釀酒酵母乙酸耐性分子機制的功能基因組進展

趙心清，張明明，徐桂紅，許建韌，白鳳武

大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024

釀酒酵母廣泛應用于食品、釀造及生物能源生產(chǎn)等不同領域，良好的細胞活性有利于增加生物量的積累，促進細胞循環(huán)使用，提高發(fā)酵效率，但釀酒酵母在生長和發(fā)酵過程中，尤其是在工業(yè)生產(chǎn)條件下，經(jīng)常受到高濃度乙醇、極端溫度 (冷凍或高溫等)、低pH及高滲透壓等環(huán)境脅迫因素的影響，這些環(huán)境脅迫條件抑制細胞生長及代謝，從而影響了生產(chǎn)效率。因此，釀酒酵母細胞對環(huán)境脅迫因素的反應和耐受性機制一直是國內外學者研究的重點[1-5]。

燃料乙醇是目前廣泛生產(chǎn)使用的可再生清潔能源，以來源豐富、價格低廉的纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇已成為國內外研究的熱點，但目前限制燃料乙醇大規(guī)模生產(chǎn)的關鍵問題是成本過高。在纖維素乙醇生產(chǎn)中，原料預處理過程中產(chǎn)生的弱酸類﹑醛類和酚類等抑制物對細胞的生長和發(fā)酵具有抑制作用，這些抑制物中，弱酸類化合物中的乙酸含量最高。乙酸由木質纖維素預處理過程中木糖脫乙酰作用生成，在纖維素原料水解液中的濃度受所使用的生物質種類及預處理技術的影響而不同，但濃度大約在1–10 g/L[6]。釀酒酵母不同菌株對乙酸的耐受性不同，如當乙酸濃度大于2 g/L時，木糖共發(fā)酵重組酵母6508-127的木糖利用率和生物量積累受到明顯影響，乙酸濃度為10 g/L時，酵母細胞停止利用木糖和生長，而絮凝酵母SPSC01可在15 g/L乙酸中生長和發(fā)酵[5,7]。作為纖維素原料水解液中主要的毒性副產(chǎn)物，乙酸對酵母細胞的生長和乙醇發(fā)酵具有強抑制作用，但長期以來對乙酸如何產(chǎn)生毒性，酵母細胞如何響應乙酸脅迫，以及如何調整代謝抵抗乙酸的毒性了解得還不夠深入。與纖維素水解液中的其他抑制物相比，乙酸對細胞全局基因轉錄的影響要大很多，如當細胞在分別含有乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等抑制物質的培養(yǎng)基中生長的時候，轉錄組分析結果表明[8]，有150個基因在乙酸影響下表達出現(xiàn)顯著變化，其中 120個是特異響應乙酸的，含有72個上調基因，而在含有糠醛和羥甲基糠醛的培養(yǎng)基中，分別只有27個和31個基因的表達出現(xiàn)明顯變化。因此，乙酸耐性分子機制的功能基因組研究引起了普遍關注。

近年來，國內外學者對在毒性水平的乙酸作用條件下釀酒酵母細胞的適應性反應及耐受性的分子機理進行了深入研究，利用細胞全局轉錄分析、蛋白組學分析及單基因敲除突變體文庫表型組等手段，發(fā)現(xiàn)了很多新的與酵母菌乙酸耐性相關的基因，本文著重介紹近年來酵母菌乙酸耐性的功能基因組研究進展。

1 乙酸毒性的分子機制

胞內環(huán)境酸化是乙酸抑制細胞生長的主要原因。當培養(yǎng)基的 pH值低于乙酸的解離常數(shù)(pKa 4.76) 時，分子態(tài)的乙酸可通過自由擴散或水甘油通道蛋白Fps1p以及轉運蛋白Ady2p和Jen1p轉運入細胞內[9-11]，從而導致胞內酸化，因此乙酸毒性與細胞生長的環(huán)境pH有關。研究在pH值分別為 5、5.5和6時不同濃度的乙酸對酵母葡萄糖和木糖共發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增加，乙酸對葡萄糖和木糖利用的抑制得到明顯的緩解；如在15 g/L乙酸條件下，pH為5時，60 g/L葡萄糖需要60 h才被消耗完，而在 pH為6時只需12 h完成發(fā)酵[12]，因此調節(jié)pH值可以緩解乙酸對酵母的毒害作用。但是酵母生長和發(fā)酵的最適pH值偏酸性，而且當培養(yǎng)基中存在高濃度乙酸時不可能通過加入大量的堿來調節(jié)其pH值，提高發(fā)酵菌株的乙酸耐受性，可保證酵母細胞在乙酸濃度較高的條件下具有較好的細胞活性。

