蓖麻醇酸酯生物合成代謝途徑及關(guān)鍵酶研究進(jìn)展

狄建軍 黃鳳蘭 陳永勝 張樹(shù)軍 魏永春

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，通遼 028000)(內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心2，通遼 028000)

蓖麻(RicinuscommunisL.)是起源于非洲的熱帶多年生灌木，屬大戟科的一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值油料植物，在世界上許多的熱帶、亞熱帶和溫帶區(qū)域種植?，F(xiàn)在蓖麻基因組草圖繪制完成，在大戟科成員中尚屬首例[1]。在油料植物中，儲(chǔ)存在植物油體中的主要物質(zhì)是三酰甘油(TAGs)。三酰甘油中脂肪酸的組成決定了植物油的利用價(jià)值。蓖麻籽中三酰甘油含量范圍在39.6%～59.5%，其中含有特殊的羥化脂肪酸——蓖麻油酸(Ricinolic acid)，蓖麻油酸是一種羥基脂肪酸(HFA)，是蓖麻油中的主要成分，約占蓖麻三酰甘油的83.65%～90.00%，平均值達(dá)到88.30%[2]。蓖麻是一種高價(jià)值的油料作物，蓖麻油衍生物被用于肥皂、潤(rùn)滑油、液壓油、剎車(chē)油、涂料、染料、油墨、耐寒塑料、蠟、上光劑、尼龍、藥品和香水制造等，也是生物柴油的一種潛在來(lái)源[1]。鑒于蓖麻作為油脂作物的重要性，尤其是其中的蓖麻油酸具有重要的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)蓖麻醇酸酯合成代謝及關(guān)鍵酶的研究就尤為重要，現(xiàn)就國(guó)內(nèi)外蓖麻醇酸酯代謝及其關(guān)鍵酶的有關(guān)研究進(jìn)展概述如下。

1 蓖麻醇酸酯合成代謝

蓖麻醇酸酯以脂酰甘油形式存在，其中三蓖麻油酰甘油(RRR)約占71%，含2個(gè)蓖麻油酰基的三酰甘油(RR-TAG)約占18%。RR-TAG中，二蓖麻油酰油酰甘油(RRO)約占8.8%，二蓖麻油酰亞油酰甘油(RRL)約占6.6%[3]。

隨著近年來(lái)分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，蓖麻醇酸酯的合成代謝已有一定的進(jìn)展[4-10](如圖1)。TAG的合成主要通過(guò)兩個(gè)途徑，即脂酰-CoA依賴(lài)途徑(Kennedy途徑)和非脂酰-CoA依賴(lài)途徑。油酰-ACP在質(zhì)體中合成，經(jīng)脂酰-ACP硫酯酶(AAT)水解后產(chǎn)生的游離油酸迅速經(jīng)脂酰-CoA合成酶(ACS)催化形成油酰-CoA，同時(shí)被輸出質(zhì)體，進(jìn)入酰基池，作為蓖麻醇酸酯合成的原料。油酰-CoA進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)?；庉嬐緩叫纬杀吐橛王?CoA，即由溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶(LPCAT)轉(zhuǎn)移油酰-CoA的油?；鶊F(tuán)到磷脂酰膽堿(PC)的sn-2位，作為油酰-12-羥化酶(FAH12)的底物，F(xiàn)AH12將sn-2-油?；呋纬蓅n-2-蓖麻油?；Ａ字窤2(PLA2)優(yōu)先從PC的sn-2位上釋放蓖麻油酸，同時(shí)釋放溶血磷脂酰膽堿(LPC)，通過(guò)LPCAT催化再次形成sn-2-油酰-PC重復(fù)作為FAH12的底物。該蓖麻油酸經(jīng)長(zhǎng)鏈脂酰-CoA合成酶(LACS)催化轉(zhuǎn)化為蓖麻油酰-CoA，進(jìn)入?；刈鳛轷；w進(jìn)入脂酰-CoA依賴(lài)途徑，在甘油骨架上連續(xù)發(fā)生?；磻?yīng)生成TAG。在蓖麻油酰-CoA依賴(lài)途徑中，第1個(gè)酰基化反應(yīng)是由甘油-3-RL-DAG，1-蓖麻油酰-2-亞油酰-二酰甘油；RLR，1,3-二蓖麻油酰-2-亞油酰-甘油；RRRL，(12-蓖麻油酰蓖麻油酰)-蓖麻油酰-亞油酰-甘油；RO-DAG，1-蓖麻油酰-2-油酰-二酰甘油；ROR，1,3-二蓖麻油酰-2-油酰-甘油；RRRO，(12-蓖麻油酰蓖麻油酰)-蓖麻油酰-油酰-甘油；PE，磷脂酰乙醇胺；RR-DAG，1,2-二蓖麻油酰-二酰甘油；RRRR，(12-蓖麻油酰蓖麻油酰)-二蓖麻油酰-甘油；MAG，單酰甘油。FAD，油酰脫氫酶；TAGAT，三酰甘油?；D(zhuǎn)移酶；CPT，膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶；EPT，磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)移酶；PAP，磷脂酸磷酸酶；FAH，脂肪酸羥化酶；FAS，脂肪酸合成酶。

