張曉軍,李云剛,劉 健,張錦明,田嘉禾
(中國人民解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學科,北京 100853)
18F-FDG是目前臨床應用最廣泛的正電子顯像劑,其在腫瘤診斷、分期和療效評價方面有重要作用,但其存在局限性,如:在腦膠質瘤的應用中,低級別膠質瘤與正常大腦白質對18F-FDG的攝取程度無顯著差異,導致18F-FDG PET顯像對低級別膠質瘤檢出率偏低;18F-FDG為非特異性示蹤劑,除惡性腫瘤外,良性病變如炎癥等也可出現(xiàn)高攝取,造成鑒別診斷的困難;同時由于正常大腦皮質高攝取18F-FDG,很難描繪腦腫瘤的邊界及腫瘤浸潤范圍[1]。11C-MET(L-[S-甲基-11C]蛋氨酸)是應用較多的腫瘤氨基酸代謝正電子顯像劑,反映氨基酸的運轉、吸收和惡性腫瘤細胞的代謝活性等,在腦膠質瘤的良惡性鑒別、分期、界定腫瘤浸潤范圍及療效評價等方面有重要的臨床價值[2-4]。11C-MET主要有液相合成法[5]和固相合成法[6],液相合成法是11CH3I直接與L-高胱氨酸硫內酯在丙酮中反應,并經HPLC分離純化,該法制備時間長,放化產率較低,但11C-MET放化純度高;固相合成法是將溶解于NaOH和乙醇混合液中的L-高胱氨酸硫內酯置于Sep Pak Plus C18小柱,11CH3I通過該柱進行烷基化,該法操作簡便,但11C-MET產品放化純度較低,存在大量放射性雜質。本研究利用國產碳多功能模塊,采用固相合成法,通過改變合成條件,利用HPLC分析放射性雜質的成分,探討不同合成條件對11C-MET合成的影響。
HM-20 回旋加速器:日本住友重機械株式會社; PET-CM-3H-IT-Ⅰ碳多功能合成模塊:派特(北京)科技公司;分析型HPLC系統(tǒng),配Bioscan Flow Count放射性檢測器和2487紫外探測器,Sep-Pak C18分析柱:美國Waters公司;1mol/L的氫化鋰鋁四氫呋喃溶液:美國Sigma公司;57%HI(AR):比利時Acros公司;L-高胱氨酸硫內酯(AR):美國RBI公司;無水乙醇(USP級):美國Milennium公司;NaOH(AR):北京化學試劑公司;NaH2PO4·2H2O(AR),H3PO4: 北京化工廠。
11C-MET淋洗液pH3.0,3 mmol/L NaH2PO4溶液;HPLC流動相pH2.5,10 mmol/L NaH2PO4溶液;不同濃度NaOH溶液均為新鮮配制。
利用14N(p,α)11C核反應,在回旋加速器中生產11CO2(靶氣體為含0.51% O2的氮氧混合氣體),用N2作為載氣將11CO2傳到碳多功能合成模塊中浸潤于液氮的LOOP環(huán)內,傳輸完畢后,緩慢下降液氮罐,利用空氣加熱LOOP環(huán),并開啟氮氣,將11CO2傳至反應管中與LiAlH4反應生成11CH3I,加熱并通入N2除去四氫呋喃。加入57% HI,11CH3I水解為11CH3OH并與HI反應生成11CHI3,加熱并通入N2將11CH3I蒸出。
稱量2~3 mg L-高胱氨酸硫內酯前體,加入0.2 mL新鮮配制的0.5 mol/L NaOH和無水乙醇溶液(V∶V=1∶1)中,溶解后裝于C18柱,合成系統(tǒng)圖示于圖1。淋洗瓶裝5 mL pH3.0 3 mmol/L NaH2PO4溶液,產品收集瓶前接C18純化柱和無菌濾膜,所有準備工作在11CO2傳輸前完成。如2.1節(jié)所述,11CH3I從反應管蒸出,經管線直接通過裝有前體的C18柱,常溫下11CH3I與前體在C18柱上反應生成11C-MET,廢氣排入氣囊。待C18處放射性探頭的計數(shù)不再升高時,切換閥門,用3 mmol/L NaH2PO4溶液淋洗反應柱并通過C18純化柱和無菌濾膜,將11C-MET溶液收集于無菌瓶中。
圖1 11C-MET自動化合成系統(tǒng)圖Fig.1 Radiosynthesis of 11C-MET