利用約5 000多個BY4741宿主背景的釀酒酵母菌單基因敲除突變體文庫研究與乙酸耐性相關的基因，發(fā)現(xiàn)有 650個基因與乙酸響應相關[13]。酵母細胞對乙酸的響應及乙酸的毒性機制見圖 1，包括與乙酸轉運、胞內酸化后胞內pH維持、細胞壁重構、轉錄因子對細胞代謝的全局調控、氧化脅迫反應以及金屬離子對乙酸耐性的作用等[11,13-18]。本文將分別就這些過程相關的功能基因組研究進行綜述。

1.1 細胞壁相關蛋白與乙酸耐性

利用釀酒酵母 BY4741宿主來源的單基因敲除的突變體，通過考察其在含乙酸平板上的生長情況，鑒別了多個與細胞壁功能相關的基因[13]，其功能可能與乙酸脅迫條件下細胞的生長有關，這些基因的功能包括合成細胞壁組分的基因，如MNN2、MNN9、FKS1、ROT2，與細胞壁合成調控作用相關的基因，如ROM2，以及功能未知但敲除后影響出芽的基因，如BEM4等。細胞壁葡聚糖酶基因EGT2和SCW11分別與分裂后的細胞分離和有性生殖中細胞結合有關，其敲除后乙酸和乳酸的耐性均得到提高[18]，此外，細胞壁功能相關的基因SED1和SPI1都編碼與脅迫反應相關的細胞壁蛋白，SPI1的敲除可導致細胞在乙酸中的生長受到抑制[19]，并發(fā)現(xiàn)該基因受轉錄因子Haa1p和Msn2p的調控[20]，但SED1敲除后，只提高了乳酸的耐受性，說明不同有機酸對細胞的毒性和細胞的反應存在一定差異。推測乙酸脅迫條件下細胞壁出現(xiàn)重構，因此與細胞壁合成相關的基因及一些細胞壁結構蛋白的合成發(fā)生變化。細胞壁的合成能減少多孔的結構，因此通過細胞壁的重構 (Cell wall remodeling) 阻止乙酸通過擴散進入細胞，從而減少乙酸的毒性。

1.2 膜蛋白及膜磷脂合成相關基因與乙酸耐性

細胞膜蛋白中與乙酸耐性相關的包括乙酸轉運相關的蛋白 (如Fps1p)，以及功能與質子轉運偶聯(lián)的其他膜轉運蛋白。釀酒酵母通過膜質ATP酶維持胞內pH的穩(wěn)定，也通過細胞壁和細胞膜的重構 (Membrane reconfiguration) 降低對分子態(tài)乙酸的吸收和防止乙酸對膜的損傷。為維持質膜電位、防止胞內酸化，細胞膜上的腺苷三磷酸酶 H+-ATPase (PMA1基因編碼) 可水解ATP產(chǎn)生能量，將質子泵出細胞來維持細胞內正常的中性環(huán)境。因此在弱酸存在時，必須有足夠的能量供細胞利用，但是在高濃度乙酸存在時，ATP消耗過多導致缺乏，細胞內的質子不能完全被泵出，從而引起胞內酸化，抑制細胞生長和代謝[16]。

圖1 釀酒酵母中乙酸脅迫的反應機制Fig. 1 Mechanisms of acetic acid stress response in S. cerevisiae cells.

