番茄紅素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及腦組織caspase-3表達(dá)的影響

匡穩(wěn)定，匡雙玉，周容容，李 熠

(1南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽421001;2南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室)

番茄紅素是類胡蘿卜素中的一種，其通過抗氧化、清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞、抑制增殖、增加免疫力等多種生物樣作用，起到防癌抗癌、預(yù)防心血管疾病、提高免疫功能和延緩衰老等作用。國外流行病學(xué)資料顯示，高番茄紅素攝入量的人群有較低的心腦血管疾病發(fā)病率，血漿低番茄紅素有更高的急性心肌梗死和腦卒中的危險性［1～7］。2011年9月～2012年3月，我們通過建立大腦中動脈缺血模型，觀察了番茄紅素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及腦組織天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠(南華大學(xué)動物實驗部購買)36只，番茄紅素(Sigma公司)，DAB染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，BCA蛋白定量試劑(Hyclone.Pierce公司)，caspase-3抗體(Santa Cruz公司)，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱(美國Shill公司);病理組織切片機(jī)(美國AO公司);光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(日本 Olympus公司);垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國BioRad公司)。

1.2 大鼠腦缺血模型制備及番茄紅素給予方法 參照文獻(xiàn)［8］的方法，利用線栓法制備SD大鼠大腦中動脈缺血模型。栓線選用冠王牌2.0號魚線(直徑0.235 mm)，用頭端接近爍熱的烙鐵，加熱成光滑球面，光鏡下打磨，使得頭端光滑圓鈍，直徑為0.25～0.30 mm，截斷為5cm長。模型制備成功后將36只大鼠隨機(jī)分為3組各12只，對照組以羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，番茄紅素組以40 mg/kg番茄紅素(羧甲基纖維素鈉懸溶)灌胃，銀杏葉片組以40 mg/kg銀杏葉片(羧甲基纖維素鈉懸溶)灌胃，共干預(yù)14 d。

1.3 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評估 按照Bederson6級5分評分標(biāo)準(zhǔn)［9］，由不知情觀察者進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分(灌胃120 h及14 d后)，真實記錄各大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分。選取評分為1～4分的大鼠，刪除有蛛網(wǎng)膜下腔出血癥狀的大鼠，每組缺失大鼠在后續(xù)實驗中補(bǔ)充。評分分為0分(5級:無功能障礙)、1分(4級:對側(cè)上肢不能完全伸展)、2分(3級:向?qū)?cè)推時抵抗力下降)、3分(2級:提尾時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈)、4分(1級:自動轉(zhuǎn)圈)、5分(0級:無自發(fā)性活動伴意識障礙)。

1.4 大鼠腦組織病理學(xué)觀察 暴露大鼠心臟及腹主動脈，于腹主動脈處抽血2 mL緩慢注入試管中，夾閉腹主動脈，從左心室插管至主動脈弓，剪除右心耳，用生理鹽水快速灌注沖洗至右心耳流出液清亮后，再用備好的多聚甲醛灌注，灌注早期可見大鼠全身肌肉抽搐，后期全身僵硬，灌注約30 min后，斷頭取腦，在視交叉及其后4 mm兩處作冠狀切片，片厚約4 mm，用4%多聚甲醛固定6 h，再用0.1 mol/L PBS浸泡過夜，-20℃冰箱保存，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明標(biāo)本，最后石蠟包埋保存，顯微鏡下觀察。

1.5 大鼠腦組織caspase-3檢測 大鼠腦組織勻漿裂解后，5 000 r/min離心去除沉淀，BCA試劑測定蛋白含量，上樣緩沖液調(diào)各組蛋白濃度使各組一致，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳2 h(積層膠80 V，分離膠120 V)后電轉(zhuǎn)移(4℃，100 mA，3 h)至聚偏二氟乙烯膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的位置。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，按1∶1 000加入兔抗鼠caspase-3一抗，37℃孵育2 h，TBST洗3次，1∶2 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，37℃孵育0.5 h，TBST洗3次后，用Western blotting熒光檢測試劑盒顯影、定影。結(jié)果用圖象分析儀分析，按照各組灰度面積計算caspase-3相對表達(dá)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較 結(jié)果見表1。

