MSPD-GPC凈化GC-ECD法測定辣椒醬中8種有機氯農藥殘留分析

張 權，陳文生*，洪 亮，金春潔，褚洪潮

（貴州師范大學 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州師范大學分析測試中心，貴州 貴陽 550001）

有機氯農藥作為一種持久性有機污染物（persistent organic pollutants，POPs），因具有高持久性、高生物累積性和生物毒性等特點越來越受到人們的關注[1-3]。而在檢測不同介質中低殘留量的POPs時，樣品的凈化過程就顯得尤為重要，只有對樣本進行有效地凈化，以去除基質干擾物，才能提高分析的靈敏度 以及定性、定量的準確性。目前，分析基質中有機氯農藥時常用的凈化方法有：填充柱法、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法[4-5]、磺化法[6]、凝膠色譜（gel permeation chromatography，GPC）法[7-8]、基質固相分散（mixture solid phase disperse，MSPD）法[9-10]等。而根據(jù)樣本基質的復雜程度與待測物的特性而選擇合理的凈化方法是測定POPs的關鍵。

辣椒醬是一種使用比較廣泛的調味品，其原料（如辣椒、花生和五香料等）中可能帶入有機氯農藥。同時，辣椒醬中還存在多種動植物油脂和色素，基質復雜，要檢測其中的農藥殘留必須采用有效的提取、分離和凈化方式[11-12]。然而在對復雜基質的凈化方法中，將MSPD法與GPC聯(lián)合應用于辣椒醬樣品中POPs的分析的文獻少見報道，而且對兩種凈化條件的優(yōu)化研究更少有報道。因此，本研究對樣品基質首先經MSPD除去大部分油脂和色素等大分子干擾基質后，再通過GPC進一步凈化，可以滿足辣椒醬及其制品中8 種有機氯農藥殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗中不同品牌的辣椒醬樣品均來自于貴陽超市所售。

乙腈、正己烷、丙酮（均為色譜純） 天津科密歐有限公司；石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、二氯甲烷（均為分析純）、無水硫酸鈉（分析純，600%條件下灼燒4 h，貯于密封干燥器中備用） 國藥集團化學試劑有限公司；柱層析硅膠；Pesti Card石墨化碳黑填料（120～400 目）、C18填料（40～60 目） 美國Sepax-UCT公司；8 種有機氯農藥標準品、六六六（benzenehexachloride，BHC，包括α-BHC、β-BHC、γ-BHC和δ-BHC 4 種異構體）、滴滴涕（dichlorodiphenyl dichloro-ethylene，DDT，包括p,p’-DDE、p,p’-DDD、p,p’-DDT和o,p’-DDT 4 種同系物） 農業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所（純度≥99.0%）。

1.2 儀器與設備

6890N氣相色譜儀（配ECD檢測器） 美國Agilent公司；凝膠滲透色譜儀 德國LC-Tech公司；OSB-2000旋轉儀蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；DB-1701毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.32 μm） 貴州萊德色譜技術開發(fā)有限公司；AB系列電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；80-2型離心機 上海醫(yī)療器械集團；高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

精密稱取8 種有機氯農藥標準品置于棕色容量瓶中，用高效液相色譜純正己烷定容至100.0 mL，將配制的質量濃度為1.0 g/mL溶液作為標準儲備液于－4 ℃冰箱保存。檢測前加入正己烷溶液梯度配制成質量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 g/mL的混合標準系列。

1.3.2 樣品制備

取適量辣椒醬樣品，經粉碎、混勻后準確稱取樣品2.0 g（精確到0.000 1 g）放入瑪瑙研缽中，加入2.5 g的C18填料（40～60 目）、0.5 g硫酸鎂及1.0 g氯化鈉混合后研磨3 min，加入適量的經乙腈飽和的正己烷溶液攪拌至流體糊狀，轉移至錐形瓶中超聲10 min，然后倒入裝有1.0 g石墨化碳黑粉末（120～400 目）和1.0 g無水硫酸鈉的填充柱中，壓實。用25.0 mL的經乙腈飽和正己烷-乙酸乙酯（7∶3，V/V）分3 次洗滌研缽、缽錘及錐形瓶，洗滌液再淋洗層析柱，收集洗脫液于梨形瓶中于40 ℃水浴旋蒸至近干，加入10 mL正己烷-乙酸乙酯（7∶3，V/V）轉移至凝膠色譜柱上待凈化，將12～25 min洗脫液作為分析樣品凈化最佳時間段，設置流出洗脫液濃縮為1 mL，通過0.22 μm的有機系濾膜后采用GC-電子捕獲檢測器（electron capture detection，ECD）法分析。

