利用轉(zhuǎn)基因煙草確定AtELHYPRP2蛋白對赤霉菌的抗性及其亞細(xì)胞定位特征

柴秋霞，李本昌，徐子勤

西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陜西省生物技術(shù)重點實驗室 西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，陜西 西安710069

細(xì)胞壁是植物抵御病原體侵染、極端溫度、脫水等生物和非生物脅迫因素的第一道屏障。在脅迫條件下，細(xì)胞表面的脂類和蛋白質(zhì)組分會發(fā)生改變和重排，以此來增強細(xì)胞壁的牢固性，減輕不利環(huán)境對細(xì)胞的損傷作用。脂轉(zhuǎn)移蛋白 (Lipid transfer protein, LTP) 是細(xì)胞壁中的主要蛋白質(zhì)，大小9–10 kDa，具有許多重要的生物學(xué)功能[1-3]。離體實驗結(jié)果表明，LTP能夠在膜之間轉(zhuǎn)移脂質(zhì)分子，它們與脂質(zhì)分子的親合作用沒有選擇性[4]。在植物中，角質(zhì)的形成、花器官親脂性物質(zhì)的沉積以及胚胎的早期發(fā)生過程均與LTP有關(guān)[5-6]。

在植物抗真菌反應(yīng)中，LTP能夠與細(xì)胞膜上特定的脂蛋白和激發(fā)素 (Elicitin) 受體結(jié)合，直接或通過與富含半胱氨酸的硫素蛋白 (Thionin)協(xié)同作用來增加膜的通透性[7-8]。LTP蛋白的結(jié)構(gòu)特點是含有 8個高度保守的半胱氨酸殘基，可形成 4個二硫鍵，三級結(jié)構(gòu)具有一個穩(wěn)定的疏水性空腔，用于結(jié)合與轉(zhuǎn)運脂類物質(zhì)[7]。越來越多的證據(jù)顯示LTP參與了植物的抗病反應(yīng)，它們能夠抑制病原體生長，并可能負(fù)責(zé)傳遞與系統(tǒng)性獲得抗性 (Systemic acquired resistance,SAR) 有關(guān)的脂類信號分子[9-12]。

擬南芥AT4G12500基因編碼一個大小為18.35 kDa的蛋白質(zhì)，與EARLI1蛋白具有很高的同源性[13]，均由N端的信號肽序列、中間位置的親水性富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域 (Proline-Rich-Domain, PRD) 和 C端的疏水性八半胱氨酸基序 (Eight Cysteine Motif, 8CM) 構(gòu)成，因此本工作將其命名為AtELHYPRP2(EARLI1-LIKE HYBRID PROLINE-RICH PROTEIN 2)。該基因編碼蛋白的8CM結(jié)構(gòu)域包含8個位置十分保守的半胱氨酸，其中第 3和第 4個半胱氨酸是連續(xù)的，第 5和第 6個半胱氨酸中間只隔一個氨基酸殘基，這與 LTP十分相似，因此也被歸類到 LTP家族中[14]。AtELHYPRP2蛋白的 PRD結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞壁中的富含脯氨酸蛋白 (Proline-Rich-Protein, PRP) 以及伸展蛋白具有較高的相似性，可能與細(xì)胞壁有功能上的聯(lián)系[15]。

AtELHYPRP2、AZI1、EARLI1和AT4G12490四個 EARLI1亞家族基因串聯(lián)排列在擬南芥的第 4號染色體上，基因芯片分析結(jié)果顯示它們在生物和非生物脅迫條件下具有共表達(dá)特征，但目前尚未見有關(guān)AtELHYPRP2基因功能的專門報道。已有的研究表明，EARLI1重組蛋白能夠抑制釀酒酵母和真菌細(xì)胞的生長[16]，同一亞家族基因AZI1對蒜薹灰霉菌具有抗性[17]。另外，AZI1能夠和DIR1相互作用，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移與SAR有關(guān)的長距離信號[18]。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法得到了表達(dá)AtELHYPRP2-GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草植株，研究了AtELHYPRP2蛋白的亞細(xì)胞定位特征、對真菌病原體的抗性功能及其在煙草SAR中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與真菌菌株

