結(jié)核分枝桿菌Rv2628蛋白的免疫生物學(xué)特性

殷月蘭，高云飛，趙丹，連凱，陳祥，徐正中，潘志明，焦新安揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌Rv2628蛋白的免疫生物學(xué)特性

殷月蘭*，高云飛*，趙丹，連凱，陳祥，徐正中，潘志明，焦新安
揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

Rv2628蛋白是結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis (M. tb) DosR調(diào)控的潛伏感染相關(guān)抗原。本研究對Rv2628蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)和純化，并以巨噬細(xì)胞系和小鼠為研究模型，對其免疫生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。SDS-PAGE及Western blotting鑒定結(jié)果表明，Rv2628-His融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，能與兔抗H37Rv多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有較好的免疫反應(yīng)性。與巨噬細(xì)胞系RAW264.7的互作實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1–12 h內(nèi)Rv2628蛋白能誘導(dǎo)前炎性因子IL-6的上調(diào)表達(dá)。將純化的Rv2628融合蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，夾心ELISA的測定結(jié)果表明，Rv2628蛋白免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性IFN-γ水平顯著高于IL-4的水平 (P＜0.000 1)，呈現(xiàn)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答趨勢；以Rv262811-30多肽作為包被抗原，通過間接ELISA測定的血清抗體效價(jià)能達(dá)到1∶1 600，表明Rv2628也能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。總之，Rv2628能促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，激發(fā)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答和較好的體液免疫應(yīng)答，具有作為亞單位疫苗的潛力，為M. tb與宿主之間的相互作用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

結(jié)核分枝桿菌，Rv2628，Th1型應(yīng)答，前炎性因子，巨噬細(xì)胞系

結(jié)核病 (Tuberculosis，TB) 是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)引起的一類慢性傳染性疾病[1]，結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的主要病原菌。結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程主要是由M. tb與人體免疫系統(tǒng)之間的相互作用所決定的。當(dāng)M. tb逃避人體的免疫攻擊之后，可在體內(nèi)持續(xù)感染或呈潛伏性感染 (Latent tuberculosis infection, LTBI)，肺部的肉芽腫組織是M. tb的主要藏身之處，但肉芽腫內(nèi)是一個(gè)低氧、缺乏營養(yǎng)、低pH值等不利于M. tb生長的微環(huán)境，M. tb通過調(diào)整代謝活動(dòng)進(jìn)入休眠期，達(dá)到在宿主體內(nèi)長期生存的目的[2-4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，M. tb對氧濃度改變的適應(yīng)主要是由激活體內(nèi)的組分調(diào)控系統(tǒng)，包括兩種感受激酶 (DosT與DosS)以及反應(yīng)調(diào)節(jié)子DosR構(gòu)成的DosS/DosT-DosR調(diào)控復(fù)合物介導(dǎo)的[5-7]，其中DosR調(diào)控系統(tǒng)共調(diào)控50個(gè)基因的表達(dá)，在下調(diào)M. tb的新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。Rv2628是受DosR調(diào)控的潛伏感染相關(guān)抗原，Klein等研究發(fā)現(xiàn)Rv2628能誘導(dǎo)TST+患者產(chǎn)生較強(qiáng)的IFN-γ反應(yīng)[10]。但是目前對其生物學(xué)功能還知之甚少。為此，我們選取了DosR調(diào)控基因Rv2628，進(jìn)行原核表達(dá)和純化，并對其免疫學(xué)特性作了初步分析，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能特性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞系

卡介苗BCG、宿主菌E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21(DE3)-pET-32a(+)以及巨噬細(xì)胞系RAW264.7均由本室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雌性BALB/c小鼠，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.1.3 主要試劑