1.3.3 色譜條件

凝膠滲透色譜條件：凝膠色譜柱（400 mm×25 mm）；Bio-Beads S-X3作為柱填料；流動相為正己烷-乙酸乙酯（7∶3，V/V）；流速：5 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：5.0 mL。

氣相色譜條件：D B-1 7 0 1毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.32 μm）；載氣及流速：氮氣（＞99.999%），1.0 mL/min；不分流進樣；進樣量：1.0 μL；進樣口溫度：260 ℃；檢測器溫度：280 ℃；色譜柱升溫程序：初始溫度220 ℃，以8 ℃/min升至270 ℃，保持7 min至樣品全部流出。

2 結果與分析

2.1 稱樣量的選擇

分別稱取1.00、2.00、5.00 g辣椒醬樣品做空白實驗。當稱樣量為5.00 g時，由于辣椒醬基質復雜造成色譜圖的雜質峰產生干擾；稱取1.00 g時，由于稀釋倍數(shù)過大，會影響實驗中的定量限。綜合考慮其凈化效果、雜質干擾情況以及滿足定量限要求等因素，故實驗選擇稱取2.00 g辣椒醬樣品。

2.2 提取劑的選擇

由于辣椒醬中存在的大量的色素、油脂是造成基質干擾的主要原因，應避免在提取過程中與農藥共提取。通過研究表明，用乙腈飽和的正己烷溶液作為提取劑時，對辣椒醬基質中色素、油脂的溶解能力較弱，對有機氯農藥的溶解度較高，還可使正己烷極性增強，提取效果較好，從加入辣椒醬中的8 種農藥標準品的平均回收率結果來看可以滿足分析要求，所以實驗中以乙腈飽和的正己烷溶液作為提取劑。

2.3 超聲提取時間的選擇

實驗以乙腈飽和過的正己烷作為提取液，比較渦旋振蕩和超聲提取兩種方式對提取效果的影響，結果表明，兩者無顯著差異。另外，實驗中改變超聲時間，分別為0、5、10、15、20 min時研究超聲時間對提取效率的影響。結果表明：在保證提取效率的情況下，選擇超聲時間為10 min比較適宜。

2.4 凈化方式的選擇

2.4.1 MSPD凈化

在檢測有機氯農藥殘留時，通常采用MSPD凈化或SPE凈化提取液，如石墨化碳柱、弗羅里硅土柱和中性氧化鋁柱[13-16]。本研究利用MSPD法對樣品進行第一步凈化，分別比較MSPD法與直接過石墨化碳柱、弗羅里硅土柱和中性氧化鋁柱及使用不同淋洗劑后的凈化效果，最終對辣椒中加入8 種農藥后的平均回收率如圖1所示。

實驗中利用C18填料去除辣椒醬樣品中的油脂和其他非極性干擾物，用石墨化碳黑粉末對辣椒醬樣品中的色素進行凈化，通過大量優(yōu)化實驗，確定了兩種物質最佳的填料量，既避免用量過多造成浪費又避免用量過少導致凈化效果不明顯的兩種現(xiàn)象，經基質固相分散萃取的樣品油脂含量明顯減少，提取液相對干凈，但仍有少量的油滴殘留在梨形瓶中，而且對滴滴滴、滴滴涕兩種農藥造成一定干擾，故需GPC進一步凈化。

2.4.2 GPC凈化

凝膠滲透色譜法能有效去除樣品中的脂類、色素等大分子干擾物，常用于復雜基質食品中農藥提取液的凈化[17-19]。因此，本研究在1.3.3節(jié)色譜條件下采用GPC進行樣品第二步凈化，考察加入8 種農藥混合標準溶液后的凈化效果，所得淋洗曲線如圖2所示。