實驗使用的植物材料為擬南芥Arabidopsis thalianaCol-0生態(tài)型 (Columbia-0) 植株和秦?zé)?5Nicotiana tabacum無菌苗?；蚩寺嶒灢捎么竽c桿菌Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。煙草遺傳轉(zhuǎn)化實驗使用農(nóng)桿菌LBA4404菌株。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶PagⅠ、SpeⅠ、NcoⅠ和 T4 DNA連接酶購自 Fermentas公司；2×TaqPCR Mix購自西安潤德生物技術(shù)有限公司；PfuDNA聚合酶、瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自生工生物工程有限公司；DL2000 DNA Ladder、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1302為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建

按照CTAB法從擬南芥Col-0生態(tài)型植株葉片提取基因組DNA，根據(jù)AtELHYPRP2基因的開放閱讀框設(shè)計上下游引物 AT4G12500PagⅠ和 AT4G12500SpeⅠ (表 1)，采用Pfu高保真DNA聚合酶進行PCR反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。用PagⅠ和SpeⅠ對純化的AtELHYPRP2基因擴增產(chǎn)物進行分步酶切，得到具有粘性末端的目的片段。用質(zhì)粒小提試劑盒提取pCAMBIA1302質(zhì)粒，經(jīng)NcoⅠ和SpeⅠ雙酶切得到具有粘性末端的載體片段。用T4 DNA連接酶連接目的片段和載體片段，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后再附加50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)。對獲得的抗性克隆進行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的菌液送往上海生工生物技術(shù)公司進行測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)AtELHYPRP2基因煙草植株的再生

從測序正確的克隆提取 pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP質(zhì)粒DNA，用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞，在附加100 μg/mL 鏈霉素、50 μg/mL 卡那霉素和 20 μg/mL利福平的YEB培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)。對獲得的陽性克隆進行菌落PCR鑒定，用鑒定正確的克隆轉(zhuǎn)化秦?zé)?5葉片外植體。將葉片放入帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，用剪刀將其剪成 1 cm×1 cm大小，然后浸入OD600≈0.6的農(nóng)桿菌菌液中侵染5 min。用無菌濾紙吸干菌液后，將葉片外植體轉(zhuǎn)接到附加1 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，在黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。將暗培養(yǎng)的煙草葉片轉(zhuǎn)移到附加 500 mg/L頭孢霉素、25 mg/L潮霉素B的選擇培養(yǎng)基上進行愈傷組織和芽的誘導(dǎo)。將長大的芽轉(zhuǎn)至含0.1 mg/L NAA的1/2 MS培養(yǎng)基上生根。將完整的再生植株移栽到珍珠巖 蛭石 營養(yǎng)土 (1∶1∶2) 基質(zhì)中培養(yǎng)，生長條件為16 h光照/8 h黑暗、65%濕度、21 ℃。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定

從具有潮霉素 B抗性的轉(zhuǎn)基因煙草中提取基因組DNA，用AtELHYPRP2基因開放閱讀框上下游引物進行PCR鑒定。取0.2 g轉(zhuǎn)基因煙草葉片，在液氮中研磨后用Trizol試劑 (Invitrogen公司) 提取總RNA。經(jīng)紫外定量后，將RNA稀釋到合適濃度，用 ExScript RT Reagent Kit(TaKaRa公司) 合成cDNA。以cDNA為模板，用AtELHYPRP2基因開放閱讀框上下游引物進行RT-PCR，檢測轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)水平。RT-PCR以煙草Actin基因為內(nèi)部參照，上下游引物序列分別為Tobacco F和Tobacco R (表1)。

