杏仁中央核內(nèi)注射μ阿片受體激動劑DAMGO增加蔗糖溶液攝入引起的Fos表達

孫 波，閆劍群，王 倩，趙小林，李金容，閆 薇，宋 琳

(西安交通大學醫(yī)學院生理學與病理生理學系，陜西西安 710061)

杏仁中央核內(nèi)注射μ阿片受體激動劑DAMGO增加蔗糖溶液攝入引起的Fos表達

孫 波，閆劍群，王 倩，趙小林，李金容，閆 薇，宋 琳

(西安交通大學醫(yī)學院生理學與病理生理學系，陜西西安 710061)

目的探討杏仁中央核內(nèi)μ阿片受體對大鼠蔗糖溶液攝入的影響及調(diào)節(jié)機制。方法杏仁中央核注入μ阿片受體激動劑DAMGO或生理鹽水(Saline)，測量大鼠對蔗糖溶液及蒸餾水的攝入量；利用免疫組化方法觀察注入DAMGO或Saline后，蔗糖溶液攝入引起的Fos免疫陽性神經(jīng)元的分布和數(shù)量。結果與Saline組相比，DAMGO注射增加3 h的蔗糖溶液攝入量，并在伏隔核(核)，弓狀核，外側下丘腦，吻端、中間及尾端孤束核核團增加蔗糖攝入引起的Fos表達。結論杏仁中央核內(nèi)μ阿片受體的激活可能通過作用于伏隔核、弓狀核、外側下丘腦及孤束核參與大鼠蔗糖溶液攝入的調(diào)節(jié)。

杏仁中央核；μ阿片受體；蔗糖溶液攝入；Fos

杏仁中央核(CeA)是邊緣系統(tǒng)中與情感、動機和攝食等有關的結構。Ce A中的谷氨酸能神經(jīng)元參與甜味覺的傳遞［1］，而GABA能神經(jīng)元參與鈉欲調(diào)節(jié)［2］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，阿片肽主要參與獎賞相關行為的調(diào)節(jié)。研究表明，CeA內(nèi)存在大量μ阿片受體(μopioid receptor，MOR)［3］。我們之前的研究顯示，Ce A內(nèi)注入MOR激動劑DAMGO可增加大鼠對蔗糖溶液的攝入［4］，但其具體機制有待進一步研究。BOT［5］研究發(fā)現(xiàn)在豚鼠腦室內(nèi)給予DAMGO可引起許多部位c-Fos表達的增加，包括杏仁核，下丘腦及伏隔核等。據(jù)此假設Ce A內(nèi)注入DAMGO增加大鼠蔗糖溶液的攝入可能通過以下機制實現(xiàn)：DAMGO作用于Ce A中的MOR，通過由Ce A發(fā)出的纖維投射，影響其他與蔗糖溶液攝入相關的腦區(qū)或核團的活動，從而調(diào)節(jié)蔗糖溶液的攝入。LEVINE［6］研究發(fā)現(xiàn)，Ce A內(nèi)注入DAMGO可增加伏隔核殼部的c-Fos表達，而對于其他腦區(qū)或核團的c-Fos表達并沒有影響。本研究將Ce A內(nèi)DAMGO注射與蔗糖溶液攝入相結合，了解Ce A內(nèi)DAMGO注射對于蔗糖溶液攝入引起的相關核團Fos表達的影響，從而進一步研究Ce A內(nèi)DAMGO注射增加蔗糖溶液攝入的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性SD大鼠30只，體質量210～250 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物分籠飼養(yǎng)，動物房溫度維持在20～24℃，光暗周期為12 h∶12 h，無強烈聲光刺激。所有動物適應飼養(yǎng)環(huán)境1周，其間自由進食正常大鼠飼料并自由飲用蒸餾水。30只大鼠隨機分為兩批，一批用于雙瓶選擇實驗(n=15)，另一批用于Fos表達實驗(n=15)。

1.2 單側CeA內(nèi)套管植入手術水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉動物，固定大鼠頭部于腦立體定位儀上，使前囟和后囟處于同一平面。根據(jù)大鼠腦圖譜確定CeA的位置：前囟后2.4 mm，中縫旁開4.1 mm，腦表面下7.0 mm。單側Ce A植入26G不銹鋼套管。術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(20 000 U)防感染。術后大鼠恢復5 d，使體質量升至術前水平。

