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    99Tcm標(biāo)記DPZM類右旋糖苷衍生物的淋巴結(jié)攝取

    2014-06-13 01:30:38李洪玉梁積新楊春慧羅洪義孫桂全鄭德強(qiáng)
    同位素 2014年3期
    關(guān)鍵詞:右旋前哨糖苷

    李洪玉,梁積新,楊春慧,羅洪義,莊 玲,陳 陽,孫桂全,鄭德強(qiáng)

    (1.中國原子能科學(xué)研究院 同位素研究所 北京 102413;2.原子高科股份有限公司,北京 102413;3.中國核工業(yè)北京401醫(yī)院,北京 102413)

    早期診斷是控制癌癥的關(guān)鍵手段之一。盡早發(fā)現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶對腫瘤的臨床分期、治療方案均有極大的意義。前哨淋巴結(jié)(SLN)是接受原發(fā)腫瘤淋巴回流的第一個(gè)或第一組淋巴結(jié),是最早可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的特異淋巴結(jié)。前哨淋巴結(jié)活檢(SLNB)是指獲取前哨淋巴結(jié)并進(jìn)行病理學(xué)檢查的技術(shù)手段。采用影像學(xué)手段準(zhǔn)確定位SLN,對于癌癥的診斷和治療具有重要意義[1-2],而SLN的成功檢出率很大程度上取決于顯像劑的選擇。目前臨床上最常用的SLN顯像劑有99Tcm-硫化銻膠體、99Tcm-硫膠體、99Tcm-人血清白蛋白、99Tcm-右旋糖苷等,但顆粒大小不均,每次注入顆粒總數(shù)不易控制。對顯像及活檢時(shí)間要求嚴(yán)格,在注射點(diǎn)高濃集,且大多是非特異性顯像劑,放射性易從SLN向次級淋巴結(jié)(2LN)遷移并使次級淋巴結(jié)顯像[3-5]。

    研究表明[5-7],右旋糖苷分子骨架,可修飾不同的化學(xué)基團(tuán)而表現(xiàn)出不同的分子性質(zhì),另外還具有水溶性較好、低毒性、低免疫原性、在血液中不易降解等優(yōu)點(diǎn)。99Tcm標(biāo)記的甘露糖基化的右旋糖苷可與淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞表面的受體結(jié)合,且其分子大小較為確定,體內(nèi)分布性能較好,在SLN顯像方面具有可觀的應(yīng)用前景。LymphoseekTM(99Tcm-tilmanocept,99Tcm-DTPA-甘露糖基右旋糖苷)作為一種具有受體結(jié)合性質(zhì)的右旋糖苷顯像劑被用于SLN檢測,目前已被美國FDA批準(zhǔn)上市[8]。

    本研究擬用99Tcm標(biāo)記連接有吡唑二胺基團(tuán)的甘露糖基化的右旋糖苷衍生物(Dextran-amine-pyrazole-mannose,DPZM)類化合物,該類化合物可通過兩個(gè)氨基及吡唑環(huán)上的氮原子以NNN鍵與羰基锝進(jìn)行螯合,形成穩(wěn)定的配合物99Tcm-(CO)3-DPZM[9],并對99Tcm-(CO)3-DPZM的生物分布和顯像以及不同注射劑量對正常鼠淋巴結(jié)攝取及體內(nèi)分布的影響進(jìn)行研究。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 主要儀器

    99Mo-99Tcm發(fā)生器:原子高科股份有限公司產(chǎn)品;FH463A自動定標(biāo)器、FT-603型閃爍探頭:北京核儀器廠;CRC 15R放射性活度計(jì):美國CAPINTEC公司;微量注射器:美國 Hamilton公司;高效液相系統(tǒng):ProStar 210型,美國Varian公司;HPLC放射性檢測器:德國Raytest公司;Milli-Q高純水制備系統(tǒng):MILLIPORE公司。

    1.2 主要試劑

    Isolink藥盒:由Mallinckrodt-Tyco公司生產(chǎn)并贈送;右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8:由葡萄牙里斯本技術(shù)大學(xué)化學(xué)系的Isabel Rego Dos Santos教授提供;其他實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為去離子純化水。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動物

    BALB/c小白鼠:30 只,隨機(jī)分組,每組5 只,雌雄兼用,18~22 g;Wistar大鼠:50 只,隨機(jī)分組,每組3~5只,雌雄兼用,180~220 g;清潔級,均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 [99Tcm(CO)3(H2O)3]+的制備

    向Isolink藥盒中加入1 mL 新鮮的Na99TcmO4洗脫液(37~370 MBq),于95 ℃反應(yīng)25~30 min,間歇振蕩,反應(yīng)結(jié)束后,冷卻到室溫,用PBS-HCl緩沖液(0.64 mol/L,pH為2.5)調(diào)節(jié)pH為7.5~8.5。