表1 PCR擴增所用引物序列Table 1 Primers used in PCR

1.2.4 赤霉菌侵染分析

赤霉菌Gibberella fujikuroi菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上于28 ℃倒置培養(yǎng)4 d后，用1/4液體馬鈴薯培養(yǎng)基懸浮孢子。經(jīng)玻璃棉過濾除去菌絲后，將赤霉菌孢子與馬鈴薯培養(yǎng)基混勻，28 ℃倒置培養(yǎng)4 d；然后用打孔器將培養(yǎng)基打成直徑為1 cm的小圓盤，接種于秦?zé)?5野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片上，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、90%濕度條件下培養(yǎng)。5 d后觀察葉片形態(tài)及赤霉菌侵染程度。侵染實驗重復(fù)3次。

為了檢測 H2O2的積累情況，侵染2 d后用0.5% DAB (3,3-二氨基聯(lián)苯胺) 在 37 ℃對野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片進行過夜染色，經(jīng)乙醇脫色后用 80%甘油封片觀察。同時，用 0.4%臺盼藍(lán)對侵染2 d后的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片于37 ℃染色1 h，在85%乙醇中煮10 min脫去葉綠素，用 80%甘油封片后在顯微鏡下觀察細(xì)胞的存活狀態(tài)。

1.2.5 AtELHYPRP2蛋白的亞細(xì)胞定位

取野生型秦?zé)?5、AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草和GFP轉(zhuǎn)空載煙草的葉片和根，平鋪在加有1.5 μmol/L熒光染料碘化丙啶 (PI) 的載玻片上，浸潤15–30 min后壓片。在OLYMPUS 激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察GFP產(chǎn)生的綠色熒光和 PI結(jié)合細(xì)胞壁后產(chǎn)生的紅色熒光，確定AtELHYPRP2蛋白的存在部位。GFP的激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為507 nm。PI的激發(fā)光波長為535 nm，發(fā)射光波長為615 nm。

1.2.6 SAR相關(guān)PR基因的表達(dá)分析

赤霉菌在馬鈴薯培養(yǎng)基中倒置培養(yǎng)4 d后，切成1 cm×1 cm的小塊，接種于野生型秦?zé)?5和轉(zhuǎn)基因植株下部的葉片上，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、90%濕度條件下培養(yǎng)。5 d后取侵染葉片和上部未侵染葉片，用 Trizol試劑提取總 RNA。經(jīng)紫外定量后，將 RNA稀釋到合適濃度，用ExScript RT Reagent Kit (TaKaRa) 合成cDNA。將cDNA稀釋到200 ng/μL，作為模板，用 SAR相關(guān) PR基因的上下游引物進行RT-PCR，檢測 PR基因在野生型與轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況。RT-PCR以煙草Actin基因為內(nèi)部參照，PR1基因的上下游引物分別為PR1F和PR1R，PR3基因的上下游引物分別為 PR3F和PR3R[19]，PR5基因的上下游引物分別為 PR5F和 PR5R (表 1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtELHYPRP2蛋白的結(jié)構(gòu)分析

AtELHYPRP2基因的開放閱讀框包含 534個堿基對，無內(nèi)含子，編碼的蛋白質(zhì)由 177個氨基酸構(gòu)成。AtELHYPRP2蛋白的理論等電點和分子量分別為8.93 kDa和18.35 kDa。預(yù)測該蛋白由N端的信號肽序列 (1–26)、中間富含脯氨酸的親水性結(jié)構(gòu)域PRD (27–94) 和C端保守的疏水性 8CM (95–177) 組成 (圖 1)。對Genevestigator (https：//www.genevestigator.com/)數(shù)據(jù)庫中的芯片實驗結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)AtELHYPRP2基因可以被生物和非生物脅迫因素誘導(dǎo)，說明該基因在擬南芥抗逆性方面可能具有一定的作用。采用DNAStar MegAlign中的Clustal W 算法進行序列比對，結(jié)果顯示AtELHYPRP2與 EARLI1之間具有很高的同源性 (圖 2)。

2.2 pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 AtELHYPRP2蛋白(NP192987)的氨基酸序列Fig. 1 Deduced amino acid sequence of AtELHYPRP2. The signal peptide is underlined, 8CM is framed, and the conservative cysteine residues are shadowed.