1.3 雙瓶選擇實驗及套管位置鑒定訓練開始前24 h，將水瓶從籠中移除。第2天早上8∶30，給予大鼠雙瓶供水，兩個刻度飲水瓶(250 m L)放置飼養(yǎng)籠前，間隔5 cm，瓶內(nèi)均為蒸餾水；3 h后，將水瓶移除。大鼠在早上8∶30～11∶30進行雙瓶飲水，其余時間禁水。飲水期間將食物撤除。以上述條件適應性訓練5 d，并進行核團注射訓練，使大鼠適應注射過程。

上述訓練后，進行雙瓶選擇試驗，流程如下：實驗前禁水24 h；實驗當天早上8∶15，給予大鼠單側Ce A注射0.5μL DAMGO(2 nmol，Sigma)或生理鹽水，注射60 s，停留60 s；注射后15 min，將兩個已知質量的水瓶放置飼養(yǎng)籠前，一個為0.3 mol/L的蔗糖溶液，另一個為蒸餾水；3 h后，將水瓶移除并稱重，計算出蔗糖溶液及蒸餾水的攝入量。

每只大鼠均接受兩次注射，一次為DAMGO，一次為生理鹽水；兩次注射的間隔時間為3 d。雙瓶選擇實驗結束后，向CeA中注入0.5μL膀胺天藍，所有動物經(jīng)致死劑量戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(100 mg/kg)，并相繼用100 mL生理鹽水及200 mL的100 mL/L甲醛溶液經(jīng)左心室灌流固定，剝離腦組織，置入100 mL/L甲醛溶液中。腦組織做冠狀冰凍切片(片厚40μm)。在切取的腦片中，選取含有CeA的切片，光鏡下參照大鼠腦圖譜對套管位置進行定位。

1.4 CeA內(nèi)注射DAMGO后蔗糖溶液攝入引起的Fos表達訓練開始前24 h，將水瓶從籠中移除。第2天早上9∶30，將水瓶放回飼養(yǎng)籠前，瓶內(nèi)為蒸餾水；2 h后，將水瓶移除。大鼠在早上9∶30～11∶30飲水，其余時間禁水。飲水期間將食物撤除。以上述條件適應性訓練5 d，并進行核團注射訓練，使大鼠適應注射過程。

上述訓練后，15只大鼠隨機分為生理鹽水組(n =7)和DAMGO組(n=8)，進行如下實驗：實驗前禁水24 h；實驗當天早上9∶15，給予大鼠單側Ce A注射0.5μL DAMGO(2 nmol，Sigma)或生理鹽水，注射60 s，停留60 s；注射后15 min，將水瓶放置飼養(yǎng)籠前，瓶內(nèi)為0.3 mol/L的蔗糖溶液；2 h后，將水瓶移除，向Ce A中注入0.5μL膀胺天藍，將大鼠用致死量的水合氯醛麻醉，開胸，先以0.01 mol/L PBS(p H 7.4)100 m L經(jīng)左心室至主動脈進行快速灌注，然后用含750 g/L飽和苦味酸和40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PB(p H 7.4)250 m L快速灌注固定，再以同樣的灌注液250 m L緩慢滴注，持續(xù)1.5～2 h。灌注完畢后取腦組織，后固定4 h，再移入250 g/L蔗糖溶液中，4℃過夜。腦組織完全沉底后，用冰凍切片機冠狀切取，片厚40μm，用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次10 min，用于Fos免疫組化標記。

1.5 套管位置鑒定及Fos免疫組化檢測切取的腦片中，選取含有CeA的切片，光鏡下參照大鼠腦圖譜對套管位置進行定位，套管位置正確的大鼠繼續(xù)進行Fos免疫組化實驗。

切片先后經(jīng)3 m L/L的雙氧水和3 m L/L Triton X-100孵育后，50 m L/L的山羊血清封閉1 h后，加rabbit anti-c-Fos一抗(Abcam，1∶800稀釋)的抗體稀釋液并應用鏈霉親和素-過氧化物酶試劑盒(Zhongshan Bio-tech Co.)進行二抗及辣根過氧化物酶-卵白素孵育；最后利用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)使免疫反應產(chǎn)物顯色。將染色切片在光學顯微鏡下觀察并照相。此外，另取一套腦片，進行陰性對照(不加一抗)實驗。進行Fos免疫陽性神經(jīng)元計數(shù)時，對于不同的核團，雙側均計數(shù)后取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)處理各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤表示。雙瓶選擇實驗中，每只大鼠均接受兩種不同處理，即DAMGO注射以及生理鹽水注射，屬于同源配對，采用配對t檢驗；Fos表達實驗中，實驗大鼠被隨機分成兩組，即DAMGO組及生理鹽水組，采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05作為有顯著性差異的統(tǒng)計學標準。