用分析型HPLC系統(tǒng)分析11C-MET溶液,將11C-MET與標準品12C-MET共進樣,紫外吸收峰設定為206 nm,流動相為pH2.5,10 mmol/L NaH2PO4溶液,流速為1 mL/min。
(1) 在C18柱上僅裝載0.1mL無水乙醇,其余同合成11C-MET,如2.1節(jié)所述,將11CH3I從反應管蒸出,直接吸附于C18柱上,最后用淋洗液將其淋洗下,分析條件同11C-MET。
(2)11CO2可與反應管中LiAlH4反應生成復合鹽,加熱并通入N2除去四氫呋喃,將57%HI更換為H2O,加入反應管中復合鹽水解為11CH3OH,由于甲醇沸點僅為64.7 ℃,加熱將其蒸出,直接通入去離子水中吸附。分析條件同11C-MET。
11CH3I合成如2.1節(jié)所述,前體L-高胱氨酸硫內酯用量為2~3 mg。
(1) NaOH濃度的影響。分別用0.1 mL 2 mol/L 和5 mol/L NaOH溶解前體,乙醇用量不變,則裝載于C18柱上的NaOH濃度分別為1 mol/L和2.5 mol/L。其余合成條件如2.2節(jié)所述,啟動合成程序,并對產物進行HPLC分析,測量11C-MET及雜質的含量。
(2) 溶劑的影響。先用0.1 mL 1 mol/L NaOH溶解2~3 mg前體L-高胱氨酸硫內酯,然后加入0.1 mL丙酮,混勻后裝載于C18柱,其余合成條件如2.2節(jié)所述,啟動合成程序,并對產物進行HPLC分析。
11CH3I是制備11C標記化合物最常用的甲基化試劑,生產方法有兩種,還原自由基碘代法和還原碘化法,還原自由基碘代法合成效率較低,反應需高溫,對系統(tǒng)氣密性要求高,得到的11CH3I比活度較高;還原碘化法因引入了載體而導致11CH3I比活度較低,但操作簡便,易于制備,合成效率高。
國產碳多功能模塊采取11CO2經LiAlH4-HI還原碘化法制備11CH3I,可以自動化制備大部分11C標記化合物。本研究利用碳多功能模塊合成11CH3I,準備過程簡單,合成效率高,11CO2至11CH3I的校正后轉化產率達(70±5)%(EOB)。
早期常用的合成11C-MET方法是11CH3I與L-高胱氨酸硫內酯的直接反應,用-20℃的丙酮溶劑捕獲11CH3I,70 ℃與前體反應,產品經HPLC分離純化,合成時間約為60 min,合成效率約為10%。 經蒸發(fā)純化法[7]、Al2O3/KF固相反應法[8]和C-18柱自動化合成法[6]等的改進,固相合成法已被普遍采用。
11C-MET固相合成法是在常溫下,NaOH將前體L-高胱氨酸硫內酯水解開環(huán),生成的巰基為親核反應位置,無水乙醇吸附11CH3I,提供親核反應的溶劑,收集瓶前的C18純化柱可吸附未反應的11CH3I和脂溶性雜質。本研究中,11C-MET的放化純度較低,僅為(92.2±1.5)%(n=5),而11C-MET溶液的放化純度與合成的條件密切相關。
11C-MET溶液經HPLC分析,得到的放射性峰示于圖2,11C-MET的保留時間為6.5 min,此外有兩個放射性雜質,保留時間分別為15.1 min和19.2 min,該產品的放化純度為93.0%。同時進樣的標準品12C-MET的紫外峰為6.2 min,與產品的放射性峰保留時間一致(二者時間差為管線長度所致)。
圖2 11C-MET HPLC分析放射性圖譜Fig.2 11C-MET quality control of radio-chemical purity with HPLC
11CH3I和11CH3OH HPLC分析條件與11C-MET分析條件相同,11CH3I放射性分析圖譜示于圖3a,直接用乙醇吸附11CH3I,淋洗后進行分析,11CH3I的保留時間為19.5 min,所得的11CH3I溶液中無其余雜質;11CH3OH示于圖3b,將2.1節(jié)自動化合成程序中的HI用H2O替代,反應生成11CH3OH,保留時間為2.7 min,為溶劑峰保留時間??梢?1C-MET產品保留時間為19.2 min的雜質為11CH3I,產品中無11CH3OH,保留時間為15.1 min的雜質可能為前體水解后羧基與11CH3I反應生成11C-4-巰基丁氨酸甲酯。
