腦室內(nèi)注射瘦素對四肢骨折愈合的影響*

劉保龍 孫志明 武俏麗 王 宏 閆 華△

腦室內(nèi)注射瘦素對四肢骨折愈合的影響*

劉保龍1孫志明2武俏麗2王 宏2閆 華2△

目的 觀察兔脛腓骨骨缺損模型腦室內(nèi)注射瘦素蛋白（leptin）對骨折愈合速度的影響。方法建立新西蘭兔右側脛腓骨外側骨缺損模型，leptin組經(jīng)兔枕骨大孔向小腦延髓池腦脊液中注射重組兔leptin，對照組以相同方法注射等劑量生理鹽水。于術后1、3、7、14、21 d記錄兔體質(zhì)量變化，并通過CT動態(tài)記錄骨缺損區(qū)域骨痂骨密度（BMD）的變化。于術后21 d，所有動物均處死后取右側脛腓骨骨缺損區(qū)域，以熒光原位雜交技術(FISH)檢測骨折區(qū)域骨形成蛋白（BMP）-2的表達情況。結果2組動物造模后，體質(zhì)量先下降后（14 d）上升，BMD一直呈上升趨勢；術后1、3 d，2組體質(zhì)量及BMD差異均無統(tǒng)計學意義，術后7、14、21 d，leptin組的體質(zhì)量低于對照組，BMD高于對照組（均P＜0.05）。術后21 d，骨缺損區(qū)域BMP-2表達陽性細胞數(shù)目高于對照組(個：120.87±29.14 vs 97.65±20.97,t=6.79, P＜0.001)。結論經(jīng)枕骨大孔向小腦延髓池內(nèi)中注射leptin可加速兔四肢骨缺損的愈合。

瘦素；腦脊液；脛骨骨折；骨折愈合；骨密度；原位雜交，熒光；兔；骨形成蛋白2

顱腦創(chuàng)傷合并四肢骨折多呈現(xiàn)四肢骨折骨痂體積較大，愈合加快[1]，甚至異位骨化的現(xiàn)象[2-3]，提示四肢骨折合并顱腦損傷時多伴隨成骨作用增強。顱腦創(chuàng)傷是一種嚴重的創(chuàng)傷性疾病，可引起復雜的生理狀態(tài)包括代謝、循環(huán)、呼吸以及免疫狀態(tài)的改變。Cadosch等[4]提出顱腦創(chuàng)傷相關性異位骨化可能是顱腦創(chuàng)傷后引起的循環(huán)血液中某些生長因子的改變間接作用導致的。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷后兔血清中瘦素（leptin）、生長激素（GH）、胰島素樣生長因子（IGF）-1等激素顯著升高，升高的leptin可能是由于外傷引起血腦屏障破壞而滲漏進入腦脊液中所致[5]。本實驗通過建立單純四肢骨缺損模型，經(jīng)枕骨大孔向小腦延髓池中注射重組兔leptin來提高腦脊液中l(wèi)eptin水平，以此觀察腦室內(nèi)leptin水平升高對四肢骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 重組兔leptin（以色列prospec）、牙科鉆、操作臺、器械以及麻醉藥均由天津市腦血管病與神經(jīng)變性重點實驗室提供。

1.2 實驗動物和分組 新西蘭白兔20只，雄性，4月齡，平均2.5 kg（購自天津市奧易實驗室），在安靜、溫暖、避強光的環(huán)境中飼養(yǎng)，嚴格控制日夜更替時間，每天均給予相同進食量（200 g）和足量飲用水，并保持環(huán)境清潔與衛(wèi)生。采用抽簽法將動物隨機均分為2組，leptin組：建立骨缺損模型后于1、3、7 d經(jīng)枕骨大孔向小腦延髓池注射leptin（0.5 g/L溶于生理鹽水），對照組建立骨缺損模型后以相同時間點及方式注射等量生理鹽水。本研究對動物的處理方法符合動物倫理學要求。

