Ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用及對(duì)中樞和胃腸道c-Fos表達(dá)的影響

王 燕，史海濤，秦 斌，姜 炅，趙菊輝，趙紅莉

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710004)

Ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用及對(duì)中樞和胃腸道c-Fos表達(dá)的影響

王 燕，史海濤，秦 斌，姜 炅，趙菊輝，趙紅莉

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710004)

目的觀察靜脈注射ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用及對(duì)中樞和胃腸道c-Fos表達(dá)的影響。方法大鼠禁食24 h，靜脈注射ghrelin(2、5、10、20μg/kg)，經(jīng)預(yù)先埋置在十二指腸內(nèi)的導(dǎo)管注入伊文氏藍(lán)溶液，觀察不同劑量ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6對(duì)其作用的影響。采用免疫組織化學(xué)和圖像分析方法觀察靜脈給予ghrelin對(duì)大鼠中樞和胃腸道的c-Fos蛋白的激活情況；觀察(D-Lys3)GHRP-6對(duì)ghrelin作用的影響。結(jié)果①靜脈給予ghrelin 2μg/kg對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)顯著影響，給予ghrelin 5、10、20μg/kg可劑量依賴性促進(jìn)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，此作用可被(D-Lys3)GHRP-6阻斷。②靜脈注射ghrelin可激活中樞多個(gè)部位的c-Fos表達(dá)，包括下丘腦室旁核、弓狀核、杏仁內(nèi)側(cè)核、迷走神經(jīng)背核、孤束核、延髓最后區(qū)和胸腰段脊髓背角c-Fos均有表達(dá)；胃、十二指腸、空腸和近端結(jié)腸腸神經(jīng)叢的c-Fos有不同程度的表達(dá)，其中以胃和近端結(jié)腸的c-Fos表達(dá)最為顯著。應(yīng)用ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6可抑制ghrelin激活的c-Fos表達(dá)。結(jié)論Ghrelin可促進(jìn)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，其促動(dòng)力作用由其受體GHS-R所介導(dǎo)；靜脈給予ghrelin可通過(guò)腸神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)小腸運(yùn)動(dòng)。

ghrelin；小腸轉(zhuǎn)運(yùn)；生長(zhǎng)激素促分泌素受體；胃腸動(dòng)力；c-Fos

Ghrelin是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的內(nèi)源性配體［1］，是由28個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有分布。Ghrelin受體的激活可發(fā)揮多種生理學(xué)作用，可刺激胃酸分泌和胃排空，加快小腸蠕動(dòng)，改善術(shù)后腸梗阻癥狀［2-5］。我們近來(lái)研究也發(fā)現(xiàn)，ghrelin可促進(jìn)大鼠消化間期復(fù)合肌電活動(dòng)［6］，但關(guān)于ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響很少有研究。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)和腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)在胃腸運(yùn)動(dòng)中起著重要作用。以往研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin可通過(guò)中樞和外周機(jī)制促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，然而關(guān)于其具體作用機(jī)制的研究很少見(jiàn)報(bào)道。新近研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射ghrelin導(dǎo)致大鼠攝食增加，下丘腦弓狀核、室旁核的c-Fos表達(dá)增加［7］。腦室和室旁核注入ghrelin可促進(jìn)大鼠攝食，增加與攝食相關(guān)核團(tuán)，如下丘腦室旁核、背內(nèi)側(cè)核、弓狀核、延髓孤束核和最后區(qū)的c-Fos表達(dá)［8-10］。然而靜脈注射ghrelin還可以增加哪些腦區(qū)的c-Fos表達(dá)，是否可增加與促消化道動(dòng)力相關(guān)的核團(tuán)的c-Fos表達(dá)，是否能增加脊髓的c-Fos表達(dá)，目前尚不清楚。靜脈注射ghrelin對(duì)完整消化道c-Fos表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)觀察了靜脈給予ghrelin對(duì)大鼠消化道和上述腦區(qū)c-Fos表達(dá)的影響，重點(diǎn)分析了與促消化道運(yùn)動(dòng)相關(guān)核團(tuán)的c-Fos表達(dá)的變化，并觀察了受體拮抗劑對(duì)ghrelin作用的影響，為闡明并進(jìn)一步研究ghrelin的促動(dòng)力機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康SD大鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量220～240 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器和試劑Ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3) GHRP-6由美國(guó)Anaspec公司提供，兔抗鼠c-Fos抗體由美國(guó)Santa Cruz公司提供，Ghrelin由美國(guó)鳳凰生物制品有限公司提供。