圖2 AtELHYPRP2與EARLI1氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of the amino acid sequences between AtELHYPRP2 and EARLI1.

AtELHYPRP2基因沒有內(nèi)含子，可根據(jù)開放閱讀框設(shè)計一對引物，以基因組DNA為模板擴增它的編碼序列。本實驗所用的載體為pCAMBIA1302，在35S啟動子和gfp報告基因之間有3個酶切位點，在構(gòu)建融合表達(dá)載體時選擇了NcoⅠ和SpeⅠ兩個酶切位點。由于AtELHYPRP2基因內(nèi)部存在NcoⅠ酶切位點，所以在擴增目的片段時，上游引物 5′-端引入了NcoⅠ同尾酶PagⅠ的識別和切割位點，下游引物5′-端引入了SpeⅠ限制性酶切位點。因為PagⅠ和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶所用的緩沖液不同，所以對純化的AtELHYPRP2基因擴增產(chǎn)物進行了分步酶切，用NcoⅠ和SpeⅠ內(nèi)切酶對 pCAMBIA1302質(zhì)粒載體進行了雙酶切。進一步用T4 DNA連接酶連接目的片段和載體片段，轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞后在附加50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)。對獲得的抗性克隆進行菌落PCR鑒定，可以擴增產(chǎn)生534 bp的條帶 (圖3A)，符合預(yù)期大小。將鑒定正確的克隆送往上海生工生物技術(shù)公司進行測序，結(jié)果顯示本實驗克隆的AtELHYPRP2基因在序列上與GenBank中登錄的數(shù)據(jù)完全一致。

2.3 AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草植株的再生

用液氮凍融法將pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，挑取抗性克隆，進行菌落PCR檢測，結(jié)果產(chǎn)生符合預(yù)期大小的條帶 (圖3B)。對鑒定正確的農(nóng)桿菌克隆進行擴大培養(yǎng)，采用葉圓盤轉(zhuǎn)化法對秦?zé)?95無菌苗葉片進行遺傳轉(zhuǎn)化。將侵染過的葉片在附加1 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3 d。將共培養(yǎng)的葉片外植體轉(zhuǎn)入含500 mg/L Cef、25 mg/L HmB、1 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中進行選擇培養(yǎng)，大約 1個月后長出愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，20 d后分化出芽，然后轉(zhuǎn)至附加0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基生根。將完整植株移栽到混合基質(zhì)中，長大后進行分子生物學(xué)鑒定。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定

采用CTAB法從具有潮霉素B抗性的轉(zhuǎn)基因煙草提取基因組DNA，進行PCR鑒定，結(jié)果顯示7株再生植株中有6株整合有AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)移基因 (圖 4A)。從 6株AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草 (分別命名為 T1、T2、T3、T4、T5、T6) 葉片提取總 RNA，進行 RT-PCR，結(jié)果表明轉(zhuǎn)移基因可以表達(dá)產(chǎn)生mRNA (圖4B)。通過 Quantity One軟件對轉(zhuǎn)基因煙草中目的基因與組成性表達(dá)的Actin基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析，并以兩者的比值作為不同轉(zhuǎn)基因株系中目的基因的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系1–6中AtELHYPRP2基因的相對表達(dá)量分別為1.406 25、1.609 8、0.598 3、2.485 4、1.486 9 和0.507 7。從6株轉(zhuǎn)基因植株中選取5株提取總蛋白進行Western blotting印跡分析，結(jié)果顯示在這5個轉(zhuǎn)基因株系中都能夠檢測到目的蛋白 (圖5)。

