紫外線抵抗相關(guān)基因在二烯丙基二硫誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞自噬中的作用

王 萍，殷小成，彭艷輝，胡賢嬌，楊云華

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，湖南衡陽421001）

紫外線抵抗相關(guān)基因在二烯丙基二硫誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞自噬中的作用

王 萍，殷小成，彭艷輝，胡賢嬌，楊云華

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，湖南衡陽421001）

目的觀察紫外線抵抗相關(guān)基因（UVRAG）在二烯丙基二硫（DADS）誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞自噬中的作用。方法以K562細(xì)胞為細(xì)胞模型，利用透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)自噬體的形成；采用吖啶橙染色和熒光顯微鏡觀察酸性囊泡的形成以檢測DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞自噬；RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因UVRAG mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果透射電鏡顯示：與空白組和溶媒組比較，DADS（40 mg·L-1）處理組可觀察到胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量自噬體。吖啶橙染色熒光顯微鏡下可見到各DADS處理組K562細(xì)胞胞漿中的酸性囊泡較空白組和溶媒組明顯增多。RT-PCR結(jié)果顯示，DADS作用K562細(xì)胞12h后，各DADS處理組UVRAG mRNA表達(dá)水平均高于空白組和溶媒組。結(jié)論DADS能誘導(dǎo)K562細(xì)胞自噬，其機(jī)制可能與上調(diào)UVRAG mRNA表達(dá)有關(guān)。

二烯丙基二硫；白血?。籏562細(xì)胞；自噬；紫外線抵抗相關(guān)基因

自噬性細(xì)胞死亡又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個熱點［1］。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步和對自噬的深入探索，自噬在白血病中扮演的角色日益清晰，將為白血病治療提供一個新的靶點。二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是大蒜中提取出的一種有機(jī)硫化物，是脂溶性物質(zhì)，對乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和白血病等的細(xì)胞均有抑制作用［2］。本課題組前期研究［3］發(fā)現(xiàn)DADS可以誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈時間和劑量依賴性。然而關(guān)于DADS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的研究鮮有報道。本實驗從自噬角度探討DADS能否誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡及其相關(guān)的分子機(jī)制，為DADS進(jìn)一步研究及應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑DADS購自美國Fluka公司，按說明書用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解配制，配置比例為1∶2，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋，稀釋的倍數(shù)為100倍，DMSO終濃度＜0.01%；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；Trizol購自美國GIBCOBRL公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司，PCR試劑盒購自廣州東盛生物工程公司，PCR引物由美國Invitrogen公司合成；吖啶橙染色劑購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 K562細(xì)胞株購自北京協(xié)和細(xì)胞中心，細(xì)胞生長于含體積分?jǐn)?shù)12%滅活新生胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d換液1次。實驗分為3個大組：空白組、溶媒組及DADS處理組?？瞻捉M不加DMSO，溶媒組加有同最高DADS濃度處理組等量體積的DMSO，DADS組分為10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1DADS 4個亞組，每個亞組重復(fù)實驗3次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 透射電鏡檢測細(xì)胞自噬現(xiàn)象 收集空白組、溶媒組、DADS（40 mg·L-1）處理組作用12 h后的細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，800 r·min-1離心5 min，沿管壁逐滴加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定過夜，經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋，制成半薄片進(jìn)行定位，制成超薄片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色后，定位觀察并拍照。觀察到自噬小體為陽性，未觀察到自噬小體為陰性。

1.2.3 吖啶橙單染熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬 取對數(shù)生長期K562細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)12%滅活新生胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基制成3.0×106mL-1的單細(xì)胞懸液，接種于無菌6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL。收集分別培養(yǎng)12 h后的空白組、溶媒組和各DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）處理組細(xì)胞，離心去液體，每管加入0.1 mg·L-1吖啶橙1 mL重懸，避光，放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中15 min，然后800 r·min-1離心5 min，去上清液，PBS洗滌2次，留取20 μL細(xì)胞懸液滴于載玻片上蓋片封片后在熒光顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)。如吖啶橙的綠色熒光轉(zhuǎn)變成紅色熒光說明細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡增多［4］。