1.3 小腸轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)①埋置十二指腸導(dǎo)管。大鼠禁食18 h，腹腔注射100 g/L水合氯醛400 mg/kg麻醉，外科無(wú)菌操作下沿腹正中線剪開腹壁肌肉以及腹膜，用18 G針頭在十二指腸距幽門1 cm處刺入腸腔，將一根聚乙烯導(dǎo)管(外徑1.0 mm，內(nèi)徑0.7 mm)經(jīng)穿刺孔置入十二指腸腔內(nèi)，導(dǎo)管在腸腔內(nèi)留置約1cm，用絲線將導(dǎo)管縫合固定。在右上腹和肩胛間區(qū)之間做皮下隧道，將導(dǎo)管固定于體外，以防鼠咬損壞。用大頭針?lè)庾?dǎo)管的露出端。術(shù)后大鼠分籠單獨(dú)清潔飼養(yǎng)，恢復(fù)1周可用于實(shí)驗(yàn)。②小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)量。實(shí)驗(yàn)大鼠隨即分為5組(n=8)，禁食24 h，分別經(jīng)尾靜脈給予ghrelin(2、5、10、20μg/kg，溶于0.3 m L生理鹽水)。對(duì)照組給予0.3 m L生理鹽水。經(jīng)靜脈給予藥物或生理鹽水后，經(jīng)十二指腸導(dǎo)管注入0.1 mL伊文氏藍(lán)溶液(50 mg/mL溶于生理鹽水中)。用0.1 mL生理鹽水沖洗導(dǎo)管，以保證導(dǎo)管內(nèi)的染料均進(jìn)入十二指腸。20 min后，脫頸椎處死大鼠，立即打開腹腔，用絲線扎緊幽門和回盲瓣，剪取上端自幽門、下端至回盲瓣的腸管。仔細(xì)分離腸系膜，將小腸擺放成直線。避免拉伸小腸，以防止腸內(nèi)容物流動(dòng)。測(cè)量從幽門到回盲瓣的腸管長(zhǎng)度為“小腸總長(zhǎng)度”，從幽門至染料移行的前沿為“染料移行長(zhǎng)度”，計(jì)算小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率(%)=［染料移行長(zhǎng)度(cm)/小腸總長(zhǎng)度(cm)］×100%。

為觀察ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6在ghrelin促小腸轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，經(jīng)尾靜脈給予(DLys3)GHRP-6(0.37 mg/kg)，10 min后再給予ghrelin(20μg/kg)，觀察小腸轉(zhuǎn)運(yùn)變化，方法同上。

1.4 染色標(biāo)本制備大鼠每組6只，分別經(jīng)頸靜脈注入ghrelin，生理鹽水，生理鹽水+ghrelin，(D-Lys3) GHRP-6+ghrelin。上述藥物劑量為ghrelin 20μg/kg，ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6 0.37 mg/kg。注射藥物后大鼠禁食，自由飲水，90 min后用100 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉。經(jīng)左心室穿刺至主動(dòng)脈，用生理鹽水快速?zèng)_血管，用40 g/L多聚甲醛緩沖液經(jīng)升主動(dòng)脈灌注。開顱取腦和胸腰段脊髓，分別剪取胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，生理鹽水沖凈，經(jīng)多聚甲醛緩沖液后固定8 h，20～30 g/L蔗糖溶液梯度脫水，液氮速凍后，組織包埋劑包埋，恒冷冰凍切片機(jī)切片。

