邱義蘭,吳俊文,邱果,李桑,李燁,劉勝姿,劉如石,3
1 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖南 長沙 410081 2 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410013 3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖南 長沙 410128
戊型肝炎是全球最主要的病毒性肝炎之一,由HEV感染導(dǎo)致,戊型肝炎多數(shù)呈自限性,其癥狀與甲肝相似,但癥狀更重,死亡率更高,該病孕婦死亡率高達(dá) 20%,慢性肝病患者合并戊型肝炎感染容易引發(fā)肝衰竭,病死率達(dá)70%[1-4]。HEV 至少可以分為 4 個基因型,在中國主要流行的是基因Ⅰ型和基因Ⅳ型 HEV。根據(jù)易感宿主又可以分為 2 個大類:一類 (H類) 僅分離于人類,包括基因Ⅰ型和基因Ⅱ型,是迄今病因明確的大規(guī)模戊肝爆發(fā)的病原體,實(shí)驗(yàn)動物目前只成功感染非人靈長類;另一類(Z類) 廣泛分布于世界各地,只見于小規(guī)模流行和臨床散發(fā)病例,可以感染多種哺乳動物,目前研究發(fā)現(xiàn)豬為 Z類HEV的天然宿主[5-7]。由于缺乏可靠的 HEV細(xì)胞培養(yǎng)模型及動物模型,對完整 HEV的研究較少,因此,H類和Z類在跨種間感染入侵宿主細(xì)胞機(jī)制的差異,以及致病機(jī)理至今還不清楚。
HEV ORF2 編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白,形成病毒衣殼蛋白,介導(dǎo)HEV與宿主的吸附?,F(xiàn)有的研究結(jié)果證明,HEV的主要中和表位位于 ORF2的aa384-606之間,也是主要介導(dǎo)HEV與嗜性細(xì)胞吸附的區(qū)域[2-3,8-10]。本實(shí)驗(yàn)室在表達(dá)基因Ⅰ型HEV衣殼蛋白的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用大腸桿菌表達(dá)基因Ⅳ型 HEV衣殼蛋白缺失體 (ORF2 aa384-606),并研究了重組表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)性質(zhì)和部分物理性質(zhì),證明表達(dá)的基因Ⅳ型HEV衣殼蛋白模擬了天然病毒顆粒的中和表位,其與受體的結(jié)合方式與天然病毒結(jié)合受體的方式可能一致,為進(jìn)一步從分子水平研究戊型肝炎病毒基因Ⅰ型和基因型Ⅳ感染宿主細(xì)胞差異的機(jī)制打下了基礎(chǔ)。
HEV基因:基因Ⅳ型HEV ORF2 (aa384-606)基因來源于我國戊肝病人的血清標(biāo)本 (廈門大學(xué)夏寧邵教授惠贈),單克隆抗體15B2和8C11、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗人 IgG和 HRP-羊抗人IgM (夏寧邵教授惠贈);pMD-18T、Taq酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ和NdeⅠ (TaKaRa公司);DNA膠回收試劑盒與質(zhì)粒提取試 (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (Genestar公司);硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell公司);HRP-DAB底物顯色試劑盒 (TIANGEN公司)。
1.2.1 rP24基因的編碼序列克隆與構(gòu)建表達(dá)載體
1.2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化
挑取篩選的單克隆菌株,接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中 (含有100 μg/mL Kan+) 37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6,加入終濃度為0.4 mmol/L的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況。表達(dá)的包涵體蛋白先溶于4 mol/L尿素,然后樣品透析到20倍體積以上的PBS溶液 (20 mmol/L NaCl, 2.68 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 1.76 mmol/L KH2PO4, pH 7.4) 中 4℃復(fù)性,2?3 h更換一次PBS溶液,4 ℃、8 000×g離心 10 min,收集離心后的上清液即為復(fù)性的重組蛋白。