細胞對乙酸毒性的很重要的反應是阻止乙酸進入細胞。細胞可通過瞬時激活Hog1p蛋白激酶，將質膜水甘油通道蛋白 Fps1p磷酸化并發(fā)生內吞，因此減少乙酸通過這個孔蛋白的擴散進入[21]。敲除 Fps1p編碼基因可提高釀酒酵母乙酸耐性，并提高乙醇產(chǎn)率[22]。

日本學者對一株耐乙酸的釀酒酵母菌ATCC 38555進行全基因組轉錄分析發(fā)現(xiàn)，與不耐受乙酸的菌株相比，乙酸沖擊條件下 ATCC 38555菌株的TOP2轉錄上調更明顯，是對照菌提高倍數(shù)的 3倍，提示該膜轉運蛋白可能與乙酸耐性有關。TOP2編碼多胺轉運蛋白，其對物質的轉運與質子的轉運偶聯(lián)，已有報道表明，TOP2敲除后菌株的乙酸耐性下降，而該蛋白是與乙酸適應相關的重要調節(jié)蛋白 Haa1p的下游調控蛋白，但該蛋白在乙酸耐性中的具體作用還不清楚[23]。

由于細胞膜的成分在細胞脅迫反應中具有重要作用，而細胞膜中磷脂的組成和比例對膜的特性具有重要影響[24]。研究者對乙酸、糠醛和酚類物質聯(lián)合處理條件下細胞膜磷脂的成分和相關基因轉錄進行了研究，發(fā)現(xiàn)對混合抑制物具有良好耐受性的 T菌株具有較長的磷脂脂肪酸鏈，親本菌株耐性不好的 P菌株中多個編碼脂肪酸延長酶和脂肪酸合成酶的基因，包括FEN1、SUR4、FAS1和FAS2在混合抑制物中生長后表達出現(xiàn)下調，但在耐性好的 T菌株中除了FEN1基因外沒有明顯下調，而且FEN1在T菌株中的下調也不如P菌株明顯。此外，T菌株同時具有較低的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS) 含量和較慢的PS向磷酯酰乙醇胺 (Phosphatidylethanolamine, PE) 轉化的效率，作者發(fā)現(xiàn)編碼PS合成酶的CHO1基因在耐性較好的菌株中受抑制物沖擊后表達下調，而親本菌株耐性不好的P菌株CHO1基因在受抑制物沖擊后表達上調。磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine, PC) 由 PE經(jīng)過甲基化后合成，在該研究中還發(fā)現(xiàn)，耐性好的 T突變株具有較低的 PE/PC的比例，與此相應的，T菌株具有較高的CHO2基因轉錄水平，該基因編碼一個關鍵的PE甲基化酶[25]。

1.3 能量代謝相關基因與乙酸耐性

細胞的能量主要來自糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，由于膜質ATP酶和液泡ATP酶泵出質子抵抗胞內酸化需要消耗能量，所以能量代謝與乙酸耐性密切相關。利用單基因敲除的突變體文庫進行乙酸耐性相關基因的篩選發(fā)現(xiàn)，敲除HXK2、PFK1、LPD1、PYC1、ATP1和COX9等和能量代謝相關的基因后，細胞在含有4.2–5.4 g/L乙酸的平板上生長受到嚴重抑制甚至無法生長[13]。日本學者對耐乙酸的釀酒酵母菌ATCC 38555在6 g/L乙酸處理30 min后的全局基因轉錄進行分析結果表明，與能量代謝相關的很多基因，包括ATP15、ATP17、ATP18、COX7、COX9、COX12和COX13等表達明顯上調，而乙酸耐性不強的酵母菌在同樣的乙酸沖擊條件下未發(fā)現(xiàn)這些基因表達的明顯變化，顯示了耐性菌快速調節(jié)能量代謝相關基因是其對乙酸的耐性提高的一個原因[23]。

我國天津大學學者對工業(yè)酵母在含 18 g/L乙酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 min后轉錄組分析的結果中，揭示了高濃度乙酸沖擊條件下，與呼吸作用相關的細胞色素C氧化還原酶基因COR1、COX11、PET309、COX20和CBP4表達明顯下調，同時，線粒體 ATP酶基因ATP4和與能量產(chǎn)生有關的線粒體無機焦磷酸酶基因PPA2的表達也受到明顯抑制，另外，負責糖原代謝和海藻糖代謝的基因表達也出現(xiàn)下調，表明高濃度乙酸沖擊對能量儲存、電子傳遞、以及 ATP再生具有一定影響。作者還發(fā)現(xiàn)很多線粒體核糖體蛋白編碼基因的轉錄出現(xiàn)明顯下調，表明高濃度乙酸對線粒體的功能具有重要影響作用[26]。對乙酸糠醛等脅迫抑制化合物具有良好耐性的菌株及親本菌株在乙酸糠醛酚類同時存在條件下進行比較蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑關鍵酶Eno1p、Fba1p和Adh1p等在耐性菌株和敏感菌株中均上調，但在敏感菌中上調更明顯，說明敏感菌需產(chǎn)生更多的能量抵抗抑制劑的毒害作用[27]。