1.5 c-Fos染色采用SABC法進(jìn)行c-Fos免疫組織化學(xué)染色。腦片采用漂染法，胃腸組織切片采用片染法。胃腸組織切片在PBS中浸泡5 min，采用微波修復(fù)(高火3 min，再小火10 min)，晾至室溫。腦片在PBS中浸泡5 min，再和修復(fù)后的切片一起用稀鹽酸泡30 min，以使細(xì)胞核形態(tài)清楚。PBS洗10 min×3次，30 m L/L Triton X-100室溫孵育40 min，PBS漂洗5 min×3次，30 m L/L H2O2室溫孵育30 min，PBS漂洗10 min×3次。正常山羊血清封閉(37℃，90 min)，兔抗鼠c-Fos抗體孵育(1∶500，4℃42 h)。PBS漂洗20 min×3次，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG孵育(4℃18 h)，PBS漂洗20 min×3次。ABC復(fù)合物孵育(37℃30 min)，PBS漂洗20 min×3次，DAB顯色，PBS沖洗終止反應(yīng)。腦片進(jìn)行裱片、晾干，再和胃腸組織切片一起脫水、透明、封片。用0.01 mol/LPBS代替第一抗體做陰性對(duì)照。

1.6c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)共選取14個(gè)中樞核團(tuán)或亞核進(jìn)行分析，其中包括GHS-R分布較多的部位以及對(duì)消化道功能有重要調(diào)控作用的核團(tuán)。對(duì)每只大鼠每個(gè)核團(tuán)的c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)時(shí)，必須在相同平面選擇6張腦片，胸腰段脊髓選取20張脊髓片計(jì)數(shù)，在高倍鏡下結(jié)合Paxinos-Waston圖譜分別數(shù)兩側(cè)核團(tuán)，算出平均值(在室旁核給藥時(shí)數(shù)一側(cè)室旁核)。胃腸道c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞的記數(shù)采用每只大鼠選取6張切片，每張切片在高倍鏡下隨機(jī)數(shù)5個(gè)視野，算出平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果采用表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析(SPSS 13.0軟件)，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊同，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 靜脈注射ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響對(duì)照組大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為(62.7±6.2)%。與對(duì)照組相比，靜脈給予ghrelin 2μg/kg時(shí)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［(70.2±6.4)%，P＞0.05］，給予ghrelin 5μg/kg［小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率(73.7±7.1)%，P＜0.05］，10μg/kg［小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為(75.5±6.9)%，P＜0.01］和20μg/kg［小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為(80.9±8.5)%，P＜0.001］呈劑量依賴性地促進(jìn)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。Ghrelin受體拮抗劑(DLys3)GHRP-6單獨(dú)應(yīng)用對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)有抑制作用［小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為(52.6±7.6)%，P＜0.05］，與ghrelin聯(lián)合應(yīng)用則顯著阻斷了其促動(dòng)力作用［轉(zhuǎn)運(yùn)率為(65.7 ±7.2)%，P＜0.05，圖1］。

圖1 靜脈注射ghrelin對(duì)禁食24 h大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig.1 Effects of ghrelin on small intestinal transit in 24 h fasted rats()

2.2 靜脈注射ghrelin對(duì)中樞c-Fos表達(dá)的影響c-Fos的免疫反應(yīng)陽(yáng)性為胞核呈黃色或深棕色，胞質(zhì)無(wú)表達(dá)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組大鼠的c-Fos表達(dá)很少，而給大鼠靜脈注射ghrelin后可誘導(dǎo)CNS內(nèi)廣泛部位的c-Fos表達(dá)，最突出的部位是下丘腦室旁核(periventricular nucleus，PVN)、弓狀核(arcuate nucleus，ARC)、杏仁內(nèi)側(cè)核(medial amygdaloid nucleus，Me)、迷走神經(jīng)背核(dorsal motor nucleus of vagus，DMN)、孤束核(nucleus of solitary tract，NTS)、延髓最后區(qū)(area postrema，AP)及胸腰段脊髓背角(cornu dorsale medullae spinalis，CDMS)(圖2、圖3)。然而，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus，VMH)、下丘腦背內(nèi)側(cè)核(dorsomedial hypothalamic nucleus，DMH)、外側(cè)區(qū)(lateral hypothalamic area，LH)、海馬(hippocamp，HIP)、杏仁中央核(central amygdaloid nucleus，Ce A)、杏仁基底外側(cè)核(basolateral nucleus of the amygdala，BL)及腦橋臂旁核(parabrachial nucleus，PBN)均未見(jiàn)表達(dá)。