表1 三組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較(分，±s)

表1 三組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較(分，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別14 d番茄紅素組 3.82±0.41 2.25±0.17神經(jīng)功能缺損程度評分灌胃120 h 灌胃*銀杏葉片組 3.80±0.18 2.04±0.28*對照組3.87±0.35 3.76±0.42

2.2 大鼠腦組織病理學(xué)變化 結(jié)果見圖1～3(各組隨機(jī)選1只)。由圖1～3可見，對照組神經(jīng)組織大片壞死，周圍殘存組織結(jié)構(gòu)不完整，神經(jīng)細(xì)胞水腫明顯，大量空泡形成。番茄紅素組與銀杏葉片組神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)明顯改善、壞死區(qū)域縮小，梗死灶周圍殘存組織較多。

圖1 對照組大鼠腦組織病理學(xué)變化

圖2 番茄紅素組大鼠腦組織病理學(xué)變化

圖3 銀杏葉片組大鼠腦組織病理學(xué)變化

2.3 大鼠腦組織caspase-3表達(dá)變化 番茄紅素組、銀杏葉片組、對照組caspase-3表達(dá)相對值分別為0.2、0.15、1，番茄紅素組、銀杏葉片組與對照組比較，P 均 ＜0.05。

3 討論

腦血管病是導(dǎo)致人類死亡的三大疾病之一，也是中老年人致殘的主要原因，其中缺血性腦血管病在腦血管疾病中的發(fā)病率最高，腦缺血一定時間后血液恢復(fù)供應(yīng)，其功能不但未能恢復(fù)，而且出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦機(jī)能障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷［10］。由于其病因較多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床上尚缺乏特效的治療藥物，現(xiàn)已成為目前國內(nèi)外研究的熱點之一，因此積極探討和研究防治腦缺血再灌注損傷的藥物具有重要的臨床意義。

番茄紅素是類胡蘿卜素中的一種，近年來其主要用于抗腫瘤的研究，它對心血管系統(tǒng)的作用主要集中在降脂、抗氧化等方面，而目前番茄紅素對腦組織缺血再灌注作用的研究較少。一般認(rèn)為，番茄紅素通過高效猝滅單線態(tài)氧及清除過氧化自由基、阻斷亞硝胺形成、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增加免疫力、減少DNA損傷及對細(xì)胞間隙連接通訊的影響等多種作用方式，起到防癌抗癌、預(yù)防心血管疾病發(fā)生的作用［11，12］。Fujita 等［13］發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以促進(jìn)抗氧化酶活性，防止腦缺血再灌注損傷。本研究顯示，番茄紅素組干預(yù)14 d大鼠神經(jīng)行為缺損得到一定程度改善，腦組織壞死區(qū)域縮小，提示番茄紅素對大鼠腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。

腦缺血再灌注損傷是腦缺血后腦組織恢復(fù)血流灌注時引起腦細(xì)胞更嚴(yán)重?fù)p傷的一種病理生理現(xiàn)象，其發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，其中包括許多環(huán)節(jié)，如線粒體損傷、鈣超載、氧自由基的累積、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等［14］。研究［15］表明，腦組織缺血早期，缺血區(qū)以神經(jīng)細(xì)胞壞死為主，而后期則以細(xì)胞凋亡為主。caspase家族是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，是目前已知的凋亡最后執(zhí)行因子。caspase目前至少發(fā)現(xiàn)14種，類型不同的細(xì)胞可能含有不同的caspase群體，不同的凋亡刺激信號激活的caspase也可能是不同的，但最終都需要通過激活caspase-3來完成凋亡，在所有已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的caspase家族成員中，caspase-3是最為重要的凋亡執(zhí)行者［16～18］。最近研究表明，缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)大量自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，同時線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器也損傷，進(jìn)而能從不同的途徑激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為，caspases-3激活途徑主要有三條，即線粒體/細(xì)胞色素C通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路［19］。腦缺血再灌注后，可以通過其中的一個或多個通路轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號，進(jìn)而激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究顯示，番茄紅素組干預(yù)14 d后caspase-3表達(dá)較低，此為進(jìn)一步探討番茄紅素保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制提供一定的實驗依據(jù)。

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