噪聲暴露對大鼠ABR反應閾及聽皮層谷氨酸脫羧酶67表達的影響*

劉芳利 羅彬 孫敬武 陳浩

γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid ，GABA )是成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為廣泛和重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它與大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動密切相關。既往大量實驗研究[1～3]指出，外周聽器損傷、老年性聾、藥物性聾或耳鳴、噪聲暴露導致聽覺功能變化后,中樞聽覺系統(tǒng)中GABA的功能都會發(fā)生變化。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABA主要來源于谷氨酸的脫羧基作用,其主要限速酶為谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)，GAD有GAD65和GAD67兩個亞型，它們在整個神經(jīng)元中均有分布，GAD65主要分布于神經(jīng)末梢，而GAD67主要位于胞體。大多數(shù)GAD65以不太活躍的脫輔基酶的形式存在[4～6]，而GAD67的輔基則已飽和，在反應中非?；钴S，因此，GAD67作為觀測GABA水平變化的指標更加敏感。

聽皮層是聽覺信息識別、整合和處理的基礎，是中樞聽覺系統(tǒng)的重要組成部分。同時，聽皮層是聽覺傳導通路神經(jīng)元數(shù)量最多的部位之一[7]。因此，與聽覺相關的蛋白質(zhì)在聽皮層的表達量在整個聽覺傳導通路中具有一定的代表性。本研究擬通過觀察噪聲暴露后大鼠聽性腦干反應(ABR)及聽皮層GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)量的變化，初步探討噪聲性聽損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選用2～4月齡、體重200～250 g健康雌性SD大鼠21只為實驗動物(由安徽醫(yī)科大學動物中心提供)，所有動物耳廓反射正常，耳鏡檢查未見明顯異常，無耳毒性藥物史及強噪聲暴露史，實驗前雙耳ABR反應閾在25 dB SPL以內(nèi)。將大鼠隨機分成 0、7、14天組，每組7只，并分別標記，每組大鼠再隨機分為對照組(3只)和暴露組(4只)。

1.2實驗方法

1.2.1噪聲暴露動物模型的建立 所有暴露組動物于清醒狀態(tài)下，在隔聲室內(nèi)置入專用器皿，揚聲器距離大鼠頭部25 cm，雙耳暴露于頻率為4 kHz以上、100 dB SPL白噪聲2小時。聲音由軟件Adobe audition3，Version 3 生成，由MATRX M-640功放系統(tǒng)(杭州奧斯通)控制,CP-75A揚聲器(上海創(chuàng)木)給聲。

1.2.2ABR檢測 所有實驗動物于噪聲暴露前測試ABR，暴露組大鼠再于暴露后0天(0.5～2小時)、第7天、第14天測試ABR，對照組大鼠于各暴露組對應時間分別檢測ABR。各組動物經(jīng)腹腔注射7%的水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后，用TDT系統(tǒng)(包括模塊ED1，PA5，RP2，RA16，美國TDT公司)檢測ABR。測試電極置于兩耳連線水平頭頂正中，接地電極置于大鼠鼻尖，參考電極置于對側(cè)乳突。刺激聲采用click聲，間隔為10次/秒，以開放聲場給聲，揚聲器(ESN SN 3389，美國TDT公司)距離大鼠測試耳外耳門1 cm。濾波范圍100～3 000 Hz，平均疊加1 000次。ABR波形采用美國TDT公司的BioSigRP記錄、分析，以能引出波Ⅲ的最小刺激強度為大鼠ABR反應閾。

1.2.3聽皮層GAD67表達量檢測 各組大鼠分別于暴露后0天(2～4小時內(nèi))、第7天、第14天完成ABR測試后，于水合氯醛深麻醉下，先予PBS 100 ml、 4%多聚甲醛300 ml行心臟灌注后取腦組織，4%多聚甲醛后固定后冰凍切片機(CM 1950，德國Leica)冠狀位連續(xù)切片，片厚30 μm。按照大鼠腦組織立體定位圖譜，每只大鼠隨機取5張含聽皮層腦片進行染色。漂片法行GAD67陽性神經(jīng)元標記，一抗為鼠抗GAD67單克隆抗體(ab26116，英國ABcam)，二抗來自通用型免疫組化試劑盒(SP-9001，北京中杉)。DAB法染色，材料為濃縮型DAB試劑盒(ZLI-9017，北京中杉)。免疫組化圖像用光學顯微鏡(Axioskop 2 plus，德國Zeiss)觀察，用Axiovision圖像系統(tǒng)采集圖像。采集圖像范圍：在含聽皮層的腦片上，嗅溝向上1 mm處，10倍目鏡下，由聽皮層表面向內(nèi)取連續(xù)的3個20倍物鏡視野，觀察GAD67染色陽性神經(jīng)元，用每平方毫米(mm2)聽皮層平均陽性神經(jīng)元數(shù)量表示GAD67水平。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠ABR反應閾 由表1可見，暴露組大鼠噪聲暴露后各時間點ABR反應閾較暴露前均有提高，最高達39.58±8.10 dB SPL，噪聲暴露后0～14天其聽力逐漸恢復，ABR反應閾呈下降趨勢，到第14天時平均為21.25±4.78 dB SPL。暴露后0天(0.5～2小時)暴露組ABR反應閾較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，第7、14天時暴露組與對照組ABR反應閾差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 暴露組與對照組噪聲暴露前后ABR反應閾比較(dB SPL)