2 結 果

2.1 組織學定位參考大鼠腦圖譜(圖1)，雙瓶選擇實驗15只大鼠中有4只Ce A定位不準確，另有1只大鼠在實驗過程中出現(xiàn)套管脫落，所以最終有10只大鼠的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計分析。每只大鼠間隔3 d先后接受DAMGO和生理鹽水，因此，雙瓶選擇實驗DAMGO組及生理鹽水組最后均有10只大鼠的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計分析。Fos表達實驗15只大鼠中有4只Ce A定位不準確，所以最終有11只大鼠的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計分析，其中生理鹽水組5只，DAMGO組6只。

圖1 顯微照片顯示套管位置Fig.1 Photomicrograph showing representative cannula placement

2.2 雙瓶選擇實驗結果與生理鹽水組相比，Ce A內(nèi)注射DAMGO使大鼠在3 h內(nèi)攝入0.3 mol/L蔗糖溶液的量顯著增加(t=-3.886，P=0.004)；兩組對蒸餾水的攝入量差異無統(tǒng)計學意義(t=0.419，P=0.658，圖2)。

圖2 CeA內(nèi)注射DAMGO對0.3 mol/L蔗糖溶液及蒸餾水攝入的影響Fig.2 Effects of intra-CeA injection of DAMGO on the intake of 0.3 mol/L sucrose solution and distilled water in rats

2.3 CeA內(nèi)注射生理鹽水或DAMGO后蔗糖攝入引起的Fos表達情況與生理鹽水組相比，Ce A內(nèi)注射DAMGO后蔗糖攝入引起的Fos表達在以下核團均增加，差異有統(tǒng)計學意義：伏隔核(核)(t= -4.751，P=0.001)，弓狀核(t=-6.425，P= 0.000)，外側下丘腦(t=-6.117，P=0.000)，吻端孤束核(t=-3.128，P=0.012)，中間孤束核(t= -5.010，P=0.001)及尾端孤束核(t=-3.817，P=0.004)(表1、圖3)。

表1 CeA內(nèi)注射生理鹽水或DAMGO后蔗糖攝入引起的不同核團的Fos免疫陽性神經(jīng)元數(shù)Tab.1 The number of sucrose intake induced Fos-immunoreactive neurons under the condition of saline or DAMGO administration in Ce A

圖3 CeA內(nèi)注射生理鹽水或DAMGO后蔗糖攝入引起的不同核團的Fos表達Fig.3 Microphotographs showing sucrose intake induced Fos-immunoreactive expression in different nuclei under the condition of saline or DAMGO administration in Ce A

3 討 論

c-Fos是一種典型的在神經(jīng)元內(nèi)表達的即刻早期基因。細胞外的多種刺激均能誘導其快速、短暫及特異性表達。因此，大量研究以c-Fos作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元激活的解剖標志［7-8］。蔗糖溶液的攝入可引起許多腦區(qū)或核團的c-Fos表達，包括伏隔核、下丘腦、杏仁核、臂旁核及孤束核等［9-10］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，Ce A內(nèi)注入MOR激動劑DAMGO可增加大鼠對蔗糖溶液的攝入，且在CeA內(nèi)，蔗糖溶液攝入相關的神經(jīng)元表達MOR［4］。本研究為進一步明確Ce A內(nèi)DAMGO注射通過激活哪些相關核團來增加蔗糖溶液的攝入；因此將Ce A內(nèi)DAMGO注射與蔗糖溶液攝入相結合，探討Ce A內(nèi)DAMGO注射對于蔗糖溶液攝入引起的Fos表達的影響，結果顯示，Ce A內(nèi)注入DAMGO后蔗糖攝入引起的Fos表達在伏隔核(核)、弓狀核、外側下丘腦、吻端孤束核、中間孤束核及尾端孤束核均增加，表明CeA內(nèi)MOR的激活可能通過作用于這些核團參與大鼠蔗糖溶液攝入的調(diào)節(jié)。