圖 2 凝膠滲透色譜（GPC）淋洗曲線Fig.2 Elution curve of gel pemeation chromatography (GPC)

提取液經GPC凈化后收集12～25 min的流出液即可進行8 種農藥殘留分析。實驗中發(fā)現(xiàn)，Bio-Beads S-X3作為柱填料，與8 種有機氯類農藥分離效果較好，MSPDGPC凈化使之最大限度地降低了樣品復雜基質帶來的背景干擾，從回收率來看可以滿足分析要求。農藥標準品色譜圖及空白辣椒醬樣品色譜圖如圖3所示。

圖 3 農藥標準品（A）和空白辣椒醬樣品（B）色譜圖Fig.3 Chromatogram of pesticide standards and bank chili sauce sample

2.5 線性范圍和檢出限

在選定的色譜條件下進行測定，以峰面積對農藥標準溶液質量濃度作校正曲線，獲得了8 種農藥的線性范圍，以3 倍信噪比計算檢出限，由表1可知，8 種農藥線性關系良好，相關系數(shù)高，檢出限較低，本方法能夠滿足復雜基質辣椒醬中農藥多殘留分析的要求。

注：Y為峰面積；x為溶液質量濃度。

2.6 加標回收率和精密度

在不含農藥的樣品中分別添加低、中、高3 個水平的8 種有機氯農藥混合標準工作溶液，平行檢測5 次，8種農藥的平均回收率為74.58%～102.86%，相對標準偏差為1.07%～5.45%，具體結果如表2所示。

表 2 8種農藥在辣椒醬中的添加回收率和精密度（n=5）=5 Table 2 Recoveries and precision of 8 pesticides in spiked chili sauce (Table 2 Recoveries and precision of 8 pesticides in spiked chili sauce (n n = 5)= 5)農藥 10 μg/kg 20 μg/kg 40 μg/kg回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%α-六六六 90.26 1.93 95.89 1.85 89.74 2.38 γ-六六六 88.92 3.43 93.24 2.83 97.55 3.61 β-六六六 101.15 4.78 99.48 4.13 93.19 5.22 δ-六六六 93.65 1.07 98.22 1.93 102.86 2.98 p,p?-滴滴伊 84.90 3.49 95.78 2.90 90.32 3.21 o,p?-滴滴涕 89.02 5.45 92.34 4.98 96.88 5.19 p,p?-滴滴滴 74.58 2.58 82.61 3.21 85.49 2.09 p,p?-滴滴涕 76.23 3.13 80.83 2.54 79.75 3.22

2.7 實際樣品分析

隨機抽取市售的6 種不同品牌辣椒醬樣品進行檢測，在3 種樣品中發(fā)現(xiàn)有機氯類農藥殘留，檢出量均小于我國的辣椒中農藥殘留限量標準0.05 mg/kg[20]。

注：ND.未檢測到。

3 結 論

建立了MSPD-GPC凈化，氣相色譜法檢測辣椒醬中8 種有機氯類農藥多殘留分析方法。本方法通過參照有關文獻，在SPE法、GPC法和MSPD凈化方式的選擇上進行了一些改進，解決了辣椒醬樣品前處理復雜、基質干擾嚴重等難題，探索了一套新穎的樣品前處理方法，以GC-ECD進行檢測，標準品定性，外標法定量，通過大量辣椒醬樣品實驗驗證，8 種有機氯類農藥的線性關系良好，回收率在74.58%～102.86%，日內相對標準偏差為1.07%～5.45%（n=5），檢出限為0.40～1.20 μg/kg，此方法可適用于辣椒醬及其制品中有機氯類農藥多殘留分析。

[1]薛海全, 崔兆杰, 杜世勇. ASE萃取-GPC凈化-GC/ECD測定小麥中有機氯農殘和多氯聯(lián)苯[J]. 山東大學學報: 理學版, 2011, 46(1): 11-15.

[2]吳金浩, 李愛, 劉桂英. 微波輔助萃取-氣相色譜法檢測裙帶菜中的多氯聯(lián)苯和有機氯農藥殘留[J]. 環(huán)境化學, 2013, 32(1): 156-161.