2.3 靜脈注射ghrelin對(duì)胃腸道c-Fos表達(dá)的影響鹽水對(duì)照組大鼠的胃腸道腸神經(jīng)叢c-Fos表達(dá)很少，甚至沒(méi)有表達(dá)。靜脈注射ghrelin不同程度地增加了大鼠胃、十二指腸、空腸和近端結(jié)腸的腸神經(jīng)叢的c-Fos表達(dá)，其中以胃和近端結(jié)腸的c-Fos表達(dá)最為顯著(圖4、圖5)?；啬c、盲腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸的c-Fos表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。

2.4 Ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin激活中樞c-Fos的影響靜脈給予ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6后再給予ghrelin，觀察腦內(nèi)各核團(tuán)的c-Fos表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)所選取的核團(tuán)為靜脈給予ghrelin后c-Fos表達(dá)增加的核團(tuán)，包括下丘腦室旁核、弓狀核、迷走神經(jīng)背核，孤束核、延髓最后區(qū)，胸腰段脊髓背角、杏仁內(nèi)側(cè)核。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6不同程度地抑制了ghrelin激活的中樞各核團(tuán)c-Fos的表達(dá)，即c-Fos表達(dá)明顯減少(表1)。

2.5 Ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin激活胃腸道c-Fos表達(dá)的影響靜脈給予(DLys3)GHRP-6后再給予ghrelin，觀察腸神經(jīng)叢的c-Fos表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)選取的腸神經(jīng)叢為靜脈給予ghrelin后c-Fos表達(dá)增加的腸神經(jīng)叢，包括胃、十二指腸、空腸和近端結(jié)腸腸神經(jīng)叢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6不同程度地抑制了ghrelin激活的胃腸神經(jīng)叢c-Fos表達(dá)，即c-Fos表達(dá)均明顯減少(表2)。

圖2 靜脈注射ghrelin對(duì)中樞c-Fos表達(dá)的影響Fig.2 Expression of c-Fos in the CNS after intravenous injection of ghrelin

圖3 靜脈注射ghrelin后中樞各核團(tuán)c-Fos表達(dá)的比較Fig.3 Comparison of c-Fos expression in various nucleus clusters in the CNS after intravenous injection of ghrelin

圖4 靜脈注射ghrelin對(duì)胃腸道c-Fos表達(dá)的影響Fig.4 Expression of c-Fos in the digestive tract after intravenous injection of ghrelin

表1 Ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin激活中樞c-Fos的影響Tab.1 Expression of c-Fos in the CNS after injection of(D-Lys3)GHRP-6(n=6，)

表1 Ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin激活中樞c-Fos的影響Tab.1 Expression of c-Fos in the CNS after injection of(D-Lys3)GHRP-6(n=6，)

與生理鹽水+ghrelin組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

hrelin 40.85±4.67 94.28±9.00 41.14±4.21 60.65±7.51 54.17±8.27 35.38±4.09 28.07±2.57 (D-Lys3)GHRP-6+ghrelin 19.67±1.73**41.85±3.64***25.58±4.40*30.32±4.15**19.21±2.89**16.24±2.10**13.17±0.96組別弓狀核室旁核杏仁內(nèi)側(cè)核延髓最后區(qū)孤束核迷走神經(jīng)背核胸腰段脊髓背角生理鹽水+g ***

表2 Ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin激活胃腸道c-Fos表達(dá)的影響Tab.2 Expression of c-Fos in the digestive tract after injection of(D-Lys3)GHRP-6(n=6，)

表2 Ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin激活胃腸道c-Fos表達(dá)的影響Tab.2 Expression of c-Fos in the digestive tract after injection of(D-Lys3)GHRP-6(n=6，)