1.4 氨基酸合成及蛋白代謝與乙酸耐性

氨基酸代謝對細胞的生長和正常代謝至關重要。細胞在乙酸毒性作用下氨基酸的合成可能受到抑制，蛋白折疊和蛋白降解也受到影響，因此氨基酸合成和蛋白代謝基因的功能與乙酸耐性相關。對酵母菌單基因敲除突變體在乙酸平板上的生長比較結果表明，參與甲硫氨酸和半胱氨酸合成的基因MET4和CYS3，參與組氨酸合成的HIS4，參與甘氨酸合成相關的GLY1和谷氨酰胺合成的GDH1基因破壞后，細胞在乙酸平板上的生長受到影響[13]。前期研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度乙酸沖擊可引起細胞內精氨酸、組氨酸和色氨酸合成基因的上調[26]，說明氨基酸合成與乙酸毒性的反應密切相關。進一步的研究表明，氨基酸代謝的變化不僅僅與氨基酸合成蛋白有關，也與蛋白降解有關[27]。在添加含有乙酸的混合抑制劑的處理后，與蛋白折疊和蛋白降解相關的很多蛋白表達均出現(xiàn)上調，其中變化較明顯的包括Hsp60p、Dka1p和20S蛋白酶體Pre8p以及Pre1p等，因此作者推測，在乙酸等抑制物的存在條件下，細胞產(chǎn)生氧化脅迫，因此造成蛋白變性，而蛋白折疊和降解相關的蛋白表達，有助于細胞恢復正常的生理代謝功能。

1.5 與乙酸耐性相關的金屬代謝

許多金屬離子是細胞中多種酶的輔酶，其吸收和在細胞內的移動影響細胞代謝。利用酵母菌單基因敲除突變體研究乙酸耐性相關基因時發(fā)現(xiàn)[13]，個別金屬離子代謝相關基因與乙酸耐性有關。與鉀離子吸收相關的基因有TRK1和ARL1，前者是鉀離子轉運蛋白，后者作為GTPase調控鉀離子的內流。TRK1敲除后的菌株在4.2 g/L乙酸平板上完全不能生長，而ARL1敲除后細胞可有微弱生長。培養(yǎng)基中添加0.01 mol/L和0.02 mol/L的氯化鉀可明顯緩解2.4 g/L乙酸對細胞的毒性。添加鉀離子能提高酵母的乙酸耐受性，主要原因是在乙酸脅迫條件下，膜質ATP酶Pma1p泵出質子以維持胞內pH穩(wěn)定性，而鉀離子是主要回流的離子，因此乙酸脅迫條件下鉀離子的吸收有助于質膜的電位平衡。與鐵吸收相關基因FRE3、FIT2和FIT3敲除后，細胞在乙酸平板上的生長也受到抑制，但不如ARL1破壞后生長抑制程度明顯，培養(yǎng)基中添加1–100 μmol/L FeSO4也沒有看到對乙酸毒性的緩解作用，但發(fā)現(xiàn)細胞在4.2 g/L乙酸中培養(yǎng)30 min后，胞內鐵的含量比沒有經(jīng)過乙酸脅迫處理的細胞提高了 2倍，說明乙酸可促進鐵的吸收。由于鐵可誘導氧化脅迫，因此細胞對鐵的獲得、代謝及氧化脅迫相關基因和蛋白的調控比較嚴格，這解釋了為什么添加鐵對細胞的乙酸耐性沒有影響。本課題組近期研究表明，培養(yǎng)基中添加硫酸鋅可明顯改善細胞在高濃度乙酸(10–15 g/L) 條件下的乙醇發(fā)酵[7]。對高濃度乙酸存在條件下鋅對細胞全局基因轉錄的影響進行研究，初步結果發(fā)現(xiàn)，與金屬轉運相關的多個基因在鋅添加樣品中出現(xiàn)明顯下調，這些基因除了編碼鋅轉運相關的蛋白(包括 Zrt1p、Zrt2p和Yke4p)以外，還包括銅轉運(Ctr3p高親和質膜銅轉運蛋白)、鉀轉運(Kha1p，高爾基體K+/H+抗轉運蛋白)以及鐵轉運(Mmt2p，負責線粒體鐵積累的未知金屬轉運蛋白)相關的蛋白等。這些金屬代謝相關蛋白基因轉錄的變化與乙酸耐性的關系正在研究中。