1.3 建立兔右側脛腓骨缺損模型 新西蘭兔全麻滿意后，于右側脛腓骨中上1/3處，用牙科鉆打磨骨性缺損（長∶寬∶高= 3 mm∶2 mm∶2 mm，深度均未達骨髓，以免造成骨髓感染影響實驗結果），造模過程中嚴格注意無菌操作，防止術后出現(xiàn)感染影響實驗結果，術后骨缺損模型均無需外固定。

1.4 觀察指標 于術后1、3、7、14及21 d記錄并分析兔體質(zhì)量變化；相同時間點于CT下掃描兔右脛腓骨缺損區(qū)域，以查看其骨痂愈合情況及骨密度（BMD）變化；第21天，處死所有動物并取其右側脛腓骨，用熒光原位雜交(FISH)法測定骨形成蛋白（BMP）-2(探針5′-GAAGCACGCGGGGACACGTC CATTGAAAGA-3′，5′-AGCAACCGCAACTCGAACTCGCTCAGGATG-3′)表達情況，以紅色熒光為陽性，以每個視野的陽性細胞個數(shù)來表示BMP-2的表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0錄入數(shù)據(jù)并行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以±s表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同時間點2組體質(zhì)量變化情況 2組動物造模后均出現(xiàn)體質(zhì)量下降，于第14天開始上升；術后1、3 d，2組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義，術后7、14、21 d，leptin組的體質(zhì)量低于對照組（P＜0.05），見表1。

Table 1 Weight change in leptin group and control group表1 不同時間點2組體質(zhì)量比較（n=10,kg，ˉ±s）

Table 1 Weight change in leptin group and control group表1 不同時間點2組體質(zhì)量比較（n=10,kg，ˉ±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表2同

組別leptin組對照組t術后1 d 2.57±0.07 2.60±0.04 0.75術后3 d 2.45±0.10 2.54±0.06 1.94術后7 d 2.32±0.09 2.51±0.07 4.02＊術后14 d 2.38±0.05 2.65±0.04 11.19＊＊術后21 d 2.52±0.05 2.70±0.03 7.10＊＊

2.2 不同時間點2組骨痂BMD變化情況 2組術后BMD均呈上升趨勢，術后1、3 d，2組間BMD差異無統(tǒng)計學意義，術后7、14、21 d，leptin組的BMD高于對照組（P＜0.05），見表2。

2.3 右側脛腓骨缺損區(qū)域BMP-2的表達情況 leptin組的BMP-2陽性細胞數(shù)目高于對照組(個：120.87±29.14 vs 97.65±20.97，t=6.79，P＜0.001)，在leptin組中可見到大量陽性表達的軟骨細胞和成骨細胞，見圖1；對照組僅可見少量BMP-2陽性表達細胞，見圖2。

Table 2 BMD in leptin group and control group表2 不同時間點2組BMD比較（n=10,mg/cm2，ˉ±s）

Table 2 BMD in leptin group and control group表2 不同時間點2組BMD比較（n=10,mg/cm2，ˉ±s）

組別leptin組對照組t術后1 d 817.62±15.96 818.93±13.31 0.16術后3 d 844.52±17.13 850.23±17.93 0.57組別leptin組對照組t術后7 d 906.73±19.28 869.63±19.72 3.29＊術后14 d 1 092.12±10.22 1 000.47±25.29 8.23＊＊術后21 d 1 184.83±29.36 1 052.43±13.70 10.01＊＊

Figure 1 BMP-2 expression in leptin group(FISH,×50)圖1 leptin組骨缺損區(qū)域BMP-2表達情況(FISH,×50)

Figure 2 BMP-2 expression in control group(FISH,×50)圖2 對照組骨缺損區(qū)域BMP-2表達情況（FISH,×50）