    2.2 DPZM-4、DPZM-8的99Tcm標(biāo)記[10]

    右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8的化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1。本研究對兩種甘露糖化右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8進(jìn)行了99Tcm標(biāo)記。將1 mL [99Tcm(CO)3(H2O)3]+溶液(37~370 MBq)分別加入到含有400 μg DPZM-4或DPZM-8凍干品的注射劑瓶中,搖勻,于98 ℃反應(yīng)30 min,即制得標(biāo)記物99Tcm-(CO)3-DPZM-4或99Tcm-(CO)3-DPZM-8。

    2.3 99Tcm-(CO)3-DPZM-4與99Tcm-(CO)3-DPZM-8的放化純度

    采用高效液相色譜(HPLC)和放射性快速薄層層析法(ITLC)分析測定標(biāo)記物的放化純度。HPLC分析條件:C18色譜柱(Hypersil ODS2,φ4.6 mm×250 mm),紫外檢測器波長選擇254 nm,流速為1 mL/ min。淋洗液組成:流動相A 為 0.1%三氟乙酸的水溶液(TFA/H2O),流動相B為 0.1%三氟乙酸的甲醇溶液(TFA/MeOH);淋洗梯度:0~4 min,100% A,0 B;4~6 min,100%~75% A,0~25% B;6~17 min,75%~0 A,25%~100% B;17~25 min,0 A,100% B;25~30 min,0~100% A,100%~0% B;30~35 min,100% A,0% B。

    ITLC分析以ITLC-SG層析紙(Gelman Sciences公司產(chǎn)品)為支持體,采用上行色譜法。展開體系1以2-丁酮為展開劑,展開體系2 以V(HCl)∶V(甲醇)=1∶20為展開劑,展開體系3以V(吡啶)∶V(乙酸)∶V(水)=3∶5∶1 為展開劑。

    2.4 99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8的穩(wěn)定性

    將標(biāo)記溶液用生理鹽水稀釋50 倍,于室溫下靜置5 h,用HPLC和ITLC分析放化純度,考察其體外穩(wěn)定性。將99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8由小鼠腳墊皮下注射,給藥后1 h取尿液離心,取上清液進(jìn)行HPLC分析,考察其體內(nèi)穩(wěn)定性。

    2.5 標(biāo)記物在正常鼠體內(nèi)的生物分布

    取健康BALB/c小鼠,隨機(jī)分組,每組 5 只;Wistar大鼠,隨機(jī)分組,每組 5 只。標(biāo)記物溶液用生理鹽水稀釋至放射性濃度為3~37 GBq/L,pH為6~7.5,由正常鼠的右后足腳墊皮下進(jìn)行不同劑量的注射。注射后按摩腳掌30 s以利于藥物吸收,分別于處死前10 min在給藥同側(cè)的腳墊處皮下注入專利藍(lán)溶液,再按摩腳掌30 s。分別于給藥后1、4 h處死,取前哨淋巴結(jié)SLN(即腘窩淋巴結(jié))、次級淋巴結(jié)2LN(即腰淋巴結(jié))、注射點(diǎn)(即右后足)、肝、脾、血等,對肝、脾、血稱重,測量各器官或組織的放射性計(jì)數(shù),計(jì)算放射性攝取率(SLN、2LN、注射點(diǎn)單位為%ID,肝、脾、血的單位為%ID·g-1),并計(jì)算SLN提取率(popliteal extraction rate,PE%),公式如下:

    PE%=[(SLN攝取率-2LN攝取率)/SLN攝取率]×100%

    2.6 正常大鼠體內(nèi)的淋巴結(jié)顯像

    取Wistar大鼠,每組3 只,分為 4 組,于每只右后足腳墊皮下注射不同劑量的標(biāo)記物,分別在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行顯像,顯像前10 min腹腔注射0.8 mL 10%水合氯醛溶液對大鼠進(jìn)行麻醉。顯像數(shù)據(jù)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)128×128 矩陣中進(jìn)行記錄與分析,放大倍數(shù)1,采集放射性計(jì)數(shù)50 K/只。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8的制備及穩(wěn)定性

    對于ITLC分析,在展開體系1中,99TcmO4-在前沿,其余組分在原點(diǎn);在展開體系2 中,99Tcm-(CO)3-DPZM類標(biāo)記物在原點(diǎn),其余組分在前沿;而在展開體系3中,99TcmO4-、 [99Tcm(H2O)3(CO)3]+、99Tcm-(CO)3-DPZM類標(biāo)記物均在前沿。