用10倍柱體積的PBS先平衡離子交換層析柱 (DEAE-5PW,21.5 mm×150 mm,日本TOSOH公司) 將復(fù)性蛋白樣品上柱,以2倍柱床體積的PBS緩沖液過柱,然后線性梯度 0–1 mol/L NaCl/PBS洗脫液進(jìn)行洗脫,流速為1.0 mL/min,收集280 nm吸收值大于0.5 AU的蛋白峰,每管收集1 mL,SDS-PAGE分析收集組分的蛋白純度。
收集離子交換柱純化重組蛋白,上樣于平衡好的分子篩層析柱 (TSK-GEL G 3 000 SW 7.5 mm×300 mm,日本 TOSOH),流速為0.5 mL/min,收集280 nm吸收值大于0.2 AU的蛋白峰,每管收集1 mL,SDS-PAGE分析收集組分的蛋白純度。
1.2.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) (Western blotting)
蛋白樣品經(jīng) 12%的 SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜進(jìn)行雜交:用含 5%的脫脂奶的 TBS(100 mmol/L Tris·HCl, 150 mmol/L NaCl, pH7.5)緩沖液封閉 2 h。加入用脫脂奶稀釋的抗 HEV ORF2鼠源單克隆抗體,室溫反應(yīng) 2 h;TBST緩 沖 液 (100 mmol/L Tris·HCl, 150 mmol/L NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5) 洗膜3次,每次10 min;加入HRP酶標(biāo)羊抗鼠,室溫反應(yīng)2 h,用TBST洗膜3次,每次10 min,用HRP-DAB顯色試劑盒顯色。
1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附分析 (ELISA)
將純化的 rP24重組蛋白用碳酸鹽緩沖液(3.5 mmol/L NaHCO3, 15 mmol/L Na2CO3,3 mmol/L NaN3) 稀釋抗原至終濃度為1 μg/mL,聚苯乙烯板的每孔包被100 μL,37 ℃包被2 h;棄孔內(nèi)液體,PBST洗滌1次,每孔加入200 μL封閉液 (2%明膠,0.5%酪蛋白,0.1% ProClin 300),37 ℃封閉2 h后抽干;加入樣品稀釋液(2% 明膠,0.5% 酪蛋白,0.1% ProClin 300,15% 新生牛血清) 稀釋的待檢樣品 100 μL,37 ℃孵育30 min,PBST洗滌3次;每孔加入封閉液稀釋的 HRP-羊抗人二抗 100 μL,37 ℃孵育30 min,PBST洗滌3次;每孔加入100 μL顯色液,37 ℃避光顯色10 min,加終止液終止顯色液,450 nm/620 nm雙波長檢測各孔的OD值。
1.2.5 純化后蛋白的動態(tài)光散射
動態(tài)光散射專用的石英比色皿用 0.22 μm微孔濾膜過濾的超純水反復(fù)沖洗20遍以上。待測樣品經(jīng) 4 ℃、15 000×g 離心 15 min 后,取 50 μL樣品至比色皿中,待溫度平衡到25 ℃時,將比色皿放入動態(tài)光散射儀 (美國 PROTEIN SOLUTION公司,DYNAORO99-D-50型) 樣品架進(jìn)行測量,入射波長為824 nm,溶劑為PBS,采用Regulation算法計算,根據(jù)需要設(shè)置過濾參數(shù)和分析分辨率。
1.2.6 純化蛋白非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native Blue PAGE)
非變性電泳參考 Wittig等[11]的方法,稍作修改,具體步驟如下:配制 13%的分離膠,蛋白樣品和上樣緩沖液按 1∶1的比例混勻上樣,先恒壓100 V于4 ℃電泳,待樣品進(jìn)入濃縮膠后,恒壓300 V繼續(xù)電泳,當(dāng)?shù)鞍讟悠吩诜蛛x膠中泳動達(dá)到分離膠的 1/3處時,更換為 1/10負(fù)極緩沖液,然后固定、染色與脫色。