注：*與對照組相比，P<0.01

2.2各組聽皮層GAD67表達陽性神經(jīng)元數(shù)量 對照組與暴露組聽皮層中均有GAD67表達陽性的神經(jīng)元(圖1)。各組噪聲暴露后不同時間聽皮層GAD67表達陽性的神經(jīng)元計數(shù)見表2，可見，噪聲暴露后0天(2～4小時)暴露組大鼠聽皮層GAD67表達陽性神經(jīng)元的數(shù)量比對照組明顯升高(P<0.01)，第7天和第14天暴露組GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)量均明顯低于對照組(P<0.05)。

圖1 暴露后不同時間免疫組化染色結果

圖中箭頭示GAD67陽性神經(jīng)元。暴露后0天暴露組GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)目(b)明顯多于對照組(a)，暴露后14天時GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)目(d)低于同期對照組(c)

表2 各組大鼠噪聲暴露后聽皮層GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)量(個/mm2)

注：與對照組比較，*P<0.01,**P<0.05

3 討論

近年來對噪聲暴露的強度、頻率、持續(xù)時間與聽覺器官受損范圍及程度的關系有較多研究，Abbott等[8]將大鼠暴露于10 kHz、100 dB強聲9小時, 觀察到動物的各頻率ABR反應閾均提高25～30 dB SPL，30天后除了10～20 kHz外，其它頻率ABR反應閾均與對照組差異無統(tǒng)計學意義；有研究者將南美栗鼠暴露于中心頻率為4 kHz的倍頻帶、86 dB SPL的噪聲中24小時，暴露后所有動物在4～12 kHz ABR反應閾平均提高43 dB SPL，短時間內(nèi)部分動物ABR反應閾完全恢復，而部分動物某些頻率ABR反應閾在觀察期內(nèi)持續(xù)升高，個體差異明顯[9]；Cherylea[10]將大鼠單耳暴露于中心頻率16 kHz、1/10倍頻、115 dB SPL噪聲中1小時，暴露后所有動物均有ABR反應閾的升高，第8天時除了某些高頻ABR反應閾持續(xù)升高外，低頻基本恢復正常，而到32天時動物各頻率ABR反應閾再次升高；Pouyatos等[11]將大鼠暴露于8 kHz、97 dB SPL的噪聲6小時/天，每周5天，持續(xù) 4 周后動物ABR反應閾平均提高27 dB SPL,短期內(nèi)ABR反應閾未恢復；Turner等[12]給予動物同樣的噪聲暴露后，經(jīng)過4個月的恢復時間各頻率ABR反應閾依然很高；Bauer[13]給予動物16 kHz、105 dB SPL的聲刺激1小時，觀察到7個月后其ABR反應閾仍高于正常，而另有作者觀察到大鼠暴露于中心頻率為17 kHz倍頻帶、116 dB SPL噪聲1小時，16周后聽力完全恢復[14]。上述研究結果的多樣性可能與實驗動物的個體差異、噪聲暴露的性質(zhì)、研究者的不同研究目的有關，但這些研究的共同點是噪聲暴露未導致受試動物聽覺的完全喪失，多數(shù)動物ABR反應閾提高的程度在30 dB SPL以內(nèi)，其中大部分研究證明噪聲暴露導致16 kHz和32 kHz的聽力損失最嚴重。