滅活的結(jié)核分枝桿菌H37Rv及兔抗該菌的多抗血清由中國疾控預(yù)防控制中心的萬康林研究員饋贈(zèng)；Ni-NTA His Bind purification kit購自Novagen公司；用Ni-NTA His Bind purification kit純化的BL21(DE3)-pET-32a(+)空載體蛋白及鼠抗該蛋白的多抗血清由本室制備和保存；去內(nèi)毒素試劑盒購自Norgen公司； Anti-His antibody 購自Roche公司；Purified Rat Anti Mouse IFN-γ、Biotin Rat Anti Mouse IFN-γ、Recombinant Mouse IFN-γ、Purified Rat Anti Mouse IL-4、Biotin Rat Anti Mouse IL-4、Recombinant Mouse IL-4、鏈親和素-HRP均購自BD公司；Bovine PPD 購自PrionicsAG公司；TMB購自eBioscience公司；BCIP/NBT、羊抗鼠IgG-HRP均購自Sigma公司；PVDF底96孔ELISPOT板購自Millipore公司；PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa公司；雙十八烷基二甲基溴化銨 (DDA)、單磷脂酸A (MPL-A) 購自Avanti公司；Rv262811-30多肽由北京中科亞光生物科技有限公司合成；其余常規(guī)試劑均購自滬通國藥試劑公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

Biophotometer分光光度儀購自德國Eppendorf公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、流式細(xì)胞儀FACS Aria購自BD公司；ELISPOT讀板儀BIOREADER 5000-Vβ購自Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀TECAN5082購自TECAN公司；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.1.5 引物

擴(kuò)增Rv2628基因所用引物由南京金斯瑞生物工程有限公司合成，熒光定量PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的M. tb 標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的Rv2628基因序列 (ID: 888566)，使用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將純化的PCR產(chǎn)物以KpnⅠ/Hind Ⅲ于37 ℃雙酶切4 h，進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。對目的DNA片段進(jìn)行純化回收，原核表達(dá)載體pET-32a(+)經(jīng)同樣方法處理，通過連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對長出的菌落通過PCR與雙酶切進(jìn)行鑒定，并送南京金斯瑞公司進(jìn)行測序。將測序正確的陽性重組質(zhì)粒通過熱擊法轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，對鑒定后正確的重組菌命名為BL21(DE3)-pET-32a(+)-Rv2628。

1.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的細(xì)菌BL21(DE3)-pET-32a(+)-Rv2628及對照菌BL21(DE3)-pET-32a(+)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.2.4 融合蛋白的純化和鑒定

將以包涵體形式表達(dá)的Rv2628蛋白，按照Novagen公司的Ni-NTA His Bind purification kit說明書進(jìn)行純化，并對純化蛋白進(jìn)行透析去鹽處理。將重組蛋白、pET-32a空載體蛋白進(jìn)行12%的SDS-PAGE，并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，以兔抗H37Rv多抗血清為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG的抗體為二抗，以DAB顯色，進(jìn)行蛋白印跡分析。

1.2.5 融合蛋白與細(xì)胞表面結(jié)合測定

取6 μg純化的融合蛋白Rv2628、pET-32a空載體蛋白及DMEM培養(yǎng)基分別與小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7于冰上孵育15 min后，1 000 r/min離心10 min，去除上清。洗滌后分別加入1∶200稀釋的Rv2628多抗血清、空載體蛋白免疫的血清，4 ℃孵育1 h。每組樣品加入1 μL羊抗鼠IgG-FITC，4 ℃孵育40 min。洗滌后，用200 μL含1% BSA的PBS重懸，以流式細(xì)胞儀檢測融合蛋白與細(xì)胞表面的結(jié)合。

1.2.6 前炎性因子mRNA相對表達(dá)量測定

將純化的蛋白去除內(nèi)毒素，具體操作參照Norgen去內(nèi)毒素試劑盒的說明書。將透析后的蛋白用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行濃度測定。將6孔細(xì)胞板中的RAW264.7細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基后，分別加入6 μg的融合蛋白Rv2628、pET-32a空載體蛋白及不加蛋白的對照組進(jìn)行刺激。于互作后的1、12、24、48 h，以Trizol裂解液收集細(xì)胞，提取總RNA，并對提取的總RNA進(jìn)行DNA的去除。反轉(zhuǎn)錄后作為熒光定量PCR試驗(yàn)?zāi)０澹M(jìn)行熒光定量PCR。