P24基因經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增后,產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測,結(jié)果在500?750 bp之間發(fā)現(xiàn)唯一一條清晰、大小約為600 bp DNA條帶(圖1A),與P24基因理論值大小相符。連接到T載體上后送上海生工測序,結(jié)果顯示該序列與GenBank中基因Ⅳ型HEV基因序列 (GenBank Accession No. AB161717.1) 完全一致。然后將P24基因亞克隆到pTO-T7表達(dá)質(zhì)粒中,重組質(zhì)粒 pTO-T7-P24經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切和電泳檢測后,結(jié)果在 600 bp位置處觀察到 DNA條帶,說明P24基因已經(jīng)成功克隆到表達(dá)載體上 (圖 1B)。
將誘導(dǎo)好的重組rP24菌株和僅轉(zhuǎn)化空母體質(zhì)粒的對照組菌株制備蛋白樣品并進(jìn)行SDS-PAGE檢測,結(jié)果在rP24重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)的試驗(yàn)組中可以觀察到一條相對較粗的蛋白條帶,其相對分子質(zhì)量大小約為25 kDa,與基因Ⅳ型HEV rP24的理論分子量23.25 kDa基本一致,這種分子量大小的差異可能是重組蛋白構(gòu)象與天然蛋白不一致造成的。而在對照組中沒有出現(xiàn)這一分子量大小的蛋白條帶 (圖 2A),說明rP24在重組菌株中可能獲得了高效表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示,表達(dá)的重組蛋白與鼠源抗HEV ORF2蛋白單克隆抗體15B2發(fā)生特異性反應(yīng) (圖2B),進(jìn)一步說明P24基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá),而且具有良好的免疫反應(yīng)性。
圖1 HEV IV型p24基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定Fig. 1 Construction and identification of prokaryotic expression plasmid of genotype Ⅳ HEV P24 gene. (A)PCR products of genotype Ⅳ HEV P24 gene. M: DNA marker DL5000; 1: negative control; 2: PCR products of genotype Ⅳ HEV P24 gene. (B) Restriction map recombinant plasmid by enzyme digestion. M: DNA marker DL5000; 1: recombinant plasmid pTO-T7-P24 digested by NdeanⅠd EcoRⅠ.
圖2 HEV IV型p24基因在大腸桿菌中的表達(dá)鑒定Fig. 2 Identification of recombinant genotype ⅣHEV rP24 protein expressed in E. coli. (A) SDS-PAGE analysis of recombinant genotype Ⅳ HEV P24 protein expressed in E. coli. M: protein marker; 1: total protein expression profile of E. coli tranfected pTO-T7 with IPTG induction; 2–3: total protein expression profile of E. coli tranfected pTO-T7-P24 with IPTG induction. (B)Western blotting analysis of genotype Ⅳ HEV rP24 expressed in E. coli with 15B2. M: protein marker; 1:immunoblotting profile with 15B2 of total protein expression of E. coli tranfected pTO-T7 with IPTG induction; 2–3: immunoblotting profile with 15B2 of total protein expression of E. coli tranfected pTO-T7-P24 with IPTG induction.