Ce A內(nèi)DAMGO注射增加伏隔核內(nèi)蔗糖攝入引起的Fos表達，可能部分是由于這兩個核團之間的相互神經(jīng)投射引起的［6，11］。此外，這些部位之間的多突觸傳導通路也可能解釋本研究的結果。許多研究表明，杏仁核，下丘腦，臂旁核及孤束核之間存在密切的解剖學投射關系［12-15］，因此，這些結構之間存在直接或間接的纖維聯(lián)系。盡管到目前為止，沒有研究表明Ce A與弓狀核之間存在直接的纖維聯(lián)系，但與Ce A有直接纖維聯(lián)系［16］的臂旁核及尾端孤束核向下丘腦有大量的纖維投射［17］。因此，臂旁核或尾端孤束核可能作為Ce A與弓狀核聯(lián)系的中轉站。同樣，目前為止尚沒有文獻報道Ce A與外側下丘腦之間有直接纖維聯(lián)系，但CeA和外側下丘腦均與臂旁核之間存在纖維投射［18-19］，故可通過臂旁核的中轉，CeA與外側下丘腦之間可能存在間接的纖維聯(lián)系。

尾端孤束核主要接受內(nèi)臟感覺神經(jīng)的投射［20］，與下丘腦、杏仁核及臂旁核之間存在相互的神經(jīng)纖維投射。因此，尾端孤束核與CeA之間存在直接的纖維聯(lián)系。中間孤束核內(nèi)有瘦素受體的分布，且該受體可被外周給予的瘦素激活；外周給予瘦素可以改變大鼠對蔗糖溶液的攝入［21-22］。因此，中間孤束核可能參與蔗糖溶液攝入的調(diào)節(jié)。吻端孤束核是味覺信息傳遞的第一級中樞［23］，與外側下丘腦及CeA均有直接的纖維聯(lián)系；此外，吻端孤束核及Ce A也可能通過臂旁核存在間接的纖維聯(lián)系。

LEVINE［6］研究發(fā)現(xiàn)，Ce A內(nèi)注入DAMGO僅可增加伏隔核殼部的c-Fos表達，而對于其他腦區(qū)或核團的c-Fos表達并沒有影響。本研究先在Ce A內(nèi)注入DAMGO，再觀察在此狀態(tài)下，蔗糖攝入在腦組織各核團引起的Fos表達情況。在所觀察的核團中，很多核團的Fos表達并沒有增加，但不能說明這些核團的神經(jīng)元活動沒有發(fā)生變化。Fos可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元激活的解剖標志；但如果某個核團的神經(jīng)元被抑制，F(xiàn)os則無法將其反映出來。

綜上所述，本實驗結果表明，Ce A內(nèi)MOR的激活可能通過作用于伏隔核、弓狀核、外側下丘腦及孤束核參與大鼠蔗糖溶液攝入的調(diào)節(jié)，但對于通過何種纖維投射或何種神經(jīng)遞質發(fā)揮作用等具體機制仍需進一步研究。

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(編輯 國 榮)

Injection ofμopioid receptor agonist DAMGO into the central nucleus of amygdala increases sucrose solution intake induced Fos expression in rats

SUN Bo，YAN Jian-qun，WANG Qian，ZHAO Xiao-lin，LI Jin-rong，YAN Wei，SONG Lin
(Department of Physiology and Pathophysiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo determine the effects ofμopioid receptor(MOR)in the central nucleus of amygdala(Ce A)on sucrose solution intake in rats and related mechanisms.MethodsSprague-Dawley rats

intra-CeA injection of MOR agonist DAMGO or saline，and then underwent two-bottle choice test between sucrose solution and distilled water.After intra-Ce A injection of DAMGO or saline，F(xiàn)os expression induced by sucrose solution intake was labeled and identified in different brain nuclei with immunohistochemistry.ResultsCompared with saline injection，intra-CeA injection of DAMGO significantly increased sucrose solution intake in rats over a 3-h period and increased Fos expression induced by sucrose solution intake in nucleus accumbens(core)，arcuate nucleus，lateral hypothalamus，rostral nucleus tractus solitarius，medial nucleus tractus solitarius and caudal nucleus tractus solitarius.ConclusionActivation of MOR in Ce A may stimulate NAcc，ARC，LH and NST to modulate sucrose solution intake in rats.

central nucleus of amygdala；μopioid receptor；sucrose solution intake；Fos

R338

A

1671-8259(2014)05-0581-05

10.7652/jdyxb201405003

2013-12-10

2014-03-05

國家自然科學基金資助項目(No.31300966；31371107)；中國博士后科學基金(No.2013M540761) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.31300966；31371107)and the National Science Foundation for Post-doctoral Scientists of China(No.2013M540761)

閆劍群，教授.E-mail：jqyan810@gmail.com

孫波(1985-)，女(漢族)，博士，講師.E-mail：sunbo1217@mail.xjtu.edu.cn

時間：2014-07-22 16∶11 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1611.001.html