羅格列酮對(duì)大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討

谷名曉，江 璐，劉選成

(青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266034)

急性腎損傷是多種原因造成的短期內(nèi)腎功能的急劇下降，是影響機(jī)體多器官、多系統(tǒng)的臨床危重癥之一，發(fā)病率逐年增高。氧化應(yīng)激反應(yīng)是急性腎損傷發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制?；钚匝?ROS)與蛋白質(zhì)、脂肪、核酸、碳水化合物以及其他分子發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)并使之變性引起炎癥反應(yīng)、凋亡、纖維化和細(xì)胞增殖［1，2］。過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPAR-γ)羅格列酮(RSG)是噻唑烷二酮類藥物，因其具有改善胰島素抵抗、降糖等作用作為胰島素增敏劑廣泛應(yīng)用于臨床。近年研究［3］表明，除了上述作用外，RSG還具有抗炎抗氧化及直接的腎臟保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚未完全明了。本研究觀察了RSG對(duì)大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)SD大鼠30只，2月齡，體質(zhì)量300～350 g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;慶大霉素(GEN)，RSG，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒，圖像采集及分析(LEICA QWIN)，752紫光光柵分光光度計(jì)，LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)，NikonE600顯微攝像系統(tǒng)，PSD-156生化分析儀，TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)，紫外分析儀。

1.2 動(dòng)物分組及GEN用法 將30只大鼠隨機(jī)分為誘導(dǎo)組、干預(yù)組、對(duì)照組各10只，誘導(dǎo)組、干預(yù)組持續(xù)腹腔注射GEN 2周，劑量100 mg/(kg·d)，復(fù)制急性腎損害模型［4］，干預(yù)組同時(shí)以RSG 10 mg/(kg·d)灌胃，誘導(dǎo)組以生理鹽水灌胃，共2周;對(duì)照組不復(fù)制急性腎損害模型，單純以生理鹽水灌胃，共2周。

1.3 觀察方法 將大鼠置于代謝籠中，分別于注射藥物前1 d及實(shí)驗(yàn)第15天稱取每只大鼠的體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量變化(注射藥物前1 d與實(shí)驗(yàn)第15天的差值)。實(shí)驗(yàn)第15天收集24 h尿液，并記錄。后采用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，摘眼球取靜脈血3 mL，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)尿素氮、肌酐。取大鼠左腎(右腎用于制備腎組織勻漿)，置于10%中性甲醛中，經(jīng)脫水、包埋制成蠟塊，切片后行HE染色，顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。采用Allen［5］的方法半定量評(píng)價(jià)腎組織的損害程度，對(duì)每張切片觀察50個(gè)近端小管，觀察有無(wú)腎小管壞死、上皮細(xì)胞空泡變性及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)三種病理學(xué)特征，對(duì)腎小管壞死、上皮細(xì)胞空泡變性及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。腎小管壞死程度:0級(jí)表示正常腎小管，1級(jí)表示腎小管輕微傷害(＜25%腎小管受累)，2級(jí)表示腎小管中等傷害(25% ～50%腎小管受累)，3級(jí)表示腎小管嚴(yán)重傷害(50%及以上腎小管受累)。上皮細(xì)胞空泡變性程度:0級(jí)，光鏡下可見正常腎小管上皮細(xì)胞空泡;1級(jí)，可見上皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)淡染并且遍布微小空泡;2級(jí)，可見空泡變性主要發(fā)生在近端小管段，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)邊界清晰的巨大空泡，空泡含液體;3級(jí)，可見腎小管上皮細(xì)胞融合，含鐵血黃素沉積、包涵體。間質(zhì)炎性浸潤(rùn)程度:0級(jí)表示無(wú)浸潤(rùn)，1級(jí)表示少量分散的炎性細(xì)胞，2級(jí)表示成組的炎性細(xì)胞，3級(jí)表示廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。取保存的右腎皮質(zhì)，加冰冷生理鹽水，剪碎研磨制成組織勻漿，低溫離心取上清液后，嚴(yán)格按照南京建成公司試劑盒說明書操作，采用化學(xué)比色法測(cè)定MDA、SOD、GSH活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，各組間均數(shù)差異采用t檢驗(yàn)。各組腎組織病理學(xué)評(píng)價(jià)的統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比較(± s)