    99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8及標(biāo)記物稀釋50 倍后的HPLC 譜圖示于圖2(a、b、d、e)。由圖2可知,99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8的放化純度>90%。

    a——99Tcm-(CO)3-DPZM-4;b——99Tcm-(CO)3-DPZM-4 (稀釋50 倍,靜置);c——99Tcm-(CO)3-DPZM-4小鼠代謝的尿樣品;d——99Tcm-(CO)3-DPZM-8;e——99Tcm-(CO)3-DPZM-8 (稀釋50 倍,靜置);f——99Tcm-(CO)3-DPZM-8小鼠代謝的尿樣品.圖2 各種樣品的放射性HPLC分析圖a——99Tcm-(CO)3-DPZM-4;b——99Tcm-(CO)3-DPZM-4 (50 times dilution,on standing);c——the urine sample from 99Tcm-(CO)3-DPZM-4 metabolism in mice;d——99Tcm-(CO)3-DPZM-8;e——99Tcm-(CO)3-DPZM-8 (50 times dilution,on standing);f—— the urine sample from 99Tcm-(CO)3-DPZM-8 metabolism in mice Fig.2 Radio-HPLC profiles of the samples

    由圖2b、e可見,將99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8溶液用生理鹽水稀釋50 倍,于室溫下靜置5 h,標(biāo)記物緩慢分解(放化純度下降約10%),有雜質(zhì)和聚合物(ITLC分析)生成。

    給藥后1 h,尿液的HPLC主峰保留時(shí)間未變(圖2c、f),表明標(biāo)記物在小鼠體內(nèi)未發(fā)生分解,具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性。

    3.2 標(biāo)記物在正常鼠體內(nèi)的生物分布

    將99Tcm-(CO)3-DPZM-4經(jīng)右后足腳墊皮下以注射劑量2 μg/25 μL(注射化學(xué)量/注射體積)注入正常BALB/c小白鼠體內(nèi),研究99Tcm-(CO)3-DPZM-4在正常小鼠體內(nèi)的生物分布,并與99Tcm-(CO)3-DCM(Dextran-S-Cysteine-Mannose)(注射劑量2 μg/25 μL)在正常小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果[11]進(jìn)行對比(見表1)。

    將99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8經(jīng)右后足腳墊皮下分別以注射劑量0.006 μg / 5 μL注入BALB/c小白鼠體內(nèi),得到相同注射劑量下,兩種標(biāo)記物的SLN攝取及體內(nèi)分布影響的實(shí)驗(yàn)對比結(jié)果(見表2)。

    將99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8分別以不同注射劑量0.06 μg / 50 μL、0.05 μg / 10 μL注入Wistar大鼠體內(nèi),分別得到兩種標(biāo)記物在不同注射劑量時(shí)的SLN攝取及體內(nèi)分布的影響(見表3)。

    根據(jù)淋巴結(jié)分布結(jié)果計(jì)算前哨淋巴結(jié)提取率PE%,PE%體現(xiàn)了藥物在前哨淋巴結(jié)滯留的比率,該值越大,說明藥物向下一級淋巴結(jié)遷移的可能性越小。

    表1 99Tcm-(CO)3-DPZM-4與99Tcm-(CO)3-DCM在BALB/c小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果對比

    注:SLN、2LN、注射點(diǎn)攝取率的單位為%ID;肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g-1

    99Tcm-(CO)3-DPZM-4與連接有半胱氨酸基團(tuán)的甘露糖基化的右旋糖苷類衍生物99Tcm-(CO)3-DCM(Dextran-S-Cysteine-Mannose)的生物分布數(shù)據(jù)[11]比較可以看出,99Tcm-(CO)3-DPZM-4的SLN攝取和PE%均比99Tcm-(CO)3-DCM高。主要由于兩種配合物結(jié)構(gòu)上的差異,DCM類化合物含有半胱氨酸基團(tuán)支鏈提供了锝的配位點(diǎn)。

    DPZM類標(biāo)記物顯示了較理想的生物分布特征,而99Tcm-(CO)3-DPZM-8又略優(yōu)于99Tcm-(CO)3-DPZM-4(見表2、表3)。DPZM-4與DPZM-8的化合物結(jié)構(gòu)中每摩爾右旋糖苷螯合的吡唑基-二胺單元的數(shù)量不同,DPZM-4含有4個(gè)吡唑二胺螯合單元,DPZM-8含有8個(gè)吡唑二胺螯合單元,螯合的甘露糖基等基團(tuán)的數(shù)量也略有不同。有研究[9]表明,99Tcm標(biāo)記的DPZM類化合物的穩(wěn)定性隨每摩爾右旋糖苷所螯合的吡唑基-二胺單元的數(shù)量的增加而增加,因此,99Tcm-(CO)3-DPZM-8的穩(wěn)定性要優(yōu)于99Tcm-(CO)3-DPZM-4。

    表2 99Tcm-(CO)3-DPZM-4與99Tcm-(CO)3-DPZM-8在BALB/c小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果對比