本研究結果顯示，大鼠暴露于頻率4 kHz以上、100 dB SPL白噪聲中2小時后其ABR反應閾較暴露前明顯提高，這與大部分學者的結果相符；噪聲暴露后14天時，大鼠的ABR反應閾與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明此種性質(zhì)的噪聲導致了大鼠聽力的暫時性閾移。噪聲暴露導致聽覺功能受損的因素很多，而外周聽器中的組織結構及功能變化包括：柱狀體的屈曲膨脹、外毛細胞的靜纖毛與柯替氏膜解耦和[9]、毛細胞靜纖毛的損傷，耳蝸內(nèi)電位的抑制和鄰近傳入神經(jīng)的損傷等。目前，大部分學者認為哺乳動物損失的毛細胞及傳入神經(jīng)損傷后不能自主再生，可能與永久性閾移的發(fā)生相關，而柱狀體的形態(tài)改變、毛細胞與柯替氏膜之間的功能改變以及耳蝸內(nèi)電位的抑制在經(jīng)過短時間的休息后則能恢復正常，這幾種改變可能是暫時性閾移的主要原因，由此推論，本研究中噪聲暴露后大鼠外周聽器的變化可能局限于后幾種結構改變。

大量的研究證明機體承受急性壓力和刺激后將出現(xiàn)GAD67水平的迅速升高。Bowers等[15]發(fā)現(xiàn)急性應激反應將引起神經(jīng)傳導通路中GAD67水平明顯升高，而這種變化同樣出現(xiàn)在大腦皮質(zhì)的局部缺血后[16]。也有學者指出小腦傳入神經(jīng)受刺激后可增加GAD67的mRNA表達，提高了其活性[17]。Abbott等[8]用蛋白質(zhì)印跡和免疫組化兩種方法檢測噪聲暴露結束后大鼠的下丘GAD67的表達，發(fā)現(xiàn)其表達量明顯升高。本研究也顯示噪聲暴露后2～4小時內(nèi)大鼠的聽皮層GAD67表達陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增多。有學者提出GAD67的升高可能與GABA的新陳代謝活躍程度相關[18]，強噪聲刺激會導致下丘中新陳代謝變化，GABA代謝活躍,可能是GAD67在噪聲暴露后早期增多的原因。另外，亦有學者通過免疫組化的方法對貓的視覺系統(tǒng)中GAD表達及分布進行研究，提出對于外界刺激GAD67可能參與了一個相對滯后但更復雜的反應[19]，但不論其機制如何，噪聲暴露后早期GAD67的升高都反映了機體對于外界不良刺激做出的反應。

在Abbott[8]的試驗中，在聲暴露結束后2天下丘中GAD67水平即從升高恢復到正常，而到第30天時僅為對照組的21%。Cherylea[10]觀察到大鼠單耳噪聲暴露后，對側(cè)下丘和背側(cè)耳蝸核中GAD67的表達先輕度升高，隨后降低，并在足夠長時間后恢復到正常水平。除此之外還有很多實驗證明在噪聲暴露后下丘的抑制功能減弱[18,20～23]。從文中結果看，在噪聲暴露后第7天和第14天時，大鼠聽皮層中GAD67的量較對照組明顯降低，與既往試驗中聽覺系統(tǒng)其它部位的抑制功能相關蛋白質(zhì)的變化規(guī)律一致，這可能是由于噪聲暴露造成了外周聽覺系統(tǒng)及神經(jīng)末梢的損害，甚至導致傳入神經(jīng)阻滯和神經(jīng)傳導通路中選擇性的損傷，從而使噪聲暴露停止后興奮性信號傳入減少；機體為達到一種穩(wěn)態(tài)，對抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的釋放也減少，因此，對GAD67需求量也減少，導致觀察部位GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)量的減少；而噪聲暴露后聽覺系統(tǒng)中GABA和GAD67水平的降低，會導致神經(jīng)自發(fā)電活動、同步性和興奮性的增加[24,25]，這可能與噪聲暴露后耳鳴的發(fā)生機理有關。

綜上所述，大鼠于頻率4 kHz以上、100 dB SPL白噪聲中暴露2小時后可出現(xiàn)聽覺功能受損，ABR反應閾發(fā)生了暫時性閾移，且聽皮層GAD67表達陽性的神經(jīng)元數(shù)目先增多后減少，直到暴露后第14天時仍低于對照組，提示聽皮層內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA在噪聲暴露后短時間內(nèi)升高，此后逐漸降低，直至觀察期結束仍處于較低水平，這可能是噪聲性聾、耳鳴及其它聽覺功能異常的發(fā)病機制之一。

4 參考文獻

1 Mossop JE,Wilson MJ,Caspary DM,et al.Down-regulation of inhibition following unilateral deafening[J].Hearing Research,2000,147:183.

2 Schmidt S,Redecker C,Bruehl C,et al.Age-related decline of functional inhibition in rat cortex[J].Neurobiology of Aging,2010,31:504.

3 Xu H,Gong N,Chen L,et al.Sodium salicylate reduces gamma aminobutyric acid-induced current in rat spinal dorsal horn meurons[J].Neuroreport,2005,16:813.