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比較(± s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與誘導(dǎo)組比較，ΔP ＜0.05

組別 體質(zhì)量變化(g)24 h尿量(mL)尿素氮(mg/dL)肌酐(mg/dL)誘導(dǎo)組 －8.35±3.45*24.82±3.05* 126.3±8.9* 1.81±0.1*干預(yù)組 11.68±3.43*Δ14.08±0.79*Δ 53.9±7.0*Δ 0.64±0.15*Δ對(duì)照組36.00±2.90 8.27±0.71 36.0±4.8 0.39±0.1

2.2 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化 顯微鏡下顯示，對(duì)照組大鼠腎臟的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不明顯;誘導(dǎo)組表現(xiàn)為近端腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、壞死、胞質(zhì)空泡變性，腎小管壞死，管腔內(nèi)可見蛋白管型及紅細(xì)胞管型;干預(yù)組大鼠病變較誘導(dǎo)組輕。見圖1～3。

圖1 對(duì)照組大鼠腎組織病理學(xué)變化(HE，×400)

圖2 誘導(dǎo)組大鼠腎組織病理學(xué)變化(HE，×400)

圖3 干預(yù)組大鼠腎組織病理學(xué)變化(HE，×400)

2.3 各組大鼠腎組織損傷程度的分析比較 結(jié)果見表2。與對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組和干預(yù)組腎小管壞死、上皮細(xì)胞空泡變性、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度輕(P均＜0.05);與干預(yù)組比較，誘導(dǎo)組腎小管壞死、上皮細(xì)胞空泡變性、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度重(P均＜0.05)。

表2 各組大鼠腎小管壞死、空泡細(xì)胞空泡變性及間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)程度比較(只)

2.4 各組大鼠腎組織GSH、MDA、SOD活性比較結(jié)果見表3。

3 討論

GEN是一種臨床上廣泛使用的氨基糖苷類抗生素，因其具有耳腎毒性，在臨床應(yīng)用受到限制，目前對(duì)其引起腎損傷確切機(jī)制仍不明確［6］。近年研究［7，8］表明，ROS 釋放、脂質(zhì)過氧化及炎癥介質(zhì)釋放是GEN引起腎毒性的主要因素。氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞損傷發(fā)病機(jī)制為溶酶體、線粒體等細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變。氧自由基能攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，同時(shí)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的自由基和醛類丙二醛均具有直接細(xì)胞毒性作用，造成生物膜損傷，影響細(xì)胞的功能［9］。GSH氧化還原循環(huán)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化系統(tǒng)之一，而GSH和SOD是該循環(huán)系統(tǒng)中最重要的兩種化合物，SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化酶，對(duì)于維持細(xì)胞的完整性，參與細(xì)胞代謝有重要意義，腎組織中GSH和SOD的消耗可直接反映腎組織氧化損傷程度［10，11］。MDA是由自由基產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，引起脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物主要成分，MDA含量可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，已普遍用作檢測(cè)機(jī)體組織中氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)，所以同時(shí)檢測(cè)MDA含量和SOD，GSH活性可了解自由基產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)［12］。

表3 各組大鼠腎組織GSH、MDA、SOD活性比較(± s)

表3 各組大鼠腎組織GSH、MDA、SOD活性比較(± s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與誘導(dǎo)組比較，ΔP ＜0.05

組別 GSH(μmol/g) MDA(nmol/g) SOD(U/mg)誘導(dǎo)組 59.6± 4.5 97.4±14.6* 107.2±9.2*干預(yù)組 69.2± 6.8*Δ 48.8± 4.5*Δ 133.9±5.1*Δ對(duì)照組 112.5±12.5*38.9± 5.7 158.1±4.2