與生理鹽水+ghrelin組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

hrelin 7.62±0.86 7.16±0.77 4.84±0.73 8.54±1.03 (D-Lys3)GHRP-6+ghrelin 3.00±0.49**3.21±0.47**2.61±0.45*4.36±0.55組別胃十二指腸空腸近端結(jié)腸生理鹽水+g **

圖5 靜脈注射ghrelin后胃腸道c-Fos表達(dá)的比較Fig.5 Comparison of c-Fos expression in the digestive tract after intravenous injection of ghrelin

3 討 論

Ghrelin作為新近發(fā)現(xiàn)的腦腸肽，其生理作用及其機(jī)制也越來(lái)越受到重視。新近研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin可加速胃排空、增加胃酸分泌及促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)［11-14］。目前，關(guān)于ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響很少有研究。FUKUDA等［15］通過(guò)觀察ghrelin對(duì)大鼠胃排空和小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，提出ghrelin可能通過(guò)內(nèi)在的神經(jīng)通路和對(duì)辣椒辣素敏感的感覺(jué)傳入神經(jīng)系統(tǒng)促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，但沒(méi)有研究量效關(guān)系和ghrelin受體拮抗劑的作用。并且FUKUDA等采用將Na51CrO4灌入大鼠胃中的方法來(lái)觀察小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，這受到胃排空的影響，并不是單獨(dú)的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)在大鼠十二指腸埋置導(dǎo)管，經(jīng)導(dǎo)管注入伊文氏藍(lán)來(lái)觀察ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，并建立量效曲線，觀察了ghrelin受體拮抗劑的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜脈注射ghrelin可促進(jìn)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，并呈劑量依賴性關(guān)系，ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6顯著阻斷ghrelin的促動(dòng)力作用。

BRON等［2］通過(guò)原位雜交等方法證實(shí)ghrelin受體GHS-R存在于大鼠的下丘腦、延髓、心臟、胃腸道等處。DASS和XU等［3-5］利用熒光免疫組織化學(xué)方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結(jié)腸也發(fā)現(xiàn)ghrelin及其受體。然而，ghrelin調(diào)控胃腸運(yùn)動(dòng)的具體機(jī)制尚不明確，研究其對(duì)神經(jīng)元的作用則十分必要。C-Fos基因是一種即刻早期基因，被稱為核內(nèi)“第三信使”。在生理情況下，大多數(shù)細(xì)胞中有很低水平的c-Fos表達(dá)。在藥物、電刺激及缺血等情況下，c-Fos表達(dá)可在數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘內(nèi)顯著增多。因此，c-Fos的表達(dá)可作為神經(jīng)元受刺激后激活的標(biāo)志。MASUDA等［16］發(fā)現(xiàn)靜脈注射ghrelin 0.8～20μg/kg可刺激胃酸分泌和胃排空。FUJINO等［17］證實(shí)靜脈注射ghrelin 4～40μg/kg均可促進(jìn)禁食期間的胃腸動(dòng)力。我們以往的研究也發(fā)現(xiàn)，ghrelin 20μg/kg可顯著增強(qiáng)消化間期胃腸的肌電活動(dòng)［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)選定20μg/kg為觀察ghrelin對(duì)胃腸道c-Fos表達(dá)變化的靜脈給藥量，認(rèn)為其為促進(jìn)胃腸動(dòng)力的有效劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靜脈注射ghrelin可增加下丘腦室旁核、弓狀核和杏仁內(nèi)側(cè)核的c-Fos表達(dá)，同時(shí)增加迷走神經(jīng)背側(cè)復(fù)合體(dorsal vagal complex，DVC)(包括迷走神經(jīng)背核、孤束核及最后區(qū))、胸腰段脊髓背角的c-Fos表達(dá)；臂旁核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核及海馬等處的c-Fos表達(dá)也有增加，但與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用ghrelin受體拮抗劑顯著減弱了ghrelin的作用。然而，RUTER等［7］研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射ghrelin不能增加DVC的c-Fos表達(dá)。我們的研究與此有差異，這可能是由于靜脈和腹腔兩種給藥途徑不同所致，或由于尚不明確的其他因素(如給藥劑量不同或大鼠種屬不同)。