1.6 與乙酸耐性相關的轉錄調控因子

通過乙酸耐受性相關的基因聚類分析，與之相關的轉錄因子包括 Msn2p、Rim101p、Haa1p、Skn7p、War1、Pdr1、Stb5p、Nrg1p、Cbf1p、Gcr2p、Mig1p、Swi6p、Ume6p、Stp1p、Ace2p、Ino2p、Cst6p和 Rtg3p等[13]，其中 Haa1p是最主要的調節(jié)蛋白，負責調控 80%與乙酸耐性相關的基因[28-29]。對S. cerevisiaeBY4741親本以及HAA1△突變體在含3 g/L乙酸、pH值為4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h，發(fā)現(xiàn)破壞子的延滯期比野生型延長了2.5倍，而且在此時期破壞子中活細胞數(shù)目相對野生型減少，而同樣條件下不含酸的培養(yǎng)基中沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因此提出HAA1基因的表達可以縮短酵母在乙酸脅迫條件下生長的延滯期[13]。

在 Haa1p調控的靶基因很多，但很多基因的具體功能還不清楚。這些靶基因中，SAP30和HRK1表現(xiàn)出最強烈的對乙酸毒害的保護作用。SAP30編碼脫乙酰酶復合體的一個亞基，HRK1編碼調節(jié)質膜轉錄活性的蛋白家族中的一個蛋白激酶。敲除HRK1基因的酵母菌體內的乙酸的積累明顯增加，提示這兩個基因的作用很可能與降低胞內乙酸的含量有關[29]。Haa1p調節(jié)的基因還包括上文提到的編碼細胞質膜上轉運蛋白Tpo2p和Tpo3p。過表達HAA1可提高釀酒酵母的乙酸耐性，并發(fā)現(xiàn)轉化子中TPO2和TPO3等Haa1p的靶基因上調[30]。

Haa1p轉錄因子直接調控許多能夠響應乙酸脅迫的基因表達。對這些可能的調控基因的啟動子區(qū)域的 DNA結合基序 (Binding motif)的研究表明，Haa1p的最小結合基序是5'-(G/C)(A/C)GG(G/C)G-3'。已發(fā)現(xiàn)有56個基因的表達受 Haa1p的直接調控，這些基因包括編碼熱激蛋白 Hsp30p和 Hsp26p，轉運蛋白Pdr12p、Tpo2p和 Tpo3p以及轉錄調節(jié)蛋白Nrg1p、Msn4p、Mcm1p和Fkh2p等，所涉及的代謝過程包括細胞脅迫反應、糖代謝、細胞周期控制、蛋白合成以及降解等。此外，Haa1p還可通過對Msn4p和Mcm1p等轉錄因子的調控間接地調控近30個基因的表達，形成了復雜的代謝調控網(wǎng)絡。進一步的研究表明，與 Haa1p親和力最高的結合基序是5'-GAGGGG-3'，含有這個基序的基因包括TPO3、TPO2、STF2和AQR1等，但雖然具有這個基序的基因TPO2在乙酸脅迫下提高18.7倍，但是同樣含有這個基序的AQR1只提高1.5倍，可見HAA1激活基因的表達還需要其他因子的參與。已發(fā)現(xiàn)無論培養(yǎng)基是否有乙酸存在，Haa1p都能與其下游調控基因TPO3結合，推測 Haa1p在無乙酸脅迫的條件下不具有功能，可能在乙酸脅迫條件下才具有轉錄激活功能[18]。

