中晚期鼻咽癌患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞和Th17細胞的免疫病理意義

江志超，唐發(fā)清，田道法，范靖瑩

（1.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南長沙410007；2.珠海市人民醫(yī)院，

廣東珠海519000；3.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，湖南長沙410007）

中晚期鼻咽癌患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞和Th17細胞的免疫病理意義

江志超1，唐發(fā)清2，田道法3，范靖瑩3

（1.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南長沙410007；2.珠海市人民醫(yī)院，

廣東珠海519000；3.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，湖南長沙410007）

目的探討中晚期鼻咽癌患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞和Th17細胞的免疫病理意義。方法采用流式細胞術、RT-PCR方法檢測15例中晚期鼻咽癌患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞、Th17細胞比例和Foxp3、ROR-γt轉(zhuǎn)錄活性，并與10例健康體檢者相應指標進行比較，分析其免疫病理意義。結(jié)果中晚期鼻咽癌患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞比例及Foxp3轉(zhuǎn)錄活性明顯高于健康體檢者（P＜0.05）；而Th17細胞比例及ROR-γt轉(zhuǎn)錄活性低于健康體檢者（P＜0.05）。結(jié)論CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和Th17細胞比例、轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt共同構(gòu)成一個平衡反饋體系，參與中晚期鼻咽癌患者腫瘤微環(huán)境中免疫耐受現(xiàn)象的發(fā)展及免疫逃逸的發(fā)生過程。

CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞；Foxp3；Th17細胞；ROR-γt；鼻咽癌

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫細胞是否處于平衡狀態(tài)密切相關，而作為細胞免疫的主體細胞T淋巴細胞及其亞群在腫瘤免疫中分化和作用不斷地被認識。CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞和Th17細胞是CD4+T細胞在不同的細胞因子刺激下所產(chǎn)生的亞群，CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞作為對正向免疫應答起負向調(diào)控作用的T淋巴細胞亞群，在肝癌、肺癌、胃癌等多種實體瘤中數(shù)量增多，且與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［1］；而Th17細胞在腫瘤中的作用仍存在較大爭議，可能同時具有促進腫瘤和抑制腫瘤的雙重作用［2］。作者擬通過檢測中晚期鼻咽癌患者外周血 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞、Th17細胞數(shù)量及其與相關轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、ROR-γt水平，探討CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞和Th17細胞在中晚期鼻咽癌患者免疫耐受病理中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集湖南省第二人民醫(yī)院、湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院、湖南省腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診的中晚期鼻咽癌患者15例，年齡21～65歲，其中男11例，女4例；鱗癌9例，腺癌4例，未分化癌2例。所有患者均未接受過放、化療等干預因素處理。并設立同期健康體檢者對照組10例，年齡20～60歲?；颊呒敖】刁w檢者均簽署了知情同意書。

1.2 試劑及儀器Human Regulatory TC ell Staining Kit、Human Th17 Flow TM Kit購于美國eBioscience公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司，PCR引物由上海生工合成。Cytomics TM FC500型流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀為美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 標本采集與處理符合納入標準的15例中晚期鼻咽癌患者與10名健康體檢者，分別于清晨空腹采集肝素鈉抗凝的外周靜脈血4 mL，用淋巴細胞分離液梯度離心法分離外周血單個核細胞，-70℃保存?zhèn)溆?，用于流式細胞術分析和RT-PCR檢測。

1.4 流式細胞儀檢測外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞。按Human Regulatory T Cell Staining Kit說明書進行操作，應用CD4、CD25、Foxp3抗體做細胞表面三色染色，采用FC500型流式細胞儀進行檢測。測定10 000個細胞，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為535 nm。分析時設門以除去細胞碎片和細胞團塊，排除對測定過程的干擾。以同型抗體染色作為陰性對照。