1.2.4 RT-PCR檢測UVRAG mRNA的表達(dá) 3 7℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞，PBS洗2次。依據(jù)TRIZOL試劑盒說明書提取總RNA，波長260/280 nm處測定其濃度和純度；按照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA待用。紫外線抵抗相關(guān)基因（ultraviolet radiation resistance-associated gene，UVRAG的上游引物為5'-ATCTGTGTCTTGTTTCGTGGTG-3'，下游引物為5'-ATGAAGCCGTAGCAAAGAGAAG-3'，產(chǎn)物長度為277b p；內(nèi)參GAPDH的上游引物為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn)物長度為452 bp。擴(kuò)增條件均為：94℃預(yù)變性2 min，變性溫度94℃、45 s，退火溫度53℃、50 s，延伸溫度72℃、50 s，72℃、5 min，共35個循環(huán)，最后4℃保存。PCR產(chǎn)物各20 μL，在12 g·L-1瓊脂糖凝膠中電泳分離，并在紫外燈下顯影拍照。結(jié)果用AlphaImager 2200分析圖像分析軟件對PCR凝膠電泳圖像進(jìn)行灰度掃描，以目的基因與內(nèi)參基因比值表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料s表示，2組之間比較用t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡檢測細(xì)胞自噬現(xiàn)象DADS（40 mg·L-1）作用于K562細(xì)胞12 h后，電鏡下可觀察到細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有較多具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，呈圓形或新月形；內(nèi)含未消化的胞漿成分或細(xì)胞器；空白組、溶媒組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)則，細(xì)胞核染色質(zhì)均一，線粒體內(nèi)嵴規(guī)則。提示DADS可誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生自噬。見圖1。

2.2 吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬現(xiàn)象自噬溶酶體的形成是自噬發(fā)生的重要標(biāo)志之一，自噬溶酶體在細(xì)胞內(nèi)是以酸性囊泡細(xì)胞器形式存在的。吖啶橙染色后發(fā)現(xiàn)，與空白組、溶媒組比較，不同濃度DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）處理K562細(xì)胞12 h后，細(xì)胞胞漿中可呈現(xiàn)較多紅色斑點狀的酸性囊泡（即為自噬小體）。進(jìn)一步證實DADS可誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生自噬。見圖2。

圖1 K562細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖2 不同濃度DADS處理12 h后K562細(xì)胞中酸性囊泡的分布情況

2.3 RT-PCR檢測UVRAG mRNA的表達(dá)情況不同濃度 DADS作用 K562細(xì)胞12 h后，空白組的UVRAG mRNA相對表達(dá)量為0.554±0.018，與溶媒組的0.572±0.018差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；UVRAG mRNA相對表達(dá)量隨著DADS濃度增大明顯增多，電泳條帶變亮，10 mg·L-1組UVRAG mRNA相對表達(dá)量為0.621±0.025，20 mg·L-1組為0.671± 0.019，40 mg·L-1組為0.812±0.009，80 mg·L-1組為0.738±0.044，均高于空白組和溶媒組（P＜0.05），且不同濃度處理組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 RT-PCR法檢測UVRAG mRNA表達(dá)情況

3 討論

自噬性細(xì)胞死亡作為非細(xì)胞凋亡死亡的一種主要方式在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。自噬是指一些需降解的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等胞漿成分被包裹，并最終運(yùn)送至溶酶體形成自噬溶酶體降解的過程，生命體借此維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［5］。目前，自噬已經(jīng)成為繼凋亡之后生物醫(yī)學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一，自噬與腫瘤之間的關(guān)系成為了研究熱點［6］。在對乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌使用抗腫瘤藥物的研究中都出現(xiàn)了自噬性細(xì)胞死亡［7］。

自噬體和自噬溶酶體的形成是自噬性細(xì)胞死亡的重要形態(tài)學(xué)標(biāo)志。透射電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)檢測被認(rèn)為是檢測自噬體的金標(biāo)準(zhǔn)，也是首先發(fā)現(xiàn)并報道自噬的方法［8］。本實驗采用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)DADS（40 mg·L-1）處理組較空白組和溶媒組形成了大量自噬體，從而從形態(tài)學(xué)證實了DADS可誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生自噬。吖啶橙是一種熒光色素，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中呈綠色熒光，而在自噬酸性囊泡中呈紅色熒光。故本研究利用吖啶橙染色，通過熒光顯微鏡觀察不同濃度 DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）作用K562細(xì)胞12 h后自噬的發(fā)生、發(fā)展變化，結(jié)果顯示不同濃度DADS處理組較空白組、溶媒組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的酸性囊泡明顯增加。進(jìn)一步證實DADS可誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生自噬。

UVRAG基因是Vps38的哺乳動物同源基因，作為腫瘤抑制基因被人所熟知，廣泛參與乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［9］。同時，UVRAG在細(xì)胞的自噬中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。UVRAG可與Beclin 1相結(jié)合形成多蛋白復(fù)合物UVRAG-Beclin1-Ptdins3KC3參與自噬小體的形成［10］。為進(jìn)一步探討DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞自噬發(fā)生的分子機(jī)制，本研究采用RT-PCR技術(shù)在基因轉(zhuǎn)錄水平檢測了UVRAG mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示：不同濃度DADS處理K562細(xì)胞12 h后UVRAG mRNA的相對表達(dá)量均高于空白組和溶媒組，提示DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞自噬的作用機(jī)制可能與UVRAG mRNA上調(diào)有關(guān)。