圖 3 pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α細(xì)胞 (A) 及農(nóng)桿菌 LBA4404細(xì)胞 (B) 的菌落PCR鑒定Fig. 3 Colony PCR of Escherichia coli DH5α and Agrobacterium tumefaciens LBA4404 transformed by pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP. (A) Colony PCR of Escherichia coli DH5α. M： DL2000 DNA ladder; CK：negative control; 1–10： different colonies transformed by ligation product. (B) Colony PCR of Agrobacterium tumefaciens LBA4404. M： DL2000 DNA ladder; CK： negative control; 1–5： different colonies transformed by pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP.

圖4 AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測及RT-PCR分析Fig. 4 PCR identification and RT-PCR analysis of transgenic tobacco plants containing AtELHYPRP2-GFP. (A)PCR identification of transgenic tobacco plants. CK： wild-type tobacco plant; 1–7： putative transgenic plants; M：DL2000 DNA ladder. (B) RT-PCR analysis of transgenic tobacco plants. CK： negative control, without template; 1–6：RT-PCR of Actin gene in different transgenic tobacco plants (T1–T6); W： RT-PCR of Actin gene in wild-type tobacco plant; M： DL2000 DNA ladder; CK'： negative control, without template; 1′–6′： RT-PCR of AtELHYPRP2-GFP in different transgenic tobacco plants (T1–T6); W'： RT-PCR of AtELHYPRP2-GFP in wild-type tobacco plant.

圖5 AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草的Western blotting分析Fig. 5 Western blotting analysis of transgenic tobacco plants containing AtELHYPRP2-GFP. M： PageRuler?Prestained Protein Ladder RDM604; W： total protein of wild-type tobacco plant; T1, T2, T3, T4, T6： total protein of different transgenic tobacco plants. Top panel： Western blotting analysis of AtELHYPRP2-GFP expression in different transgenic tobacco plants. Lower panel： Rubisco was adopted to show the loading amount of different samples.

2.5 赤霉菌侵染分析

為了檢測AtELHYPRP2基因?qū)φ婢≡w的抗性，切取第1代不同轉(zhuǎn)基因煙草株系和不同野生型煙草個體同一部位、大小接近相同的葉片，進行赤霉菌侵染，結(jié)果顯示侵染5 d后野生型煙草葉片侵染點周圍的細(xì)胞逐漸壞死，損傷程度明顯比轉(zhuǎn)基因煙草葉片嚴(yán)重；同時，野生型煙草葉片明顯變黃 (圖 6)。這說明整合有AtELHYPRP2基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株對赤霉菌具有明顯的抗性。同時，對赤霉菌侵染 8 d后的壞死斑大小進行了統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草的壞死斑明顯小于野生型煙草，且具有統(tǒng)計學(xué)差異 (圖7)。為了檢測AtELHYPRP2基因表達(dá)水平與抗菌性的關(guān)系，從6株轉(zhuǎn)基因株系中選擇T1、T2、T4、T6四個株系進行赤霉菌侵染實驗，8 d后觀察侵染情況。結(jié)果顯示，AtELHYPRP2基因表達(dá)量高的煙草葉片上形成的壞死斑小于表達(dá)量低的轉(zhuǎn)基因煙草(圖 8)。

為了檢測侵染位點H2O2的積累情況，將赤霉菌侵染 2 d后的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片在DAB中染色過夜，經(jīng)85%乙醇脫去葉綠素后用甘油封片觀察。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草葉片侵染位點被染成深紅棕色的斑，說明接種后可造成 H2O2的大量積累，引發(fā)超敏反應(yīng) (圖 9B)。而野生型煙草葉片侵染位點能產(chǎn)生彌散的淺紅棕色的區(qū)域，說明接種后產(chǎn)生了低水平的H2O2積累，不能引發(fā)超敏反應(yīng) (圖9A)。為了檢測侵染位點的細(xì)胞存活狀態(tài)，將赤霉菌侵染2 d后的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片在臺盼藍(lán)中染色1 h，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草葉片侵染位點周圍細(xì)胞的壞死狀況比野生型煙草葉片輕，病原體沒有擴散，而野生型煙草葉片侵染位點周圍病原體已有明顯的擴散 (圖10)。

