。

圖4 各組大鼠股骨頭內(nèi)各因子的mRNA表達結(jié)果Fig.4 The mRNA expressions of all factors in the femoral head of all rats

TLR4作為一種主要的模式識別受體，主要表達在單核/巨噬細胞系以及樹突狀細胞表面，可鑒定病原微生物、識別疾病相關(guān)分子模式、參與機體先天性或獲得性免疫反應(yīng)。TLR4也可以在骨細胞中表達，它的過度活化可以引起破骨細胞的大量分化增殖。目前研究發(fā)現(xiàn)，TLR4信號通路分為MyD88依賴型和非依賴型兩種，其中TLRs參與My D88依賴型模式較多。MyD88在MyD88依賴性TLR4信號通路中可以介導TLR4信號通道下游NF-κB的激活，NF-κB也可以通過募集MyD88等相關(guān)因子進行相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導［11］，并且聯(lián)合其他相關(guān)因子參與了破骨細胞的活化。NF-κB作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)及免疫基因的表達，目前已證實活化的NF-κB廣泛存在于血管內(nèi)皮細胞、單核/巨噬細胞系和平滑肌細胞等細胞［12］。在破骨細胞增殖和破骨前體細胞分化成熟過程中，NF-κB參與的信號通路發(fā)揮最主要作用。此外，NF-κB還可激活MCP-1，誘導單核/巨噬細胞系分化，最終產(chǎn)生大量的破骨細胞。MCP-1是一種存在于骨髓組織中的重要細胞因子，在促使單核/巨噬細胞系向破骨細胞轉(zhuǎn)化過程中扮演著重要角色，并且可以募集大量的破骨細胞到骨組織表面引起骨破壞。同時，在單核/巨噬細胞向骨細胞活化過程中也可以分泌MCP-1等一系列相關(guān)因素介導骨溶解，這是進行骨重建的一個重要過程。TAK 242是一種選擇性的TLR4受體拮抗劑，目前已經(jīng)通過Ⅲ期臨床藥物實驗觀察階段?？梢酝ㄟ^競爭性抑制TLR4與其配體的結(jié)合來抑制胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的信號傳導［13-14］，但是并不影響TLR4蛋白質(zhì)片段互補的二聚化作用［15］，使其不能進行信號的下游傳導［16-17］，從而抑制TLR4信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子——NF-κB及其配體的激活，進而可減少破骨細胞的活化。這也是一種針對TLR4所介導的相關(guān)疾病的較新的治療途徑。我們利用TLR4的特異性拮抗劑——TAK 242作為干預(yù)對照組。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組TLR4信號通路內(nèi)的關(guān)鍵因子表達在應(yīng)用大劑量激素后隨時間延長明顯增加，較其他兩組有明顯差異，而干預(yù)組內(nèi)各因子表達較對照組增加無明顯差異。表明激素類藥物可以誘導TLR4信號通路的過度激活，引起一種免疫級聯(lián)效應(yīng)，使大量破骨細胞活化增殖，最終引起骨質(zhì)疏松，造成股骨頭壞死。此外，模型組血清中TRAP含量以及股骨頭內(nèi)TRAP、MCP-1的表達隨時間延長明顯增加，較其他兩組有明顯差異，而干預(yù)組內(nèi)以上指標變化較對照組未見明顯差異，證明了激素可以促進單核/巨噬細胞系的破骨化效應(yīng)，從而引起破骨細胞的大量活化增殖［18］。激素可以打破體內(nèi)正常的免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)，擾亂正常的免疫反應(yīng)，破壞免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，進而通過TLR4受體通路活化大量破骨細胞，使正常的骨代謝失衡。然而，本實驗最長的觀察時間僅為12周，如果能適當延長造模后觀察時間可以對激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制進行更好研究。

圖5 各組大鼠股骨頭內(nèi)各因子的蛋白表達結(jié)果Fig.5 The protein expression levels of all factors in the femoral head of all rats