4 Kaufman DL, Houser CR, Tobin AJ. Two forms of gamma-aminobutyric acid synthetic enzyme glutamate decarboxylase have distinct intraneuronal distributions and cofactor interactions[J]. Neurochem, 1991, 56:720.

5 Martin DL, Martin SB, Wu SJ, et al. Cofactor interactions and the regulation of glutamate decarboxylase activity[J]. Neurochem Res, 1991, 16:243.

6 Martin DL, Martin SB, Wu SJ, et al. Regulatory properties of brain glutamate decarboxylase (GAD): the apoenzyme of GAD is present principally as the smaller of two molecular forms of GAD in brain[J]. The Journal of Neuroscience, 1991, 11:2 725.

7 Ouda L, Druga R, Syka J. Distribution of SMI-32-immunoreactive neurons in the central auditory system of the rat[J]. Brain Struct Funct, 2012, 217:19.

8 Abbott SD, Hughes LF, Bauer CA, et al. Detection of glutamate decarboxylase isoforms in rat inferior colliculus following acoustic exposure[J]. Neuroscience, 1999, 93:1 375.

9 Nordmann AS, Bohne BA, Harding GW. Histopathological differences between temporary and permanent threshold shift[J]. Hearing Research, 2000, 139:13.

10 Cherylea JB, John WM, Carl HP. Tracking the expression of excitatory and inhibitory neurotransmission-related proteins and neuroplasticity markers after noise induced hearing loss[J]. PLos One, 2012, 7:e33 272.

11 Pouyatos B, Morel G, Lambert-Xolin A, et al. Consequences of noise- or styrene-induced cochlear damages on glutamate decarboxylase levels in the rat inferior colliculus[J]. Hearing Research, 2004, 189:83.

12 Turner JG, Brozoski TJ, Bauer CA, et al. Gap detection deficits in rats with tinnitus: a potential novel screening tool[J]. Behav Neurosci, 2006, 120:188.

13 Bauer CA, Brozoski TJ. Assessing tinnitus and prospective tinnitus therapeutics using a psychophysical animal mode[J]. Journal of the Association for Research in Otolaryngology,2001,2:54.

14 Wang H, Brozoski TJ, Turner JG, et al. Plasticity at glycinergic synapses in dorsal cochlear nucleus of rats with behavioral evidence of tinnitus[J]. Neuroscience, 2009, 164:747.

15 Bowers G, Cullinan W, Herman JP. Region-specific regulation of glutamic acid decarboxylase (GAD)mRNA expression in central stress circuits[J]. Neurosci,1998,18:5 938.

16 Salin P, Chesselet MF. Expression of GAD (Mr 67,000) and its messenger RNA in basal ganglia and cerebral cortex after ischemic cortical lesions in rats[J]. Expl Neurol,1993, 119:291.

17 Litwak J, Mercugliano M, Chesselet MF, et al. Increased glutamic acid decarboxylase (GAD) mRNA and GAS activity in cerebellar Purkinje cells following lesion-induced increases in cell ring[J]. Neurosci Lett,1990,116:179.

18 Gerken GM, Saunders SS, Paul RE. Hypersensitivity to electrical stimulation of auditory nuclei follows hearing loss in cats[J]. Hear Res, 1984, 13:249.

19 Vardi N, Auerbach P. Specific cell types in cat retina express different forms of glutamic acid decarboxylase[J]. Neurol, 1995, 351:374.

20 Lonsbury-Martin BL, Martin GK. Effects of moderately intense sound on auditory sensitivity in rhesus monkeys: behavioral and neural observations[J]. Neurophysiol,1981, 46:563.

21 Salvi RJ, Wang J. Evidence for rapid functional reorganization in inferior colliculus and cochlear nucleus[M]. In:Syka J,ed.Acoustical Signal Processing in the Central Auditory System. New York:Plenum Press,1999.477～488.

22 Salvi RJ, Saunders SS, Gratton MA, et al. Enhanced evoked response amplitudes in the inferior colliculus of the chinchilla following acoustic trauma[J]. Hear Res, 1990, 50:245.

23 Willott JF, Lu SM. Noise-induced hearing loss can alter neural coding and increase excitability in the central nervous system[J]. Science, 1982, 216:1 331.

24 Gonzalez-Lima F, Cada A. Cytochrome oxidase activity in the auditory system of the mouse: a qualitative and quantitative histochemical study[J]. Neuroscience, 1994, 63:559.

25 Szczepaniak WS, Moller AR. Evidence of neuronal plasticity within the inferior colliculus after noise exposure: a study of evoked potentials in the rat[J]. Electroenceph clin Neurophysiol, 1996, 100:158.