最近研究［13，14］表明，PPAR-γ 激動(dòng)劑，在體外和在體內(nèi)表現(xiàn)出抗炎作用。PPAR-γ激動(dòng)劑減少炎癥細(xì)胞因子的分泌如TNF-α和IL-1b，抑制巨噬細(xì)胞的激活。本研究顯示，誘導(dǎo)組、干預(yù)組大鼠24 h尿量高于對(duì)照組，表明存在GEN誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生多尿;而干預(yù)組大鼠24 h尿量低于誘導(dǎo)組，提示RSG對(duì)急性腎小管壞死的保護(hù)性作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組、干預(yù)組尿素氮、肌酐較對(duì)照組升高，提示GEN可使腎功能發(fā)生損害;而干預(yù)組尿素氮、肌酐較誘導(dǎo)組降低，提示RSG能通過保留腎細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性，降低血清尿素氮和肌酐水平。本研究誘導(dǎo)組大鼠ROS、MDA水平較對(duì)照組升高，SOD水平較對(duì)照組降低，且同時(shí)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞局灶性顆粒空泡變性，上皮壞死及脫落，小管腔中出現(xiàn)顆粒狀碎屑，表明誘導(dǎo)組腎組織氧化還原系統(tǒng)受損，且受損部位主要位于腎小管，推測(cè)GEN引起的腎功能損害與氧自由基代謝失衡，ROS代謝產(chǎn)物增加引起氧化應(yīng)激有關(guān)，目前一些抗氧化劑已被用來防止GEN 腎毒性［15］。

總之，RSG對(duì)氧化應(yīng)激所致的急性腎損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)GSH、SOD水平及下調(diào)MDA水平有關(guān)。

［1］Pisani A，Riccio E，Andreucci M，et al.Role of reactive oxygen species in pathogenesis of radiocontrast-in duced nephropathy［J］.Biomed Res Int，2013，12(29):868321-868327.

［2］Taskin E，Ozdogan K，Kunduz Kindap E，et al.The restoration of kidney mitochondria function by inhibition of angiotensin-Ⅱproduction in rats with acute adriamycin-induced nephrotoxicity［J］.Ren Fail，2014，36(4):882737.

［3］Kuang QT，Zhao JJ，Ye CL，et al.Nephro-protective effects of total triterpenoids from psidium guajava leaves on type 2 diabetic rats［J］.Zhong Yao Cai，2012，35(1):94-97.

［4］朱立勤，婁建石，焦建杰，等.慶大霉素不同給藥方案的藥代動(dòng)力學(xué)和腎功能損害的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，(8):1009-1014.

［5］Allen CT.Laboratory methods in histochemistry.In:Prophet EB，Mills B，Arrington JB，Sobin LH(eds)American registry of pathology［M］.Washington DC，1992:53.

［6］Yanagida C，Ito K，Komiya I，et al.Protective effect of fosfomycin on gentamicin-induced lipid peroxidation of rat renal tissue［J］.Chem Biol Interact，2004，148(3):139-147.

［7］Denamur S，Tyteca D，Marchand-Brynaert J，et al.Role of oxidative stress in lysosomal membrane permeabilization and apoptosis induced by gentamicin，an aminoglycoside antibiotic［J］.Free Radic Biol Med，2011，51(9):1656-1665.

［8］Cuzzocrea S，Mazzon E，Dugo L，et al.A role for superoxide in gentamicin-mediated nephropathy in rats［J］.Eur J Pharmacol，2002，450(1):67-76.

［9］Song J，Liu D，F(xiàn)eng L，et al.Protective effect of standardized extract of ginkgo biloba against cisplatin-induced nephrotoxicity［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，11(25):846126-846134.

［10］Sivaranjani N，Rao SV，Rajeev G.Role of reactive oxygen species and antioxidants in atopic dermatitis［J］.J Clin Diagn Res，2013，7(12):2683-2685.

［11］Kang C，Lee H，Hah DY，et al.Protective effects of houttuynia cordata thunb.on gentamicin-induced oxidative stress and nephroto xic ity in rats［J］.Toxicol Res，2013，29(1):61-67.

［12］季文萱，黃俊彥，孟冬梅，等.馬兜鈴酸對(duì)腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)的作用［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(25):104-106.

［13］Kaushik P，Kaushik D，Yadav J，et al.Protective effect of alpinia galanga in STZ induced diabetic nephropathy［J］.Pak J Biol Sci，2013，16(16):804-811.

［14］Wang Y，Yang YS，Tang XC，et al.T33，a novel peroxisome proliferator-activated receptor γ /α agonist，exerts neuroprotective action via its anti-inflammatory activities［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32(9):1100-1108.

［15］Mazzon E，Britti D，De Sarro A，et al.Effect of N-acetylcysteine on gentamicin-mediated nephropathy in rats［J］.Eur J Pharmacol，2001，424(1):75-83.