下丘腦和腦干是調(diào)節(jié)機(jī)體功能的兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)。下丘腦與其他腦區(qū)有復(fù)雜而廣泛的纖維聯(lián)系，它不僅通過(guò)神經(jīng)和血管途徑調(diào)節(jié)腦垂體前、后葉激素的分泌和釋放，而且還參與調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)，如控制水鹽代謝、調(diào)節(jié)體溫、攝食、睡眠等內(nèi)臟活動(dòng)以及情緒等。已有研究證實(shí)下丘腦的弓狀核和室旁核參與CNS對(duì)胃腸道功能的調(diào)節(jié)［18-20］。腦干的主要功能是維持個(gè)體生命，包括心跳、呼吸、消化、體溫、睡眠等重要生理功能。腦干與下丘腦有密切聯(lián)系，腦干的孤束核神經(jīng)元可發(fā)出纖維直接投射到達(dá)下丘腦，同時(shí)也可接受下丘腦的下行投射。腦干的DVC，可將來(lái)自脊髓的神經(jīng)沖動(dòng)傳至大腦，是腦腸軸的中樞整合部位。本研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射ghrelin使下丘腦核團(tuán)和腦干DVC的c-Fos表達(dá)增加，提示下丘腦核團(tuán)參與了ghrelin的生物學(xué)作用，腦干參與ghrelin的信息傳遞。

然而，c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞在一些核團(tuán)的分布與GHS-R的分布并不完全一致。例如，在下丘腦外側(cè)區(qū)、海馬CA3和CA4區(qū)和杏仁基底內(nèi)側(cè)核的GHS-R分布很豐富，但卻缺乏c-Fos表達(dá)。我們推測(cè)ghrelin對(duì)這些核團(tuán)c-Fos的激活可能需要其他因子的參與(至少對(duì)c-Fos來(lái)說(shuō))，或者通過(guò)除GHS-R之外的受體發(fā)揮其功能。

靜脈注射ghrelin使下丘腦室旁核和弓狀核的c-Fos表達(dá)顯著增多。以往研究表明，GHS-R在室旁核和弓狀核上均有廣泛表達(dá)，ghrlein在弓狀核也有較多表達(dá)［1，21］。弓狀核是表達(dá)許多攝食相關(guān)神經(jīng)肽的感受器，如瘦素及ghrelin。弓狀核神經(jīng)纖維聯(lián)系十分廣泛，與室旁核、腹內(nèi)側(cè)核、孤束核等都有豐富的纖維投射，除了在攝食調(diào)節(jié)和能量平衡中起重要作用外，還直接參加消化道運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié)［20-22］。室旁核接受來(lái)自弓狀核的神經(jīng)纖維，兩者共同參與中樞對(duì)攝食、能量代謝、胃腸活動(dòng)等的調(diào)控。由于弓狀核位于血腦屏障之外，可以直接接受來(lái)自外周的傳入信號(hào)，我們推測(cè)靜脈注射的ghrelin還有可能直接作用于弓狀核上的GHS-R，通過(guò)弓狀核發(fā)出的神經(jīng)纖維投射到室旁核，間接激活室旁核的c-Fos，通過(guò)受體后的信號(hào)傳導(dǎo)作用于下丘腦及低位腦干，最后經(jīng)過(guò)迷走神經(jīng)將神經(jīng)沖動(dòng)傳至胃腸平滑肌，調(diào)節(jié)大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)。