1.2.7 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

免疫樣品的制備和免疫：15只6周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，分別為蛋白免疫組、BCG陽性對照組以及PBS陰性對照組。將25 μg Rv2628融合蛋白重懸于50 μL PBS中，與150 μL的DDA佐劑 (250 μg/mL) 及50 μL的MPL佐劑 (25 μg/mL) 充分乳化混合。取乳化充分的Rv2628蛋白按25 μg/只，皮下注射免疫；BCG按100 μL/只 (1×106CFU)，皮下注射免疫；陰性對照組以PBS-DDA/MPL按200 μL/只，皮下注射免疫。第1次免疫2周后，以同樣的劑量與方式進(jìn)行第2次免疫。

夾心ELISA試驗(yàn)檢測特異性IFN-γ和IL-4分泌水平：于二次免疫后的第7天，制備小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，加入到分別包被抗小鼠INF-γ單抗及抗小鼠IL-4單抗的ELISPOT板中，并向孔中分別加入50 μL 終濃度為10 μg/mL 的Rv262811-30、Rv2628和PPD作為刺激原，培養(yǎng)48 h。洗滌后加入生物素化抗小鼠INF-γ、IL-4單抗，作用3 h。加入鏈親和素-AKP加入孔中，作用3 h后顯色，再加入BCIP/NBT底物液顯色，拍干，觀察計(jì)數(shù)。將孔置于立體顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)每個(gè)孔中的藍(lán)斑數(shù)。

間接ELISA檢測血清中特異性抗體水平：將Rv262811-30多肽用包被液稀釋為10 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃過夜；次日封閉后，取上述制備的小鼠特異性多抗血清以及陰性血清，以含1% BSA的PBS從1∶100開始作系列倍比稀釋，100 μL/孔，37 ℃靜置孵育3 h；加入羊抗鼠IgG-HRP抗體，100 μL/孔，37 ℃靜置孵育1 h；以80 μL/孔加入TMB顯色底物，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取OD450數(shù)值。

圖1 Rv2628基因的PCR擴(kuò)增及pET-32a(+)-Rv2628(b)的鑒定結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of Rv2628 gene and identification of pET-32a(+)-Rv2628. (A) PCR amplification of Rv2628 gene. (B) Identification of recombinant plasmid by KpnⅠ/Hind Ⅲ. M: DL2000 DNA marker; 1: PCR products of Rv2628 gene; 2: pET-32a(+)-Rv2628 digested with KpnⅠ/Hind Ⅲ; 3: pET-32a(+) digested with KpnⅠ/Hind Ⅲ.

2 結(jié)果

2.1 Rv628重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以H37Rv基因組為模板擴(kuò)增Rv2628基因，由圖1A可以看出，Rv2628基因在相應(yīng)位置均出現(xiàn)特異性的目的條帶，說明該基因擴(kuò)增成功。將陽性克隆質(zhì)粒pET-32a(+)-Rv2628雙酶切后的回收片段與表達(dá)載體連接，進(jìn)行雙酶切鑒定，由圖1B可以看出，在相應(yīng)位置均有載體條帶與目的條帶出現(xiàn)，說明Rv2628基因與表達(dá)載體連接成功。

2.2 Rv2628蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

用Lasergene protean軟件分析結(jié)果表明，Rv2628是一個(gè)等電點(diǎn)為9.01、分子量為13.130 kDa的蛋白，而標(biāo)簽蛋白His-tag、S-tag和Trx-tag的分子量為16.93 kDa，故預(yù)期融合蛋白分子量為30 kDa。而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌BL21(DE3)-pET30a- Rv2628 進(jìn)行的SDS-PAGE結(jié)果顯示，與空載體菌相比，重組菌的誘導(dǎo)產(chǎn)物在約30 kDa位置出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，表明重組蛋白成功表達(dá) (圖2A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Rv2628蛋白主要以包涵體的形式存在。以His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒獲得純化的重組蛋白 (圖2B)，經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其濃度為2.5 mg/mL。