    注:SLN、2LN、注射點(diǎn)攝取率的單位為%ID;肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g-1

    表3 不同注射劑量對99Tcm-(CO)3-DPZM-4與99Tcm-(CO)3-DPZM-8生物分布的影響

    注:SLN、2LN、注射點(diǎn)攝取率的單位為%ID;肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g-1

    99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8在Wistar大鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示,注射劑量會影響此類衍生物的體內(nèi)行為,當(dāng)注射劑量 (包括注射化學(xué)量和注射體積) 減少時(shí),SLN的攝取率顯著提高,SLN提取率也相應(yīng)提高。注射體積由50 μL減少到10 μL而注射化學(xué)量接近時(shí)(0.06 μg和0.05 μg),SLN的攝取增加一倍,SLN的提取率也顯著提高,存在顯著差異(P<0.01),但也并不是注射劑量越低越好,注射劑量0.006 μg / 5 μL時(shí)的SLN攝取比0.06 μg / 50 μL和0.05 μg / 10 μL均低,差異顯著(P<0.005)。

    在某些注射劑量及時(shí)相,DPZM化合物SLN 的攝取率并不算太高,但值得注意的是,SLN提取率基本都在70%以上,注射劑量為0.06 μg / 50 μL 時(shí),注射后1 h到4 h,2LN攝取率呈下降趨勢,SLN的提取率隨之增加。

    以上結(jié)果表明,DPZM類標(biāo)記物生物分布較理想,具有較高的SLN攝取率,在肝、脾、血等重要組織或器官中攝取較低,且血清除較快。

    3.3 Wistar大鼠的淋巴結(jié)SPECT顯像

    99Tcm-(CO)3-DPZM-4分別以劑量a:0.5 μg / 50 μL,2.4×106Bq和劑量b:1.3 μg / 50 μL,6.3×106Bq注射入Wistar大鼠的體內(nèi),進(jìn)行SPECT顯像研究,顯像結(jié)果示于圖3。99Tcm-(CO)3-DPZM-8的注射劑量與99Tcm-(CO)3-DPZM-4相同,SPECT顯像結(jié)果示于圖4。

    由圖3、圖4可以看出,顯像結(jié)果與生物分布結(jié)果基本一致,99Tcm-(CO)3-DPZM類化合物具有較高的SLN攝取,給藥后5 min,SLN即已顯影,在隨后的各個(gè)不同時(shí)相,SLN顯像均非常清晰;雖然在注射點(diǎn)仍有較強(qiáng)滯留,但并不影響對SLN的觀察;在肝脾等重要臟器中濃集少,全身放射性本底較低。減少注射劑量可以提高SLN的攝取,有利于得到清晰的顯像效果。

    a—0.5 g / 50 L,2.4×106 Bq;b—1.3 g / 50 L,6.3×106 Bq圖3 99Tcm-(CO)3-DPZM-4在Wistar大鼠體內(nèi)顯像結(jié)果a—0.5 g / 50 L,2.4×106 Bq;b—1.3 g / 50 L,6.3×106 BqFig.3 SPECT images of 99Tcm-(CO)3-DPZM-4 in Wistar rats

    c—0.5 μg / 50 μl,2.4×106 Bq;d—1.3 μg / 50 μl,6.3×106 Bq圖4 99Tcm-(CO)3-DPZM-8在Wistar大鼠體內(nèi)顯像結(jié)果c—0.5 μg / 50 μl,2.4×106 Bq;d—1.3 μg / 50 μl,6.3×106 BqFig.4 SPECT images of 99Tcm-(CO)3-DPZM-8 in Wistar rats

    4 結(jié)論

    用[99Tcm(CO)3(H2O)3]+標(biāo)記DPZM類甘露糖基化的右旋糖苷衍生物DPZM-4與DPZM-8,放化純度均>90%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,99Tcm標(biāo)記的DPZM類右旋糖苷衍生物在正常鼠體內(nèi)可獲得較高的SLN攝取率和SLN提取率,在肝脾等主要器官的攝取低,血清除較快;另外,其生物分布對注射劑量較為敏感,當(dāng)注射劑量(包括注射化學(xué)量和注射體積)減少時(shí),SLN的攝取率和SLN提取率都相應(yīng)提高。顯像實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明適當(dāng)減少99Tcm標(biāo)記的DPZM右旋糖苷衍生物的注射劑量可以提高SLN的顯像效果。綜上所述,99Tcm標(biāo)記的DPZM右旋糖苷衍生物具有優(yōu)良的前哨淋巴結(jié)攝取及體內(nèi)分布性質(zhì),具有應(yīng)用于前哨淋巴結(jié)顯像的潛在價(jià)值,值得進(jìn)一步研究。

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