Msn2p和Msn4p是同一個家族的鋅指蛋白，和酵母的多種耐性響應相關，如營養(yǎng)缺乏、高溫、高滲透壓、氧化脅迫等[31]。受 Msn2p和Msn4p調控的響應乙酸的基因包括編碼分子伴侶蛋白Hsp26p和Sse2p的基因，與碳代謝相關的基因HXK1和GPD1和抗氧化相關的基因CTT1和GPX1等[32]，MSN2基因敲除后細胞在乙酸上的生長受到抑制，但MSN4敲除對細胞在乙酸上的生長影響不大，可能與Msn4p的作用比較溫和有關[13]。本課題組對高濃度乙酸存在條件下鋅添加對酵母菌全局基因轉錄影響的研究中，發(fā)現(xiàn)與未添加鋅的對照組相比，鋅添加可明顯提高MSN2的轉錄水平 (未發(fā)表資料)，提示鋅對高濃度乙酸脅迫條件下細胞活性的保護作用可能與MSN2的作用有關，但深入的分子機理還有待探討。

Rim101p是C2H2(Cys2His2) 型鋅指蛋白，已知有35個基因受其調控，這些靶點基因的功能與細胞壁結構的維持和鐵的吸收有關，也有一些是功能未知的膜蛋白。敲除RIM101后細胞在乙酸中的生長受到抑制，顯示該基因與細胞對乙酸毒性的反應和耐性有關[33]。

Nrg1p和Nrg2p是葡萄糖抑制作用的調節(jié)因子，近來報道它們也參與酵母菌的脅迫耐性響應基因的調控。當NRG1和NRG2兩個基因都被敲除，菌體對高滲和氧化脅迫的抗性增強。Nrg所抑制的基因大都含有 STREs或者類似STRE的序列，而且還與MSN2和MSN4相關。推測NRG1/NRG2與MSN2/MSN4存在競爭關系，從而避免過度響應環(huán)境脅迫[34]。

值得指出的是，每個轉錄因子對靶基因的調控并不是相互獨立的，不同轉錄因子可能具有共同的下游基因。利用YEASTRACT數(shù)據(jù)庫(http：//www.yeastract.com)，將本文討論的乙酸耐性相關基因中與能量代謝、氨基酸代謝的基因，以及與細胞壁合成相關基因和轉運蛋白相關基因進行分析，得到的這些基因與 Msn2p、Nrg1p和Haa1p之間的相互關聯(lián)見圖2。

圖 2 乙酸脅迫時轉錄調控因子 Msn2p、Nrg1p和Haa1p之間的關聯(lián)Fig. 2 Transcriptional regulatory associations of Msn2p, Nrg1p and Haa1p in yeast cells under acetic acid stress. The model is based on the microarray data obtained in this study and on the information available in the YASTRACT database. Arrows indicate activation,lines indicate repression, solid lines mean documented regulation, dashed arrows or lines show potential regulation.

表 1為與乙酸脅迫反應相關的主要相關基因[8,13,20]。除了上文中提到的基因以外，還包括與蛋白修飾相關的基因及與細胞骨架蛋白合成及形態(tài)發(fā)生相關的基因。由于乙酸對細胞的影響主要是延遲期的延長，推測細胞骨架和形態(tài)發(fā)生相關基因破壞后，細胞不能在乙酸上很好生長的原因與突變體細胞生長受到抑制有關。

表1 釀酒酵母乙酸脅迫反應相關的基因Table 1 Genes related to acetic acid stress in S. cerevisiae

2 提高乙酸耐性的代謝工程操作

對釀酒酵母乙酸耐性的功能基因組研究發(fā)現(xiàn)了多個與乙酸耐性相關的基因，并在此基礎上開發(fā)了相應的代謝工程改造方法。例如，過表達與乙酸耐受性密切相關的轉錄因子編碼基因HAA1，所獲得的菌株具有較高的乙酸耐性，在7 g/L乙酸平板上能較好生長，而對照在該乙酸濃度下沒有檢測到生長。這是利用功能基因組研究提高乙酸耐性的典型范例。

代謝物譜 (Metabolic profiling) 分析研究發(fā)現(xiàn)，在乙酸脅迫條件下木糖發(fā)酵的過程中，非氧化性的 PPP代謝途徑代謝物核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸和景天庚酮糖-4-磷酸等明顯積累，表明乙酸明顯的減慢了木糖發(fā)酵速率, 因而通過對在這個過程中起重要作用的基因TAL進行過表達，發(fā)現(xiàn)過表達后菌株在1.8 g/L乙酸條件下的乙醇產(chǎn)量提高了1.72倍，而且有趣的是TAL過表達突變體在0.03 mol/L乙酸條件下比在沒有乙酸條件下乙醇產(chǎn)量提高1.35倍，突變體核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸和景天庚酮糖-4-磷酸的含量都下降[35]。