超聲破碎細(xì)胞后,取100 μL細(xì)胞懸液4 ℃、12 000×g離心10 min,分別收集上清和沉淀,制備蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE,結(jié)果顯示,重組目的蛋白主要分布在沉淀,說明目的蛋白的表達(dá)是以包涵體的形式存在 (圖 3A)。經(jīng)過Bandscan軟件分析rP24在沉淀中占到總蛋白的96%。通過用緩沖液Ⅰ (20 mmol/L Tris·HCl,5 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, pH 7.4) 和TritonX-100緩沖液Ⅰ洗滌,去除部分雜蛋白。洗滌后的包涵體蛋白在2 mol/L、4 mol/L、8 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中均能溶解,但是rP24在2 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中溶解度較小,在4 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中溶解量很大,且rP24能形成同源二聚體,4 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中不能溶解的部分在8 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中可以溶解 (圖3B),而且經(jīng)過包涵體洗滌后,去除了相當(dāng)部分雜蛋白,目的蛋白獲得了有效的純化。Western blotting結(jié)果說明不論是單體還是二聚體都能與單克隆抗體 15B2有很強(qiáng)的反應(yīng),進(jìn)一步說明rP24具有良好的免疫反應(yīng)性 (圖3C)。本研究表達(dá)的蛋白分子量約為25 kDa,二聚體蛋白的分子量約為40 kDa,小于正常天然蛋白二聚體分子量 46.5 kDa。這可能既有重組蛋白構(gòu)型問題而導(dǎo)致相對分子量的偏差,也可能還存在通過蛋白質(zhì)的疏水作用,使蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)變得更加緊密,導(dǎo)致相同電泳條件下泳動速度加快,從而使二聚體的相對分子量變小。
將4 mol/L尿素/bufferⅠ溶解的rP24于4 ℃的PBS中透析復(fù)性,然后將復(fù)性樣品進(jìn)行SDSPAGE。結(jié)果顯示 rP24復(fù)性后以單體和二聚體的形式存在,目的蛋白復(fù)性后,單體的量變小,二聚體的量增大。目的蛋白與抗HEV ORF2蛋白鼠源單克隆抗體8C11的Western blotting結(jié)果顯示,復(fù)性后的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性(圖4A, B)。將一抗改用HEV陽性血清進(jìn)行免疫印跡檢測,結(jié)果顯示聚體與血清能發(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng),單體與血清的反應(yīng)能力相對弱一些,而且復(fù)性蛋白樣品在95–113 kDa之間有明顯免疫印跡反應(yīng)條帶,說明rP24具有形成寡聚體蛋白的能力 (圖4C, D)。而復(fù)性樣品在SDS存在條件下煮沸處理后,蛋白質(zhì)的構(gòu)想發(fā)生改變,不能形成二聚體,蛋白只能以單體蛋白條帶存在。
圖3 重組IV HEV rP24蛋白包涵體純化Fig. 3 Purification of recombinant genotype Ⅳ HEV rP24 inclusion body protein. (A) SDS-PAGE analysis the expression forms of P24 protein. M: protein marker; 1: total protein expression profile of cell lysis solution with IPTG induction; 2: precipitation of cell lysis solution with IPTG induction; 3: supernatant of cell lysis solution with IPTG induction. (B) SDS-PAGE analysis dissolubility of rP24 resolved in different concentration of urea. M: protein marker; 1–3: rP24 protein dissolved in 2 mol/L, 4 mol/L, 8 mol/L urea/BufferⅠrespectively. (C) immunoblotting profile of rP24 protein with 15B2 of dissolved in 2 mol/L, 4 mol/L, 8 mol/L urea/BufferⅠrespectively. M: protein marker; 1–3: rP24 protein dissolved in 2 mol/L, 4 mol/L, 8 mol/L urea/BufferⅠrespectively.
圖4 重組P24蛋白免疫反應(yīng)活性分析Fig. 4 Immunoreacivity analysis of renatured recombinant rP24. (A) and (C) SDS-PAGE analysis of renatured rP24.M: protein marker; 1: renatured recombinant rP24 (boiled); 2: renatured rP24 (no boiled). (B) Immunoblotting profile of rP24 to 8C11. (D) Immunoblotting profile of rP24 to HEV positive serum. M: protein marker; 1: renatured rP24(boiled); 2: renatured rP24 (no boiled).