1.5 流式細胞儀檢測外周血Th17細胞將外周血單個核細胞在體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中調(diào)整細胞密度至2×106細胞/mL，加入50 μg·L-1佛波醇乙酯、離子霉素和莫能霉素共刺激培養(yǎng)5 h（37℃，體積分數(shù)5%CO2）；用三色標記的CD3、CD4、IL-17抗體對IL-17分子進行細胞因子胞內(nèi)染色標記，按Human Th17 Flow TM Kit說明書進行操作。采用FC500型流式細胞儀進行檢測，測定10 000個細胞，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為535 nm，分析時設門以除去細胞碎片和細胞團塊對測定的干擾。以同型抗體染色作為陰性對照。

1.6 RT-PCR檢測Foxp3 mRNA和ROR-γt mRNA參照有關文獻，運用Primer5.0軟件設計引物序列，由上海生物工程技術有限公司合成ROR-γt引物。其中 Foxp3引物 Forward Primer為 5'-CACAACATGCGACCCCCTTTCACC-3'，Reverse Primer為5'-AGGTTGTGGCGGATGGCGTTCTTC-3'；ROR-γt引物Forward Primer為 5'-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3'，Reverse Primer為5'-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3'；β-actin引物 Forward Primer為 5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'，Reverse Primer為5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。Trizol法提取外周血單個核細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的濃度、純度，顯示提取的各樣本總RNA具有很好的濃度和純度后，繼續(xù)后續(xù)的RT-PCR實驗。用熒光定量PCR儀進行ROR-γt mRNA擴增，采用2-△△ct法計算Foxp3 mRNA相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，計量資料用s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，2組比較采用成組設計t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞和Th17細胞比例比較見表1，圖1、2。

表1 CD4+CD25+T細胞、Th17細胞占CD4+T細胞比例比較%

2.2 Foxp3和ROR-γt mRNA水平比較中晚期鼻咽癌患者外周血 Foxp3 mRNA表達水平（3.699± 0.309）明顯高于健康體檢者（1.019±0.146），而ROR-γt mRNA表達水平（0.303±0.115）明顯低于健康體檢者（1.007±0.039），差異有均統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見圖3。

圖1 健康體檢者（A）和中晚期鼻咽癌患者（B）外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞流式細胞圖

圖2 健康體檢者（A）和中晚期鼻咽癌患者（B）外周血Th17細胞流式細胞圖

圖3 Foxp3、ROR-γt基因表達水平比較結(jié)果

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及免疫監(jiān)視、免疫耐受、免疫逃逸、免疫無能等與機體免疫紊亂有關的問題。免疫耐受現(xiàn)象的持續(xù)存在，可引起突變細胞對宿主體內(nèi)免疫監(jiān)視功能的無反應性，出現(xiàn)腫瘤細胞的免疫逃逸，其中起主導作用的細胞主要是CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞［3-4］。諸多研究［5-6］表明，CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞在肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤患者外周血和病變組織中均有不同程度的升高，且與腫瘤的預后關系密切。本研究結(jié)果顯示，中晚期鼻咽癌患者外周血單個核細胞中，CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞占CD4+T淋巴細胞的比例明顯高于健康體檢者，提示中晚期鼻咽癌患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞水平的升高，應該是該類患者病情進展的重要相關因素之一。同時，中晚期鼻咽癌患者外周血單個核細胞中Foxp3 mRNA表達水平也明顯高于健康體檢者，與CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞數(shù)量比例變化趨勢相一致，進一步顯示了Foxp3 mRNA對CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞分化與增殖活性的影響及其在腫瘤免疫耐受現(xiàn)象中重要作用。T淋巴細胞在不同的細胞因子的影響下，可以分化為不同的CD4+T淋巴細胞亞型，在TGF-β的影響下，可以分化為CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞，而在同時有IL-6存在的情況下，則分化為Th17細胞。也就是說CD4+CD25+T細胞與Thl7細胞的誘導分化過程存在微妙的相互關系，影響著機體的免疫穩(wěn)態(tài)，涉及腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生［7］。