3 討論

Leptin是主要由脂肪組織分泌的分子質(zhì)量為16 ku的蛋白類激素，可以通過外周作用或中樞作用來調(diào)節(jié)脂類代謝、食欲以及性腺的發(fā)育[6]，但leptin在腦脊液中對骨代謝的作用仍存在爭議：一些研究發(fā)現(xiàn)向正常大鼠腦室內(nèi)注射leptin后導致骨量下降；與此相反，有研究者通過向leptin缺陷大鼠腦室內(nèi)連續(xù)注射leptin后，發(fā)現(xiàn)其BMD、骨礦物質(zhì)含量、骨體積以及骨礦物質(zhì)沉積率均提高[7]。Hamrick等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同類型骨質(zhì)（長骨、短骨、扁骨及不規(guī)則骨）對中樞l(wèi)eptin的反應不同。

本實驗選擇兔右側脛腓骨中上1/3處骨缺損性骨折來觀察骨折愈合過程，可以減小骨折模型建立過程中骨折程度不一帶來的差異，且該骨性缺損可以在不損傷兔正常運動功能的同時自行愈合，而不會出現(xiàn)骨缺損不愈合的現(xiàn)象。由于中樞l(wèi)eptin可以通過下丘腦抑制進食，因此對于leptin組和對照組均給予等量食物喂養(yǎng)以消除leptin組因中樞l(wèi)eptin的抑制進食作用而產(chǎn)生的能量攝入不等對骨折愈合的影響。

骨折愈合情況與骨折區(qū)域鈣化程度及膠原蛋白質(zhì)量、顯微結構等有關。骨折區(qū)域的BMD能夠說明骨痂鈣化程度，影響B(tài)MD的因素包括體質(zhì)量、營養(yǎng)狀態(tài)以及成骨活性等。本研究發(fā)現(xiàn)在骨缺損愈合過程中，早期2組動物均出現(xiàn)體質(zhì)量下降，考慮為建立骨缺損模型后應激反應導致，然后在7～21 d leptin組的體質(zhì)量下降更為明顯，進一步印證了中樞l(wèi)eptin抑制進食、促進能量代謝的作用。2組術后骨痂BMD均呈上升趨勢，是因為骨缺損愈合引起鈣鹽沉積及相應骨折愈合反應導致，leptin組自第7天開始骨缺損區(qū)域骨痂BMD顯著高于對照組，原因是注射leptin后，骨缺損的修復加快，骨密度顯著升高，成骨活性增強。

BMP-2是BMPs家族中的一種，是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β超家族中的一組多功能細胞因子,具有誘導間充質(zhì)細胞遷徙、增殖、分化,最終導致軟骨、骨形成的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，leptin組骨缺損愈合過程中第21天的骨痂區(qū)域BMP-2表達高于對照組，證明了leptin組骨折愈合作用的增強。在骨折愈合過程中，骨量的穩(wěn)定通過不斷的成骨細胞的成骨作用和破骨細胞的溶骨作用來維持，而在整個過程中，骨成形蛋白家族BMPs在骨代謝過程中起著重要的作用，且與異位骨化存在一定聯(lián)系：BMPs在不同狀態(tài)下可以誘導間充質(zhì)干細胞分別分化為骨細胞、軟骨細胞、韌帶及肌腱[9]。

本實驗通過向腦室中注射leptin干預兔脛腓骨骨缺損模型，發(fā)現(xiàn)leptin在中樞作用可以增強骨折愈合過程中的成骨活性。leptin在中樞加強成骨活性的具體通路及機制尚未明了，其存在以下幾種可能：（1）中樞l(wèi)eptin通過作用于下丘腦-垂體內(nèi)分泌軸來影響體內(nèi)激素水平（GH，IGF-1，堿性磷酸酶等），從而進一步調(diào)節(jié)四肢骨折愈合進程。（2）中樞l(wèi)eptin可能通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元活性使其產(chǎn)生同神經(jīng)損傷類似的反應，釋放某種生物因子進而影響成骨活性，加快骨折愈合、骨痂形成，甚至形成異位骨化。leptin中樞的成骨作用具體途徑仍需進一步研究。

[1]Yang TY,Wang TC,Tsai YH,et al.The effects of an injury to the brain on bone healing and callus formation in young adults with fractures of the femoral shaft[J].J Bone Joint Surg Br,2012,94(2): 227-230.doi:10.1302/0301-620X.94B2.28193.