[3]孔祥虹, 海云, 樂愛山, 等. 固相萃取-毛細管氣相色譜法同時測定黃瓜中 23 種有機氯和擬除蟲菊酯類農藥殘留量[J]. 食品科學, 2007,28(2): 267-270.

[4]賀小雨, 陳樹兵, 俞雪鈞. 冷凍去脂-固相萃取/氣相色譜-質譜法對水產品中禾草丹、溴氰菊酯及19 種有機氯農藥殘留的測定[J]. 分析測試學報, 2009, 28(3): 306-309.

[5]曹殿潔, 黃信龍. 分散固相萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用法快速檢測蔬菜中18 種農藥殘留[J]. 食品科學, 2013, 34(10): 219-222.

[6]孫軍, 潘玉香, 董靜, 等. 氣相色譜法檢測蔬菜中有機氯和菊酯類殘留的脫色方法[J]. 檢驗檢疫科學, 2007, 17(1): 89-90.

[7]王云鳳, 常春艷, 陳其勇, 等. 凝膠滲透色譜和氣相色譜-質譜法測定動物食品中27 種有機氯和15 種擬除蟲菊酯類農藥殘留量[J]. 分析測試學報, 2007, 26(增刊1): 253-256.

[8]杜娟, 呂冰, 朱盼, 等. 凝膠滲透色譜-固相萃取聯(lián)合凈化氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定動物性食品中30 種有機氯農藥的殘留量[J]. 色譜,2013, 31(8): 739-746.

[9]孫艷艷, 王菡, 陳曉輝, 等. 基質固相分散法測定大蒜中11 種有機氯農藥殘留[J]. 現(xiàn)代科學儀器, 2009(3): 55-57.

[10]張立金, 王曉. 基質固相分散-氣相色譜-質譜法檢測水果中的農藥多殘留[J]. 食品科學, 2009, 30(16): 262-265.

[11]曹淑瑞, 王國民, 張雷, 等. 氣相色譜法同時測定火鍋底料中多種有機磷農藥殘留[J]. 食品科學, 2011, 32(2): 173-176.

[12]郭重華, 楊坪, 錢蜀, 等. 快速溶劑萃取-氣相色譜/串聯(lián)質譜法測定農作物中的有機氯農藥[J]. 中國環(huán)境檢測, 2009, 25(5): 27-30.

[13]宋淑玲, 李重九, 馬曉東. 蔬菜農藥多殘留分析中基質共提物凈化方法的研究[J]. 分析測試學報, 2008, 27(8): 795-799.

[14]宋淑玲, 李重九, 馬曉東, 等. 蔬菜中殘留農藥的石墨化碳黑凈化和氣相色譜質譜檢測方法[J]. 分析化學, 2008, 36(11): 1526-1530.

[15]宋淑玲, 饒竹. 食品與環(huán)境樣本中有機氯農藥殘留的凈化技術研究進展[J]. 農藥學學報, 2011, 13(5): 439-447.

[16]奉夏平, 陳衛(wèi)國, 王志元, 等. 基質固相分散-氣相色譜法同時測定蔬菜水果中多種農藥殘留[J]. 食品科學, 2005, 26(7): 194-197.

[17]康慶賀, 吳巖, 高凱揚. 固相萃取-在線凝膠滲透色譜-氣相色譜/質譜法測定松子仁中的28 種有機氯農藥和擬除蟲菊酯農藥色譜[J].色譜, 2009, 27(2): 181-185.

[18]王耀, 胡浩光, 謝翠美, 等. 加速溶劑萃取-凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜測定咸魚中的敵敵畏[J]. 食品科學, 2010, 31(14): 268-271.

[19]李斌, 劉昕宇, 解啟來, 等. 自動索氏抽提-凝膠滲透色譜(GPC) -氣相色譜/質譜法測定沉積物中多環(huán)芳烴和有機氯農藥[J]. 環(huán)境化學,2014, 33(2): 236-242.

[20]梁偉紅, 方佳, 李玉萍, 等. 國內外辣椒農藥殘留限量標準比較分析[J].安徽農業(yè)科學, 2011, 39(8): 4582-4584.