有關Th17細胞在腫瘤中的作用存在2種不同觀點［8-10］：有研究認為Th17細胞能夠促進腫瘤生長，也有研究認為這類細胞能夠抑制腫瘤，甚至還有學者提出Th17細胞只是起著一個“旁觀者”的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，中晚期鼻咽癌患者外周血中，Th17細胞占CD4+T淋巴細胞的比例明顯低于健康體檢者，且ROR-γt mRNA表達水平也明顯低于健康體檢者。提示在中晚期鼻咽癌患者，Th17細胞及其轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt應該具有積極的抗腫瘤作用。Horlock等［11］也發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者相比，乳腺癌患者外周血Th17細胞水平明顯偏低，這同我們的觀察結(jié)果是相一致的。

基于上述研究發(fā)現(xiàn)，中晚期鼻咽癌患者在CD4+CD25+T淋巴細胞數(shù)量及其轉(zhuǎn)錄水平升高的同時，伴隨Th17細胞數(shù)量比例及其轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，表明這類患者體內(nèi)存在CD4+CD25+T淋巴細胞與Th17細胞失平衡現(xiàn)象，有可能是促進中晚期鼻咽癌免疫耐受存在的重要原因之一。且這種不平衡可能還與病情進展過程有關，到了腫瘤的中晚期，Th17細胞減低趨勢日益明顯，而CD4+CD25+T淋巴細胞數(shù)量則更趨增多，免疫耐受現(xiàn)象更為突出。

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Immunopathological Significance of CD4+CD25+Regulatory T Cells and Th17 Cells in Patients with Intermiddle and Advanced Stage Nasopharyngeal Carcinoma

Jiang Zhichao1，Tang Faqing2，Tian Daofa3，F(xiàn)an Jingying3
（1.The Second People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410007，China；
2.The People's Hospital of Zhuhai City，Zhuhai 519000，China；3.College of Integrated
Traditional Chinese and Western Medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China）

ObjectiveTo investigate the immunopathological significance of CD4+CD25+regulatory T cells and Th17 cells in peripheral blood of the patients with intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma.Methods In this study，15 cases of intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma of the observation group and 10 healthy persons of the control group were included to detect their ratio of CD4+CD25+T cells and Th17 cells in the peripheral blood by flow cytometry technique，transcriptional activity of Foxp3 and ROR-γt by RT-PCR procedure.Then，a comparative analysis was made to explore their implications in the immunopathological correlation of nasopharyngeal carcinoma.ResultsThe ratio of CD4+CD25+T cells to total CD4+T cells and transcriptional activity of Foxp3 in the peripheral blood among the patients with intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma were significantly higher than those in the healthy persons（P＜0.05）.Meanwhile，the ratio of Th17 cells to total CD4+T cells and transcriptional activity of ROR-γt in the peripheral blood among the patients with intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma was significantly lower than those in the healthy persons（P＜0.05）.ConclusionIt may be true that CD4+CD25+T cells，transcriptiona regulatory factor Foxp3，and Th17 cells as well as ROR-γt altogether compose of a regulating system in a balance feedback way to evolve the developing process ofimmune tolerance phenomena in the microtumor enviroment and the implication of immune escape among patients with intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma.

CD4+CD25+regulatory T cells；Foxp3；Th17 cells，ROR-γt；nasopharyngeal carcinoma

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.02.004

R739.63；R730.23

A

1673-5412（2014）02-0105-04

2013-07-01）

國家自然科學基金資助項目（編號：30973856）；湖南省中醫(yī)藥管理局科研重點項目（編號：2010007）

江志超（1977-），男，博士，主治醫(yī)師，主要從事頭頸腫瘤防治研究。E-mail：jiang.zhichao@126.com

田道法（1951-），男，教授，主要從事頭頸腫瘤防治研究。E-mail：tiandaofa@163.com