這些結(jié)果說明rP24可以通過透析復(fù)性,蛋白復(fù)性后可以以單體、二聚體和多聚體的形式存在,其中二聚體結(jié)合最為緊密,即使在 SDS存在的不沸水浴條件下仍不被完全破壞。分析aa序列一級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),p24 aa中不含有半胱氨酸,不可能形成二硫鍵,也沒有形成強(qiáng)離子鍵的 aa基礎(chǔ);再通過 DNASTAR軟件包中的Protean程序提供的Kyte-doolittle算法分析,p24 aa199-210為疏水性最強(qiáng)的區(qū)域,由于p24為病毒的衣殼蛋白,該疏水區(qū)域發(fā)生的疏水相互作用可能在形成同源二聚體作用中發(fā)揮了重要作用。
通過生物信息學(xué)軟件分析,rP24一級結(jié)構(gòu)等電點(diǎn)為 5.23,適合使用陰離子交換層析進(jìn)行純化,因此采用DEAE-5PW陰離子交換層析柱進(jìn)行蛋白的純化,在rP24的離子交換層析圖譜上可以發(fā)現(xiàn)一個極小穿透峰、一個主峰,另外在層析圖譜的主峰前有2個小峰。主峰的出峰時間為24 min左右,占總面積的73.75% (圖5A),主峰前的小峰可能是不成熟的蛋白多聚體,由于不能形成正確的空間構(gòu)象,其表面所帶電荷與成熟的蛋白聚體表面所帶電荷不一樣,所以洗脫的出峰時間也不一樣。目的蛋白經(jīng)過離子交換層析純化后,蛋白聚體的均一性得到了有效的提高。
分子篩層析不僅能分離純化目的蛋白,而且還可以起到脫鹽的作用。將離子交換層析純化的蛋白上樣于分子篩層析柱 (TSK-GEL G 3 000 SW),洗脫流速為0.5 mL/min,從rP24的凝膠層析圖譜中可以看到一個大峰和一個小峰,大峰的出峰時間為 7 min左右,占總面積的80.63%;小峰的出峰時間為5 min左右,小峰面積占總面積的12.93% (圖5B),其中的小峰可能是復(fù)性后形成的寡聚體蛋白 (圖4C,泳道2),其帶電性質(zhì)和二聚體相同,因而在離子交換層析中和二聚體同時被洗脫,但是在凝膠分子篩層析中,由于分子量較大而先被洗脫,收集小峰蛋白進(jìn)行Native-PAGE (圖5C),結(jié)果發(fā)現(xiàn),大峰蛋白的分子量介于45 kDa和98 kDa之間,為了進(jìn)一步鑒定Native blue PAGE上rP24多聚體,同時也為驗(yàn)證收集小峰蛋白為大于45 kDa的rP24多聚體,將收集的第1個峰 (保留時間為5 min) 和第2個峰 (保留時間為7.5 min) 的蛋白分別收集,經(jīng)過冷凍干燥后,兩個峰的蛋白質(zhì)進(jìn)行 SDS-PAGE,結(jié)果表明,第 1個峰和第 2個峰的蛋白在沸水浴和非沸水浴處理后,均可以形成二聚體蛋白,電泳結(jié)果通過Bandscan軟件分析顯示:純化后rP24的純度超過99%,在SDS電泳緩沖液中,單體蛋白的含量極少,主要以二聚體的形式存在 (圖6)。
純化后的rP24樣品經(jīng)過過濾后,用動態(tài)光散射儀測量水化分子動力學(xué)半徑,得到一個質(zhì)量貢獻(xiàn)比 100%的峰,重組 rP24的平均水化半徑為7.48 nm (圖7),相當(dāng)于平均分子量90 kDa,rP24的分散度較小,說明rP24經(jīng)過純化后,蛋白在PBS溶液中形成平均為四聚體的多種聚合狀態(tài),且聚體的均一性很高。
圖5 重組P24蛋白的離子交換、分子篩層析與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig. 5 Profile of ion exchange chromatogram and Molecular sieve chromatogram and native-PAGE of rP24. (A)Profile of ion exchange chromatogram of rP24. (B) Profile of molecular sieve chromatogram of rP24. (C)Native-PAGE of rP24 (M: native protein marker; 1: purified rP24).