3.5.1NaOH濃度的影響
不同NaOH濃度對產品及雜質含量的影響列于表1。由表1結果可見,提高NaOH濃度有利于前體L-高胱氨酸硫內酯水解開環(huán),從而利于甲基化反應。但隨著NaOH濃度上升,雜質11C-4-巰基丁氨酸甲酯的含量同樣呈上升趨勢,在NaOH濃度為0.5 mol/L和1 mol/L時,其含量差異沒有統(tǒng)計學意義,但采用2.5 mol/L的NaOH溶解前體時,產品中11C -4-巰基丁氨酸甲酯的含量升高到(7.2±1.2)%,11C-MET放化純度降至(92.1±1.1)%,可見反應中堿濃度過量將促進氨基酸成酯反應并降低產品放化純。因此,使用濃度為1 mol/L的NaOH能使產品放化純度大于95%,而未反應的11CH3I和雜質11C-4-巰基丁氨酸甲酯的含量均較低。
圖3 11CH3I和11CH3OH 的HPLC分析放射性圖譜Fig.3 radiochemical spectrum of 11CH3I and 11CH3OH with HPLC
產品及雜質不同NaOH濃度時的物質含量0.5 mol/L1 mol/L2.5 mol/L11C-MET(92.2±1.5)%(95.7±0.7)%(92.1±1.1)%11C-4-巰基丁氨酸甲酯(3.1±1.4)%(2.2±1.3)%(7.2±1.2)%11CH3I(4.7±1.2)%(2.1±1.0)%(0.5±0.4)%
此外,將前體L-高胱氨酸硫內酯稱量于西林瓶后,NaOH和乙醇的加入順序以及放置時間同樣對前體的開環(huán)水解有影響。L-高胱氨酸硫內酯微溶于乙醇,當加入NaOH和乙醇的混合溶液時,由于二者等體積混溶,相當于NaOH的濃度降低一半,前體溶解速度較慢,水解效率也較差。先加入0.1 mL乙醇,前體幾乎不溶解,再加入0.1 mL NaOH后,前體才逐漸溶解,水解效率較差。先加入NaOH,前體立即溶解,放置5~10 min后再加入乙醇并混勻,可提高前體水解時NaOH的濃度。
3.5.2前體溶劑的影響
用0.1 mL丙酮替代0.1 mL乙醇溶解前體L-高胱氨酸硫內酯,11CH3I傳入到C18柱,被丙酮吸附,繼而與水解前體的巰基發(fā)生親核反應。根據模塊C18柱處放置的放射性探頭計數(shù)可知,隨著11CH3I從反應管被N2載帶至C18柱被丙酮吸附,放射性計數(shù)持續(xù)上升,隨著11CH3I的傳輸,放射性計數(shù)不再增加而進入平臺期,隨后放射性計數(shù)呈快速下降趨勢。由于丙酮極易揮發(fā),在11CH3I進入C18柱的同時,丙酮也從柱子上揮發(fā),當11CH3I進入與丙酮的揮發(fā)導致放射性增減達到平衡時,放射性計數(shù)進入平臺期,隨著丙酮的揮發(fā),C18柱中尚未與前體反應的11CH3I也隨著下降,持續(xù)的氮氣流可將C18柱上的丙酮吹干,產品中檢測不到丙酮的存在,也降低了11C-MET中11CH3I雜質的含量,但隨丙酮揮發(fā)造成的放射性損失將導致產品產率下降近80%,因此采用丙酮溶解前體雖能提高產品放化純,但嚴重降低了產率。而乙醇溶解前體時C18放射性計數(shù)上升之后的平臺期較長,未出現(xiàn)計數(shù)急速下降的現(xiàn)象,放射性損失少,使用5 mL淋洗液洗脫產品后,產品中乙醇含量約為1%。綜合考慮,使用乙醇溶解前體優(yōu)于丙酮。
本研究利用國產碳多功能模塊,采用固相法合成了11C-MET,用HPLC進行產品放化純度分析,結果表明,先用0.1 mL 2 mol/L NaOH溶解前體,再加入0.1 mL無水乙醇,混勻后裝載于C18柱,可提高11C-MET合成產率和放化純度。
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