圖7 赤霉菌侵染后AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草及野生型煙草葉片上壞死斑大小的統(tǒng)計學(xué)分析Fig. 7 Statistical analysis of the sizes of necrotic spots on leaves of transgenic tobacco plants harboring AtELHYPRP2-GFP and wild-type tobacco plants after infection with G. fujikuroi. Data were recorded 8 days post infection and were shown as the ±s of three replications. AtELHYPRP2-GFP： transgenic tobacco plants; CK, wild-type tobacco plants.

圖8 不同AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草株系對赤霉菌的抗性Fig. 8 Resistance of different transgenic tobacco lines containing AtELHYPRP2-GFP to G. fujikuroi. T1, T2,T4, T6： different transgenic tobacco lines.

圖9 赤霉菌侵染后H2O2積累水平的DAB染色Fig. 9 DAB staining of H2O2 accumulation after infection with G. fujikuroi. (A) Leaf of wild-type tobacco plants. (B) Leaf of transgenic tobacco plants.Arrow pointing to the infection site. Bar=1 mm.

圖10 細(xì)胞存活狀態(tài)的臺盼藍(lán)染色Fig. 10 Observation of cell survival by trypan blue staining. (A) Leaf of transgenic tobacco plants. (B)Leaf of wild-type tobacco plants. Arrow pointing to the infection site. Bar=0.5 mm.

2.6 AtELHYPRP2蛋白的亞細(xì)胞定位

激光共聚焦顯微觀察結(jié)果顯示，AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草根中的綠色熒光分布于細(xì)胞表面，能夠與碘化丙啶對細(xì)胞壁染色后產(chǎn)生的紅色熒光重合，說明AtELHYPRP2蛋白在細(xì)胞內(nèi)被翻譯合成后，可通過分泌途徑定位到細(xì)胞表面，并且主要存在于細(xì)胞壁中 (圖11A-I)。另外，還可以觀察到綠色熒光分布于與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相通的細(xì)胞核的外膜上，說明該蛋白也可能存在于內(nèi)膜系統(tǒng)。已有的研究表明，DIR1、AZI1蛋白可定位于細(xì)胞核外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及胞間連絲[12,18]。本研究發(fā)現(xiàn)與 AZI1屬于同一亞家族的AtELHYPRP2蛋白既可以分泌到細(xì)胞表面，也可能定位于內(nèi)膜系統(tǒng)。與此相反，在pCAMBIA1302空載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草中，GFP熒光存在于整個細(xì)胞中 (圖11J-L)。

2.7 AtELHYPRP2對煙草系統(tǒng)性獲得抗性相關(guān)基因表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果表明，在AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草中，與SAR相關(guān)的PR1基因的本底表達(dá)量比野生型高，PR3、PR5基因的本底表達(dá)水平與野生型相差不大 (圖 12A)，說明轉(zhuǎn)基因煙草中AtELHYPRP2基因的組成性表達(dá)能夠影響系統(tǒng)性獲得抗性中的主要基因。赤霉菌侵染5 d后，AtELHYPRP2-GFP轉(zhuǎn)基因煙草被侵染葉片中3個PR基因的表達(dá)水平與野生型被侵染葉片相差不大。但是在上部未侵染葉片中，轉(zhuǎn)基因煙草PR1和PR5基因的表達(dá)量整體比野生型高 (圖12B)，說明AtELHYPRP2基因在SAR中具有一定的作用。在侵染實驗中，盡管PR1和PR5在不同野生型對照個體的系統(tǒng)葉片中的表達(dá)水平存在一定差異(圖12B中2、4泳道)，但都明顯低于轉(zhuǎn)基因煙草的系統(tǒng)葉片(圖12B中6、8 泳道)。