一般說來，骨骼系統(tǒng)終生處于骨形成和骨吸收共同作用的動態(tài)平衡中，成骨細胞和破骨細胞各自發(fā)揮著重要作用，維持鈣磷代謝和骨骼完整。破骨細胞的過度激活使骨吸收大于骨形成，破壞骨小梁的正常結(jié)構(gòu)，在受到外界應(yīng)力的影響下很容易導致股骨頭內(nèi)微骨折的發(fā)生。骨組織在遭到破壞損傷的同時，其自身修復(fù)過程也會隨之在相鄰區(qū)域內(nèi)啟動。然而，一旦骨吸收破壞作用占據(jù)主導，就會加重骨組織損傷，并且形成一種惡性循環(huán)，造成軟骨下骨小梁不可逆的進行性破壞，最終導致關(guān)節(jié)面的塌陷［19］。免疫系統(tǒng)中的多個因子都在骨髓中產(chǎn)生，骨組織也可以通過釋放多種細胞因子來合理調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。因此，骨壞死的發(fā)病機制與免疫系統(tǒng)有一定的關(guān)聯(lián)，兩者之間起到了一種相互關(guān)聯(lián)的雙向調(diào)節(jié)作用。本實驗力在闡明了一種關(guān)于骨壞死發(fā)病機制的較新穎理論，將骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)較好的結(jié)合起來，初步證實了骨壞死中也存在著免疫相關(guān)機制，在一定程度上也促進了骨免疫學理論的研究進展［20-21］。正常骨代謝穩(wěn)態(tài)的維持需要多個系統(tǒng)多因子之間的協(xié)調(diào)控制，這其中就包含有免疫系統(tǒng)的作用，使其處在一種正常的動態(tài)平衡之中。

總之，TLR4信號通路在激素性股骨頭壞死中扮演著重要角色，過度激活可以使破骨細胞大量活化增殖從而導致股骨頭壞死。因此，研制出針對于體內(nèi)免疫通路的合理調(diào)節(jié)、減輕對破骨細胞分化影響的相關(guān)藥物及生物制劑，可能在將來會更有效地降低臨床上因長期大劑量應(yīng)用激素類藥物患者的骨壞死發(fā)病率。

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(編輯 國 榮)

The excessive activation of Toll-like receptor 4 signaling pathway leads to steroid-induced femoral head osteonecrosis in rats

TIAN Lei1，ZHOU Dong-sheng1，SUN Shui1，ZHANG Chen2，
FAN Li-hong2，WANG Kun-zheng2(1.Department of Orthopedic Surgery，Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021；2.Department of Orthopedic Surgery，the Second Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China)

ObjectiveTo establish a rat model to investigate Toll-like receptor 4(TLR4)signaling pathway associated with the pathogenesis of steroid-induced femoral head osteonecrosis.MethodsAdult male SD rats were randomly divided into model group and intervention group with 24 rats in each，and then were injected intramuscularly with 20 mg/kg methylprednisolone(MP)via bilateral gluteus maximus alternatively once a week for 8 weeks.The rats in intervention group were injected intravenously with 10 mg/kg TAK242 before each MP administration.A control group consisting of 12 rats

saline injection.All animals were sacrificed at week 8，10 or 12 from the first MP injection，respectively.The analyses of histopathology and TRAP staining were performed and the concentration of tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)in serum was tested.The m RNA and protein expressions of TLR4，My D88，NF-κB p65 and MCP-1 were detected by quantitative real-time PCR and Western blot.ResultsFemoral head osteonecrosis was observed in the model rats，and the concentration and positive staining of TRAP，the m RNA and protein expression levels of all the factors were enhanced significantly inmodel group compared with that in intervention group and control group(P＜0.05).There was no significant difference in the tested factors between intervention group and control group(P＞0.05).ConclusionExcessive dosage of corticosteroids can induce femoral head osteonecrosis via the abnormal activation of TLR4 signaling pathway.

femoral head osteonecrosis；Toll-like receptor 4(TLR4)；osteoclast；corticosteroid；tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)；My D88；NF-κB p65；MCP-1；rat

R68

A

1671-8259(2014)05-0622-08

10.7652/jdyxb201405011

2013-08-21

2013-12-16

國家自然科學基金資助項目(No.81101363) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81101363)

王坤正，教授，博士生導師.E-mail：wkzh1955@gmail.com

田雷(1982-)，男(漢族)，博士.研究方向：骨壞死的基礎(chǔ)與臨床研究.E-mail：osteotianlei@163.com

時間：2014-07-22 16∶17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1617.004.html