2.3 Rv2628蛋白的Western blotting鑒定

將融合蛋白Rv2628與兔抗H37Rv血清反應(yīng)，在30 kDa處有一條特異性條帶，而空載體菌則未見明顯特異性條帶(圖3)，說明原核表達(dá)的Rv2628融合蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性。

2.4 Rv2628蛋白與細(xì)胞結(jié)合能力分析

對Rv2628蛋白與巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力測定結(jié)果表明，Rv2628蛋白+Rv2628多抗組與其余對照組相比，沒有顯著性的差異 (P＞0.05) (圖4)，表明Rv2628蛋白顯示未能明顯與巨噬細(xì)胞結(jié)合。

2.5 前炎性因子mRNA相對表達(dá)量的測定

對3種前炎性因子mRNA的相對表達(dá)量測定結(jié)果顯示，Rv2628誘導(dǎo)IL-6 mRNA的相對表達(dá)量與對照組相比，在1 h最高，比對照組高20倍(P＜0.05)。隨著時(shí)間的延長，逐漸下降 (圖5A)。由以上結(jié)果可知，Rv2628能有效地誘導(dǎo)前炎性因子IL-6的產(chǎn)生。

2.6 夾心ELISA測定結(jié)果

各免疫組細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的含量如圖6所示，以Rv2628蛋白刺激各免疫組的脾臟淋巴細(xì)胞時(shí)，Rv2628免疫組的IFN-γ和IL-4的含量與陰性對照組的相比，有顯著性差異 (* P＜0.05)；以Rv262811-30多肽刺激的各免疫組中，Rv2628免疫組的IFN-γ水平與陰性對照組相比，有極顯著性差異 (** P＜0.01)，IL-4的水平有顯著性差異 (* P＜0.05)；并且IFN-γ水平要顯著高于IL-4的水平 (*** P＜0.000 1)。以上結(jié)果說明Rv2628能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。從圖6還可看出，PPD不能有效地誘導(dǎo)Rv2628蛋白免疫組產(chǎn)生IFN-γ與IL-4。

圖2 Rv2628蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of Rv2628 protein. (A) Supernatants and sediments of lysate of recombinant E. coli. (B) Rv2628-His after purification. M: protein marker; 1: BL21(DE3)-pET32a indued by IPTG; 2: supernatants of lysate of BL21(DE3)-pET32a(+)-Rv2628 induced by IPTG; 3: sediments of lysate of BL21(DE3)-pET-32a(+)-Rv2628 induced by IPTG; 4: Rv2628-His purified by Ni-NTA His Bind purification kit.

圖3 Rv2628蛋白的Western blotting分析Fig. 3 Western blotting analysis of Rv2628 protein. M: protein marker; 1: fusion protein of Rv2628; 2: BL21(DE3)-pET32a indued by IPTG.

2.7 間接ELISA測定結(jié)果

以Rv262811-30多肽包板，通過間接ELISA測定了蛋白免疫組的血清中Rv2628抗體水平。結(jié)果如圖7所示，蛋白免疫組的血清抗體效價(jià)為1∶1 600，說明Rv2628蛋白能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。

圖4 FACS檢測Rv2628蛋白與巨噬細(xì)胞的結(jié)合活性Fig. 4 FACS analysis of Rv2628 protein binding activity with RAW264.7. (A) The labeled positive cells detected by FACS. (B) Percentage of positive cells.*Polyclonal antibody against Ag85A.