ENS是存在于胃腸壁內(nèi)一個(gè)獨(dú)立于大腦之外的完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，其釋放的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)種類很多，控制胃腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌、血流及水、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等活動(dòng)，并把胃腸與CNS及ANS聯(lián)系起來(lái)。大量研究表明，ENS有其獨(dú)立性，它包括控制胃腸運(yùn)動(dòng)的反射回路［23-24］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靜脈注射ghrelin不同程度地增加了大鼠胃、十二指腸、空腸和近端結(jié)腸腸神經(jīng)叢的c-Fos表達(dá)，其中以胃和近端結(jié)腸的c-Fos表達(dá)增加最為顯著，這可能是由于胃和近端結(jié)腸中的GHS-R含量最為豐富所致?；啬c、盲腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸的c-Fos表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能是因?yàn)镚HS-R在這些部位的分布相對(duì)較少所致。消化系統(tǒng)受ANS和ENS的雙重支配，ENS(黏膜下神經(jīng)叢和肌間神經(jīng)叢網(wǎng)絡(luò))既包括傳入神經(jīng)元、傳出神經(jīng)元，也包括中間神經(jīng)元，能完成局部反射。本研究結(jié)果提示，靜脈給予ghrelin可能直接作用于ENS，通過(guò)局部反射調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)。由于ENS中的第一級(jí)傳入神經(jīng)元胞體的軸突可深入到腰骶髓的后角，或經(jīng)由迷走神經(jīng)到達(dá)腦干和下丘腦。因此，進(jìn)一步提示靜脈給予ghrelin也可能通過(guò)激活脊髓的c-Fos，通過(guò)脊髓-腦干DVC-下丘腦通路，將信號(hào)傳至中樞，調(diào)節(jié)胃腸活動(dòng)。

綜上所述，ghrelin可劑量依賴性地促進(jìn)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，其受體拮抗劑則抑制小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。靜脈給予ghrelin可通過(guò)ENS和CNS調(diào)節(jié)小腸運(yùn)動(dòng)。這些或許為闡明ghrelin的生理學(xué)作用及其機(jī)制提供依據(jù)，為治療胃腸動(dòng)力障礙性疾病提供一定的理論基礎(chǔ)。

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(編輯 韓維棟)

Effects of ghrelin on small intestinal transit and c-Fos expression in the central and digestive tracts in rats

WANG Yan，SHI Hai-tao，QIN Bin，JIANG Jiong，ZHAO Ju-hui，ZHAO-Hongli
(Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China)

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of ghrelin injected intravenously on small intestinal transit and c-Fos expression in the central nervous system(CNS)and the enteric nervous system(ENS).MethodsRats were supplied with an intraduodenal catheter.After fasted for 24 h，rats

intravenous injection of ghrelin(2，5，10 or 20μg/kg)respectively.The small intestinal transit was measured after instillation of Evans blue through the intraduodenal catheter.Another group of rats were pretreated with ghrelin receptor antagonist(D-Lys3)GHRP-6 10 min before ghrelin administration.The c-Fos activation on the CNS and ENS through intravenous injection of ghrelin was studied by the immunohistochemistry and imaging analysis.Results①Ghrelin 2μg/kg had little influence on small intestinal transit；however，ghrelin 5，10 or 20μg/kg enhanced small intestinal transit dose-dependently.This effect was inhibited by its receptor antagonist.②In the CNS，the c-Fos expression of several nuclei such as the arcuate nucleus and paraventricular nucleus was increased by intravenous injection of ghrelin.And the c-Fos expression in the duodenum，jejunum，and proximate colon was also activated by ghrelin.The receptor antagonist inhibited the effects of ghrelin.ConclusionGhrelin appears to be closely related to small intestinal motility.Its receptor GHS-R regulates its activity.Intravenous administration of ghrelin can regulate the intestinal motility through the ENS and CNS.

ghrelin；small intestinal transit；growth hormone secretagogue receptor(GHS-R)；digestive tracts；motility；

R333.3

A

1671-8259(2014)05-0611-07

10.7652/jdyxb201405009c-Fos

2014-04-21

2014-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81100258) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81100258)

王燕(1978-)，女(漢族)，博士，主治醫(yī)師.研究方向：消化道運(yùn)動(dòng)和胃腸激素.E-mail：miss.wangyan@gmail.com

時(shí)間：2014-07-22 18∶17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1817.019.html