圖11 AtELHYPRP2蛋白的亞細(xì)胞定位Fig. 11 Subcellular localization of AtELHYPRP2. (A–F) Root transection of transgenic tobacco plants harboring AtELHYPRP2-GFP. (A, D) Fluorescence of GFP. (B, I) Fluorescence of PI. (C, F) Merge of A, B and D, E,respectively. (G–I) Longitudinal section of root of transgenic tobacco plant harboring AtELHYPRP2-GFP. (G)Fluorescence of GFP. (H) Fluorescence of PI. (I) Merge of G and H. (J–L) GFP fluorescence in transgenic tobacco plants transformed by empty vector.

圖12 AtELHYPRP2-GFP對煙草中與SAR相關(guān)的PR基因的影響Fig. 12 Influence of AtELHYPRP2-GFP to tobacco PR genes related with SAR. (A) Basal expression level of PR genes. CK： negative control, without template; 1–2： wild-type tobacco plants; 3–6： transgenic tobacco lines. (B)Expression level of PR genes after G. fujikuroi infection. CK： negative control, without template; 1, 3： local wild-type tobacco leaves infected with G. fujikuroi; 2, 4： distal wild-type tobacco leaves after infection with G. fujikuroi; 5, 7：local transgenic tobacco leaves infected with G. fujikuroi; 6, 8： distal transgenic tobacco leaves after infection with G. fujikuroi.

3 討論

植物對病原體的抗性可以用基因?qū)驅(qū)W說加以解釋。該學(xué)說認(rèn)為當(dāng)病原菌具有無毒基因 (Avr)、宿主植物具有抗性基因 (R) 時，R基因的表達(dá)產(chǎn)物和Avr基因的表達(dá)產(chǎn)物相互作用，會使植物個體表現(xiàn)出抗性[20]。植物有多條阻止病原體侵染的途徑。當(dāng)植物對病原體具有抗性時，經(jīng)常會產(chǎn)生超敏反應(yīng) (Hypersensitive response, HR)。HR指侵染位置的細(xì)胞迅速進入程序化死亡過程，限制病原體向其他部位擴散，能夠使周圍的健康組織免受損害。HR往往伴隨著一系列與防御相關(guān)的應(yīng)答反應(yīng)，包括過氧化氫等活性氧分子 (Reactive oxygen species，ROS)的爆發(fā)等[21]?；钚匝鯇τ诩?xì)胞內(nèi)和周圍細(xì)胞是一種預(yù)警信號，它們能夠引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的加厚、植物抗毒素的產(chǎn)生、超敏反應(yīng)和SAR反應(yīng)等[22]。在病原體侵染時，有些植物不產(chǎn)生抗毒素，而是釋放酚醛樹脂、環(huán)烯醚萜苷類、芥子油苷和皂苷等有毒物質(zhì)，這些有毒物質(zhì)在正常情況下是以無毒的糖苷類形式儲存于液泡中的[23]。

DAB染色可以反映病原體侵染后植物組織中主要的活性氧分子過氧化氫的積累水平。DAB在過氧化氫存在下會失去電子而形成淺棕色不溶性產(chǎn)物，可用于檢測過氧化物酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，用赤霉菌孢子侵染后，轉(zhuǎn)基因煙草葉片侵染位點被DAB染成了深棕紅色，有大量H2O2積累，引發(fā)了超敏反應(yīng)。而野生型煙草葉片侵染位點只被染成彌散的淺棕紅色，不能引發(fā)超敏反應(yīng)。臺盼藍(lán)是一種細(xì)胞活性染料，常用于檢測細(xì)胞膜的完整性。用赤霉菌孢子侵染后，野生型煙草葉片侵染位點附近細(xì)胞的壞死狀況明顯比轉(zhuǎn)基因煙草嚴(yán)重。