圖 6 分子篩層析純化蛋白SDS-PAGEFig. 6 SDS-PAGE analysis of rP24 after purified by molecular sieve chromatography. M: protein marker; 1:rP24 from the first peak (no boiled); 2: rP24 from the first peak (boiled); 3: rP24 from the second peak (no boiled); 4: rP24 from the second peak (boiled).
圖7 純化重組P24分子溶液中水化半徑的檢測Fig. 7 Hydrated radius of purified recombinant p24 protein in solution.
以不同劑量的純化rP24免疫Balb/C小鼠,免疫后的不同時間從小鼠尾靜脈采血檢驗(yàn)血清的陽轉(zhuǎn)數(shù),其結(jié)果如表1所示,5周時,rP24 2 μg以上劑量免疫的小鼠全部陽轉(zhuǎn),0.5 μg免疫有6/8只小鼠陽轉(zhuǎn),小鼠ED50在0.6–1.0 μg之間。同時從該表中還可以看出,小鼠的免疫劑量與免疫產(chǎn)生的抗體持久性呈正相關(guān),免疫小鼠產(chǎn)生的抗體滴度也與免疫劑量呈正相關(guān),因此說明表達(dá)的rP24具有良好的免疫原性。
HEV只有一種血清型,不同基因型的HEV抗原都能與 HEV陽性血清反應(yīng)。本研究選用Genelab公司檢測的24份HE陽性血清和21份HE陰性血清,用本研究表達(dá)純化的 rP24作為包被抗原包被ELISA板條后,采用間接ELISA法對24份HE陽性血清和21份HE陰性血清進(jìn)行檢測,采用北京萬泰公司生產(chǎn)的抗 HEV-IgG診斷試劑盒作為對照,每個樣品進(jìn)行雙孔重復(fù)。
將血清進(jìn)行1∶100稀釋,以2倍標(biāo)準(zhǔn)陰性血清平均值作為陽性血清的判斷標(biāo)準(zhǔn) (Cut off值為0.216),用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism分析間接ELISA結(jié)果,結(jié)果表明:rP24對21份陰性血清的檢測結(jié)果為陰性,對 24份陽性血清的檢測結(jié)果為陽性,陽性血清的數(shù)據(jù)和陰性血清的數(shù)據(jù)之間差異極顯著性 (P<0.000 1),雙孔數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異 (P>0.05),該結(jié)果與北京萬泰和Genelab公司檢測的結(jié)果一致,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明重組抗原具有良好的免疫反應(yīng)性和特異性。
表1 rP24免疫Bal b/C后抗體陽轉(zhuǎn)率與持久性分析Table 1 Analysis of serological conversion rate and antibody persistence of Bal b/C mice vaccinated by recombinant rP24
HE是一個全球性的公共衛(wèi)生問題,在發(fā)展中國家是導(dǎo)致病毒性肝炎的最主要原因,而且時常導(dǎo)致食源性和水源性的暴發(fā)流行[12-18]。但病毒感染細(xì)胞的機(jī)制與致病機(jī)制并不清楚。Kapur等[19-21]認(rèn)為HEV進(jìn)入肝細(xì)胞是在與受體蛋白結(jié)合后,由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用完成?;颌裥秃廷蛐虷EV只能感染人,基因Ⅲ型和Ⅳ型HEV能感染人和牲畜。兩類HEV病毒的宿主不一樣,說明可能與細(xì)胞上的受體不同有關(guān),并且感染機(jī)制也可能會有差異,研究感染差異的原因,將對于防控HEV跨種間感染與傳播起到一定的參考作用。