3 討論

結(jié)核病是目前全世界共同面臨的主要公共衛(wèi)生問題，M. tb是導(dǎo)致人類TB的最主要的病原菌，其在長期進(jìn)化過程中，掌握了多種狡黠的機(jī)制來逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)控和清除，得以在宿主體內(nèi)存活[11-13]。當(dāng)M. tb在宿主體內(nèi)面臨缺乏營養(yǎng)、低氧等不利條件時(shí)，激活DosS/DosTDosR調(diào)控系統(tǒng)，下調(diào)其代謝活動(dòng)、進(jìn)入休眠期，宿主則處于潛伏感染狀態(tài)[14]，LTBI是TB復(fù)發(fā)的主要來源，是結(jié)核不能被徹底清除的原因之一[15]。DosR調(diào)控系統(tǒng)的激活是M. tb進(jìn)入休眠期的必需途徑[4-5]，目前對DosR所調(diào)控的大部分蛋白的功能還知之甚少,弄清它們在LTBI時(shí)期誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答規(guī)律，對于闡明潛伏感染的機(jī)制、診斷抗原的篩選、藥物靶標(biāo)的選擇以及疫苗的開發(fā)具有深遠(yuǎn)意義。

圖5 Rv2628蛋白刺激下細(xì)胞中前炎性子mRNA的相對表達(dá)量Fig. 5 Relative expression of the proinflammatory cytokine mRNAs after stimulation with Rv2628 protein. (A)IL-6. (B) IL-1β. (C) TNF-α.

圖6 不同免疫組脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4的水平Fig. 6 Levels of secreting IFN-γ and IL-4 in the spleen cells. (A) The concentration of IFN-γ. (B) The concentration of IL-4. *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

Rv2628蛋白是受DosR調(diào)控的蛋白之一，在功能分類上被列為一種假定蛋白，對其免疫功能特性的報(bào)道很少[16-18]。我們通過生物信息學(xué)的手段，對Rv2628與其他M. tb蛋白的互作預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白只與DosR調(diào)控的16個(gè)蛋白之間具有互作關(guān)系，提示該蛋白在M. tb潛伏感染過程中發(fā)揮重要作用。另外，我們利用網(wǎng)站的VaxiPred軟件對Rv2628蛋白進(jìn)行表位預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白富含B細(xì)胞、CTL表位及T細(xì)胞表位，其中第11–30位氨基酸既是B細(xì)胞表位，也是T細(xì)胞表位。因此我們選取Rv2628基因進(jìn)行了原核表達(dá)及免疫功能特性的研究。在以大腸桿菌作為原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Rv2628的過程中，雖然先后嘗試了多種表達(dá)載體和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，但僅獲得以包涵體形式表達(dá)的Rv2628蛋白。在未獲得可溶性表達(dá)的情況下，對包涵體蛋白進(jìn)行了變復(fù)性，通過Western blotting結(jié)果得知，包涵體蛋白仍具有較好的免疫生物學(xué)活性。Rv2628蛋白的原核表達(dá)，為進(jìn)一步研究蛋白的免疫學(xué)特性以及功能特性奠定了基礎(chǔ)。

M. tb在感染宿主后，機(jī)體會(huì)激活保護(hù)性免疫應(yīng)答，阻止其進(jìn)一步發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核。肺部巨噬細(xì)胞是宿主抵抗外來細(xì)菌入侵的第一道防線[19-21]，在對抗病原菌免疫反應(yīng)的早期起到了至關(guān)重要的作用。本研究中Rv2628蛋白與小鼠巨噬細(xì)胞系的相互作用結(jié)果顯示，Rv2628蛋白不具有與細(xì)胞膜結(jié)合活性，但能有效地刺激IL-6的上調(diào)表達(dá)。該細(xì)胞因子具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的特性；此外，IL-6還能促進(jìn)T細(xì)胞等多種細(xì)胞增殖及CTL等多種細(xì)胞分化的功能[22]。由此推斷Rv2628能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。另此，還能促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生，從而達(dá)到控制M. tb的早期感染的目的。