真菌孢子與植物表面接觸后，在合適條件下就會萌發(fā)。植物已進化出很多機制來阻止真菌孢子的萌發(fā)和萌發(fā)管的伸長過程，包括加厚的角質(zhì)層等機械屏障和分泌化學(xué)物質(zhì)，以防止菌絲侵入表皮[24]。已有的研究報道表明，EARLI1和AZI1對真菌病原體及釀酒酵母的生長有明顯的抑制作用[16-17]，AZI1基因在系統(tǒng)性獲得抗性的信號傳遞過程中具有功能[11]。AtELHYPRP2基因與EARLI1、AZI1基因?qū)儆谕粊喖易?，本研究對煙草中與 SAR有關(guān)的基因進行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)組成性表達(dá)AtELHYPRP2-GFP基因能夠在本底水平上提高煙草PR1基因的表達(dá)量。在真菌誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)基因煙草中PR1和PR5基因的系統(tǒng)表達(dá)水平要比野生型煙草高，說明AtELHYPRP2基因參與了 SAR。另外，本實驗室還制備了以 Col-0為背景的AtELHYPRP2基因擬南芥過表達(dá)株系和RNA干擾株系，并且已經(jīng)篩選出該基因的 T-DNA插入突變體，發(fā)現(xiàn)AtELHYPRP2基因在擬南芥局部和系統(tǒng)抗性中均具有一定的功能。利用GFP標(biāo)簽可以對蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位特征進行研究，GFP熒光的產(chǎn)生說明在煙草中表達(dá)產(chǎn)生的AtELHYPRP2-GFP融合蛋白能夠正確折疊。本文涉及的在煙草中的實驗結(jié)果說明該基因具有抗菌特征，并且顯示帶GFP標(biāo)簽的蛋白質(zhì)是有功能的。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化實驗中，常用的報告基因有 β-葡萄糖醛酸酶 GUS基因和熒光素酶 LUC基因。大多數(shù)植物種類都沒有背景GUS活性，4-甲基傘形酮-D-葡糖苷酸經(jīng) GUS水解產(chǎn)生的4-甲基傘形酮可以在365 nm激發(fā)光作用下發(fā)出455 nm波長的熒光，很容易對基因的表達(dá)水平進行量化；另外，GUS切割X-Gluc的糖苷鍵之后，糖苷配基將氧化脫氫形成二聚體靛藍(lán)色沉淀，可用于顯示完整組織中基因的表達(dá)模式[25]。但是，GUS檢測實驗對植物細(xì)胞是有害的，材料不能存活。在體外添加熒光素的條件下，利用熒光素酶基因可通過視頻成像系統(tǒng)觀察基因的表達(dá)活性[26-27]，但它的測量必須在黑暗條件下進行，這將影響植物的生理特性，還必須把底物導(dǎo)入到植物組織中。綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光可以直接進行觀察，不需要外源底物或輔助因子的參與，并且對植物沒有毒害作用[28]，它的應(yīng)用范圍已經(jīng)超過了GUS和LUC。本研究利用GFP在轉(zhuǎn)基因煙草中對AtELHYPRP2蛋白進行了亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)它定位于細(xì)胞壁上。作為細(xì)胞表面蛋白，AtELHYPRP2可能會破壞病原體細(xì)胞，抑制病原性真菌孢子的萌發(fā)，激發(fā)植物防御系統(tǒng)，并通過產(chǎn)生活性氧來引發(fā)植物的超敏反應(yīng)，阻止真菌病原體向健康組織擴散。AtELHYPRP2在系統(tǒng)性獲得抗性信號傳遞方面是否起作用，可通過后續(xù)的野生型-轉(zhuǎn)基因煙草的嫁接實驗檢測它的移動性加以確定。

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