對兩株發(fā)酵性能相似的菌株YJS329和ZK2在不同抑制物條件下發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)細胞膜結構、中心碳的代謝和抗氧化因子的不同是造成這兩個菌株耐受性差異的主要因素，推測ZK2菌中油酸相關的基因ELO1、FEN1和OLE1的表達量高，所以具有較高的乙酸耐性，因此選擇對ELO1在兩株酵母菌YJS329和ZK2過表達，結果發(fā)現(xiàn)油酸分別提高了 17.6%和 9.4%，此外在高濃度乙酸 (10 g/L, pH 4.0) 沖擊2 h后，過表達ELO1的重組酵母的細胞存活率明顯提高。但同時也發(fā)現(xiàn)，兩株菌過表達ELO1的重組菌細胞活性提高程度有一定的差距，分析是由于YJS329和 ZK2的遺傳背景的不同導致。因此對菌株進行改造時需要考慮宿主遺傳背景的影響[36]。

我國浙江大學學者首次將 RNA結合蛋白Lsm6p編碼基因在木糖共發(fā)酵工業(yè)酵母中過表達，得到的轉化子對硫酸的耐受性提高，而且轉化子具有較高的木糖利用率和發(fā)酵效率。目前對于LSM蛋白在乙酸耐性中的研究還不多，其提高耐性的機理也不清楚[37-38]。

隨著利用單基因敲除突變體文庫獲得的功能基因組學信息的不斷積累，人們希望通過所獲得的信息設計代謝工程改造的方法，提高菌株的發(fā)酵效率。分析BY4741敲除突變體相關結果，研究者找到11個基因與乙醇、乙酸及另外兩種常見的纖維素水解液中的毒性抑制物糠醛及香草醛耐性相關的基因，并利用相應突變體進行超高濃度乙醇發(fā)酵及小麥秸稈水解液發(fā)酵實驗，證明BUD31和HPR1與乙醇收率和發(fā)酵速率有關，ERG1、PRS3、RAV1、PRP4和VMA8與小麥秸稈水解液中細胞活性的保持和利用該底物的發(fā)酵速率有關[39]，但這些基因在工業(yè)酵母中的作用沒有進行研究，也沒有進行這些基因過表達后乙醇發(fā)酵性能的評價。

3 存在問題和展望

提高酵母菌的乙酸耐受性可以保證酵母菌發(fā)酵過程中較好的細胞活性和較高的發(fā)酵性能，隨著基因組學、轉錄組學、代謝組學等手段的發(fā)展，對釀酒酵母乙酸耐受性的機理研究不斷深入，然而目前存在的問題是：

1) 目前的研究多使用轉錄組，研究基因轉錄的變化，但由于存在轉錄后和翻譯后修飾，以及蛋白間相互作用等調節(jié)，酵母菌轉錄組學的變化不一定反映到蛋白水平的變化。

2) 耐受性與乙醇發(fā)酵效率受不同的基因控制，耐性的提高不一定必然帶來發(fā)酵效率的提高[32]，因為耐性相關基因的作用只有在特定脅迫條件下才發(fā)揮作用。

3) 目前對功能基因組的研究更多地關注結構基因的功能，但酵母菌的非編碼RNA，啟動子活性等都對代謝工程改造具有重要影響[40-41]。

未來對釀酒酵母乙酸耐性的研究將深入揭示翻譯后修飾等水平的調節(jié)機制，并進一步開發(fā)非編碼RNA和啟動子等遺傳組件，將其用于利用合成生物學手段構建高效的發(fā)酵菌株，將具有廣闊的應用前景。在制定代謝工程策略的時候，需要結合不同宿主背景和培養(yǎng)條件，考慮不同層次的代謝調控。隨著對釀酒酵母乙酸耐性分子機制研究的深入，更多理性的代謝工程改造將成功用于選育高效的工業(yè)釀酒酵母菌株。此外，乙酸也作為食品防腐劑用于抑制一些導致腐敗的酵母。對這些腐敗相關酵母的乙酸耐性機理具有深入認識，也對食品領域防止食品腐敗具有重要應用意義。

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