HEV ORF2編碼的病毒衣殼是病毒的最外層,因此也包含了病毒的主要中和表位。利用HEV類病毒顆粒模擬病毒是研究病毒感染機(jī)制差異性的最佳選擇。Li等[22]利用大腸桿菌表達(dá)基因Ⅱ型HEV ORF2 aa 368-606,獲得融合蛋白p239能通過二聚體的相互作用形成一個直徑為23 nm的類病毒顆粒。p239蛋白中具有多個中和表位,蛋白顆粒能很好的模擬HEV的空間結(jié)構(gòu)[22-23]。何水珍等[24-25]利用Ⅱ型 HEV P239蛋白吸附 HepG2 細(xì)胞的模型來模擬HEV對宿主細(xì)胞的吸附,初步確定了p239與細(xì)胞相互作用的區(qū)域位于ORF2上的aa 423–443,該段多肽可能和病毒上的細(xì)胞膜受體結(jié)合部位非??拷蛘咧苯訁⑴c構(gòu)成了病毒與細(xì)胞特異性識別的表位。Guu等[21]和 Li等[26]表達(dá)非Ⅳ型HEV類病毒顆粒 (aa 118-608),可分為3個線性區(qū)域。這3個區(qū)域都含有潛在的多聚糖的結(jié)合位點(diǎn),可能與細(xì)胞受體結(jié)合有關(guān)。
但是目前還沒有確定找到人肝細(xì)胞HEV受體,H類和Z類HEV感染人和動物的差異的分子機(jī)制仍待人們?nèi)パ芯亢吞接憽S捎谀壳斑€缺乏成熟的HEV細(xì)胞培養(yǎng)模型與動物模型,不可能獲得大量的具有感染性的HEV,為了研究H類和Z類HEV病毒感染宿主差異的分子機(jī)制。我國流行的HEV主要為基因Ⅰ型和基因Ⅳ型,為結(jié)合HEV在我國的流行狀況,基因Ⅰ型和基因Ⅳ型HEV跨種間感染的機(jī)制,研究本研究擬在表達(dá)重組基因I型HEVORF2蛋白的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步表達(dá)Ⅳ型HEV ORF2蛋白,為研究這兩類病毒的跨種間感染機(jī)制打下基礎(chǔ)。
本研究利用基因工程技術(shù)表達(dá)了基因Ⅳ型HEV衣殼蛋白rP24 (aa 384–606),包含了與細(xì)胞相互作用的蛋白區(qū)域。重組蛋白通過 TSK-G 3 000 SW分子篩層析柱和DEAE陰離子交換層析柱純化以后,蛋白的純度可達(dá) 99%以上,SDS-PAGE結(jié)果顯示純化后的蛋白在SDS緩沖液中基本上以二聚體形式存在。rP24蛋白與戊型肝炎陽性血清及中和單克隆抗體8C11的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明重組rP24蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性,能以單體、二聚體和多聚體的形式存在,說明rP24模擬了HEV的中和表位。雖然利用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察不到 rP24形成類病毒顆粒,但利用動態(tài)光散色實(shí)驗(yàn)測得蛋白聚體的平均水化半徑約為7.48 nm,聚體的均一性良好。同時動物免疫實(shí)驗(yàn)證明,rP24具有良好的免疫原性,免疫小鼠的ED50為0.6?1.0 μg。因此以上實(shí)驗(yàn)表明,rP24在PBS溶液能形成蛋白多聚體,多聚體具有一定的空間構(gòu)象,并且還包含了HEV衣殼蛋白的中和表位,因此該重組蛋白作為研究人和動物受體的主要材料,適合進(jìn)一步研究基因Ⅰ型和基因Ⅳ型HEV感染機(jī)制的差異性,從而為預(yù)防HEV跨種間傳播的研究提供一定的參考作用。下一步我們將以此為材料進(jìn)一步研究HEV基因Ⅰ型和基因Ⅳ型HEV跨種間感染細(xì)胞差異的機(jī)制。同時,rP24也可以作為HEV血清診斷試劑的潛在關(guān)鍵原料,具有一定的應(yīng)用價值。
致謝:此文部分工作由湖南省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科和生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心資助。
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