[2]Hendricks HT,Geurts AC,van Ginneken BC,et al.Brain injury severity and autonomic dysregulation accurately predict heterotopic ossification in patients with traumatic brain injury[J].Clin Rehabil，2007,21(6):545-553.

[3]van Kampen PJ,Martina JD,Vos PE,et al.Potential risk factors for developing heterotopic ossification in patients with severe traumatic brain injury[J].J Head Trauma Rehabil，2011，26(5):384-391.doi: 10.1097/HTR.0b013e3181f78a59.

[4]Cadosch D,Toffoli AM,Gautschi OP，et al.Serum after traumatic brain injury increases proliferation and supports expression of osteoblast markers in muscle cells[J].J Bone Joint Surg Am,2010,92 (3):645-653.

[5]Yan H,Zhang HW,Liu BL，et al.Leptin's effect on accelerated fracture healing after traumatic brain injury[J].Neurol Res，2013，35(5): 537-544.doi:10.1179/1743132813Y.0000000201.

[6]Diéguez C,Vazquez MJ,Romero A，et al.Hypothalamic control of lipid metabolism:focus on leptin,Ghrelin and melanocortins[J].Neuroendofrinology,2011，94（1）:1-11.

[7]Bartell SM，Rayalam S，Ambati S，et al.Central(ICV)leptin injection increases bone formation,bone mineral density,muscle mass, serum IGF-1,and the expression of osteogenic genes in leptin-deficient ob/ob mice[J].J Bone Miner Res，2011，26(8):1710-1720. doi:10.1002/jbmr.406.

[8]Hamrick MW，Pennington C，Newton D，et al.Leptin deficiency produces contrasting phenotypes in bones of the limb and spine [J].Bone，2004,34(3):376-383.

[9]Jensen ED，Pham L，Billington CJ，et al.Bone morphogenic protein 2 directly enhances differentiation of murine osteoclast precursors [J].J Cell Biochem，2010，109(4):672-682.doi:10.1002/jcb.22462.

（2014-04-01收稿 2014-04-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Effect of Intracerebroventricular Leptin Injection on Limbs Fracture Healing

LIU Baolong1，SUN Zhiming2，WU Qiaoli2，WANG Hong2，YAN Hua2
1 Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Department of Neurosurgery,Huanhu Hospital of Tianjin

Objective To investigate the enhanced osteogenesis during bone fracture healing after intracerebroventricular(ICV)leptin injection,using rabbit model with created segmental bone defect in right tibial.MethodSegmental critical-sized defects were created at the right tibial bone of skeletally mature New Zealand white rabbits.In experiment group(leptin group),recombinant rabbit leptin was injected into cerebellomedullary cistern through foramen magnum.While in control group,normal saline was injected in the same way.Bone Mineral Density(BMD)was evaluated by qCT at 1st,3rd, 7th,14th and the 21st days.At the 21st days,all rabbits were euthanized to collect the right tibia for histomorphology,to examine the BMP-2 expression in the bone callus by Fluorescence in situ hybridization(FISH).ResultIn the leptin group, body weight declined more obviously than control group then it start to arise at the 14th day;qCT showed significant higher BMD in leptin group than in control group at the 7th day;FISH showed a higher BMP-2 expression in leptin group than in control group.ConclusionCerebellomedullary leptin injection through foramen magnum could accelerate limb fracture healing in rabbit model with right tibial bone defection.

leptin;cerebrospinal fluid；tibial fracture;fracture healing；bone density;in siut hybridization,fluorescence;rabbits;bone morphogenetic protein 2

R683.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.013

*天津市科學技術委員會基金課題（項目編號：13JCYBJC21100）；天津市衛(wèi)生局攻關課題(項目編號：10KG208)

1天津醫(yī)科大學研究生院(郵編300070)；2天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)外科

△通訊作者 E-mail：liubaolong1988@gmail.com