M. tb為胞內(nèi)寄生菌，一般認(rèn)為以CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ為特征的Th1型免疫應(yīng)答，在控制M. tb感染過程中起到了重要作用[23-24]。本研究中將Rv2628蛋白皮下初次免疫和加強(qiáng)免疫小鼠后，能夠有效誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Rv2628特異性的IFN-γ，并且顯著高于誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-4水平，呈現(xiàn)顯著的Th1型免疫應(yīng)答趨勢。另外，本實(shí)驗(yàn)中Rv2628蛋白及Rv262811-30多肽均不能有效地誘導(dǎo)BCG免疫組產(chǎn)生IFN-γ與IL-4。這與Lin等的報(bào)道相一致，他們研究發(fā)現(xiàn)，無論是將BCG接種受試兒童或者是免疫BALB/c小鼠，均不能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Rv2628等潛伏感染相關(guān)抗原的特異性免疫反應(yīng)[25]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rv2628蛋白顯示了良好的預(yù)防性結(jié)核病疫苗潛能。

綜上所述，Rv2628 蛋白能促進(jìn)前炎性因子的產(chǎn)生，從而對M. tb起到殺傷作用，抑制M. tb的早期感染。而Rv2628在獲得性免疫方面，顯示了較明顯的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。以上結(jié)果為闡明Rv2628蛋白的功能以及M. tb與宿主之間的相互作用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

圖7 不同免疫組血清中Rv2628抗體水平Fig. 7 Serum antibodies against Rv2628 in different groups.

REFERENCES

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Immunological characteristics of Mycobacterium tuberculosis antigen Rv2628

Yuelan Yin＊, Yunfei Gao＊, Dan Zhao, Kai Lian, Xiang Chen, Zhengzhong Xu, Zhiming Pan, and Xin′an Jiao
Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Jiangsu Province, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Antigen Rv2628 of Mycobacterium tuberculosis is associated with latent tuberculosis infection. In this study, Rv2628 was prokaryotic expressed and purified, its immunological characteristics was evaluated with macrophage cell line RAW264.7 and BALB/c mice. The results show that Rv2628 was mainly expressed in form of inclusion body confirmed by SDS-PAGE, and could react with rabbit anti-H37Rv polyclonal antibody detected by Western blotting assay, indicating that the protein had an effective immunoreactivity. The interactions between Rv2628 and macrophage cell line RAW264.7 confirmed that it could effectively induce cells to produce pro-inflammatory cytokines, the relative expression level of IL-6 mRNA was higher than the control group in 1–12 h. BALB/c mice were subcutaneously immunized with Rv2628 protein, the production of IFN-γ and IL-4 in the spleen cells was determined by Sandwich ELISA, in the Rv2628 immunized group, the level of IFN-γ was significantly higher than that of IL-4 (P＜0.000 1). It indicated the protein induced Th1-tendency immune responses. At the same time, Rv262811-30peptide used as coating antigen, the murine serum antibody titer detected by indirect-ELISA was 1:1 600, which demonstrated that Rv2628 could also induce humoral immune responses. In summary, Rv2628 could induce specific pro-inflammatory cytokines, affectively induce strongly Th1-tendency immune response and humoral response, it could be a potential target for developing subunit vaccine against TB. In addition, it laid foundation for probing the cross-talk between M. tb and host.

Mycobacterium tuberculosis, Rv2628, Th1 type immunity, pro-inflammatory cytokines, macrophage cell line

July 29, 2013; Accepted: November 5, 2013

Xin′an Jiao. Tel: +86-514-87971136; Fax: +86-514-87311374; E-mail: jiao@yzu.edu.cn*These authors contributed equally to this study.

殷月蘭, 高云飛, 趙丹, 等. 結(jié)核分枝桿菌Rv2628蛋白的免疫生物學(xué)特性. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 255-264.

Yin YL, Gao YF, Zhao D, et al. Immunological characteristics of Mycobacterium tuberculosis antigen Rv2628. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 255-264.

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB518805), National Science foundation of Jiangsu Province, China (No. BK2011446), National Natural Science Foundation of China (No. 31101841), Jiangsu Provincial Key Agricultural Technology Program (No. BE2012367), Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB518805)，江蘇省自然科學(xué)基金 (No. BK2011446)，國家自然科學(xué)基金 (No. 31101841)，江蘇省科技支撐計(jì)劃 (No. BE2012367)，江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目資助。