綜上所述，DADS可誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生自噬，其機(jī)制可能與UVRAG mRNA上調(diào)有關(guān)。越來越多的研究［11］表明自噬與凋亡存在著內(nèi)在的聯(lián)系，然而，在白血病的相關(guān)研究中，自噬和凋亡的關(guān)系卻很少涉及。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)DADS對K562細(xì)胞有促凋亡作用，且呈時間和劑量依賴性發(fā)生凋亡，且最高凋亡率是在40 mg·L-1DADS處理K562細(xì)胞后出現(xiàn)，結(jié)合本實驗結(jié)果，40 mg·L-1DADS處理K562細(xì)胞后自噬發(fā)生最明顯，我們有理由相信DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡與自噬之間存在一定的關(guān)系，自噬的發(fā)生在對DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡時起著什么作用有待進(jìn)一步研究。

［1］ Lieberman AP，Puertollano R，Raben N，et al.Autophagy in lysosomal storage disorders［J］.Autophagy，2012，8（5）：719-730.

［2］ Wu PP，Chung HW，Liu KC，et al.Diallyl sulfide induces cell cycle arrest and apoptosis in HeLa human cervical cancer cells through the p53，caspase-and mitochondria-dependent pathways［J］.Int J Oncol，2011，38（6）：1605-1613.

［3］ 肖正香，殷小成，譚艷芳，等.二烯丙基二硫誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞凋亡及其對Fas、FasL及caspase-8表達(dá)的影響［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2011，13（1）：53-56.

［4］ Xie SQ，Zhang YH，Li Q，et al.3-Nitro-naphthalimide and nitrogen mustard conjugate NNM-25 induces hepatocellular carcinoma apoptosis via PARP-1/p53 pathway［J］.Apoptosis，2012，17（7）：725 -734.

［5］ Glick D，Barth S，Macleod KF.Autophagy：cellular and molecular mechanisms［J］.J Pathol，2010，221（1）：3-12.

［6］ Townsend KN，Hughson LR，Schlie K，etal：Autophagy inhibition in cancer therapy：metabolicc onsiderations for antitumor immunity［J］.Immunol Rev，2012，249（1）：176-194.

［7］ Scarlatti F，Bauvy C，Ventruti A，et al.Ceramide-mediated macroautophagy involves inhibition of protein kinase B and up-regulation of beclin 1［J］.J Biol Chem，2004，279（18）：18384-18391.

［8］ Mizushima N.Methodsfor monitoring autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36（12）：2491-2502.

［9］ Wu T，Li Y，Gong L，et al.Multi-step process of human breast carcinogenesis：a role for BRCA1，BECN1，CCND1，PTEN and UVRAG［J］.Mol Med Rep，2012，5（2）：305-312.

［10］Yin X，Cao L，Peng Y，et al.A critical role for UVRAG in apoptosis［J］.Autophagy，2011，7（10）：1242-1244.

［11］Scarlatti F，Granata R，Meijer AJ，et al.Does autophagy have a license to kill mammalian cells？［J］.Cell Death Differ，2009，16（1）：12-20.

Value of Ultraviolet Radiation Resistance-associated Gene in the Diallyl Disulfide Induced Autophagy of Leukaemia K562 Cells

Wang Ping，Yin Xiaocheng，Peng Yanhui，Hu Xianjiao，Yang Yunhua
（Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，China）

ObjectiveTo observe the value of ultraviolet radiation resistance-associated gene（UVRAG）in the diallyl disulfide（DADS）induced autophagy of K562 cells.MethodsK562 cells were chosen for this study.Their ultrastructure was observed by transmission election microscopy.The formation of autophagic vacuoles were observed by fluorescence microscope after acridine orange staining.RT-PCR was used to detect the expression levels of UVRAG mRNA.ResultsCompared with the blank group and the menstruum group，large amount of autophagosomes were observed in the cytoplasm of K562 cells treated with DADS（40 mg·L-1）；amount of autophagic vacuoles observed in all the DADS treatment groups were observed；the UVRAG mRNA expression levels were higher in all the DADS treatment groups after DADS treatment for 12 h（P＜0.05）.ConclusionDADS can induce autophagy of K562 cells，it may be related to the up-regulation of UVRAG mRNA expression.

diallyl disulfide；leukaemia；K562 cells；autophagy；ultraviolet radiation resistance-associated gene

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.02.001

R733.7；R730.23

A

1673-5412（2014）02-0093-04

2014-01-02）

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：31271482）

王萍（1988-），女，碩士在讀，住院醫(yī)師，主要從事小兒白血病基礎(chǔ)研究。E-mail：wangping7048@sina.com

殷小成（1969-），男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事小兒白血病基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：xcyin108@sina.com