圖1 蓖麻醇酸酯代謝途徑

注：點(diǎn)畫(huà)線表示脂酰-CoA依賴(lài)途徑，長(zhǎng)虛線表示非脂酰-CoA依賴(lài)途徑，短虛線表示蓖麻油酸被1、2或3個(gè)多羥脂肪酸替代進(jìn)入三酰甘油，下劃線文字表示本文中介紹的關(guān)鍵酶。

磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)催化脂酰基轉(zhuǎn)移到甘油-3磷酸(G-3-P)sn-1位點(diǎn)上形成溶血磷脂酸(LPA)。第2個(gè)?；D(zhuǎn)移酶，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)催化LPA sn-2位點(diǎn)酰基化產(chǎn)生磷脂酸(PA)。PA在磷脂酸磷酸酶(PAP)作用下去磷酸化產(chǎn)生二酰甘油(DAG)。第3個(gè)?；D(zhuǎn)移酶，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)催化DAG sn-3位點(diǎn)?；磻?yīng)形成TAG。這些?；D(zhuǎn)移酶的脂肪酸特異性決定了TAG中脂肪酸的組成。在非脂酰-CoA依賴(lài)途徑中，可以經(jīng)過(guò)不同路徑形成TAG，一方面磷脂︰二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)直接將蓖麻油酰-PC sn-2位點(diǎn)上的?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移給DAG的sn-3位點(diǎn)，形成TAG，同時(shí)釋放的LPC可再次經(jīng)過(guò)LPCAT進(jìn)入?；庉嬐緩?；另一方面，磷脂酰膽堿二酰甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶(PDCT)將蓖麻油酰-PC上的膽堿磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到油酰-DAG形成蓖麻油酰-DAG和油酰-PC，蓖麻油酰-DAG進(jìn)入合成TAG的途徑；而油酰-PC進(jìn)一步被編輯形成蓖麻油酰-PC，最終進(jìn)入TAG合成途徑；還有一種可能是二酰甘油轉(zhuǎn)酰基酶(DGTA)直接將DAG上的脂?；D(zhuǎn)移到另一DAG上形成TAG，但至今沒(méi)有克隆到該酶基因的cDNA[11]。在蓖麻中發(fā)現(xiàn)多羥脂肪酸及四酰甘油后，蓖麻醇酸酯代謝途徑中增加了含多羥脂肪酸的TAG和四酰甘油的代謝(如圖1)。

2 蓖麻醇酸酯合成代謝關(guān)鍵酶

2.1 脂酰-ACP硫酯酶

脂酰-ACP硫酯酶(AAT)是催化植物質(zhì)體中脂肪酸合成的最后一步，水解脂酰-ACP中間體釋放自由脂肪酸，通過(guò)脂酰-CoA合成酶輸出到細(xì)胞質(zhì)[12]。依據(jù)氨基酸序列和底物特異性不同，這些酶被分為2個(gè)家族：FatA和FatB[13]。FatA存在于所有植物，對(duì)油酰-ACP底物有高特異性。FatB在輸出不飽和脂肪酸中起作用，被分為FatB1和FatB2兩個(gè)子類(lèi)。FatB1，存在于所有的植物，對(duì)長(zhǎng)鏈脂酰-ACP有特異性，特別是棕櫚酰-ACP[14]；FatB2，對(duì)中、短鏈脂酰-ACP有特異性，并且發(fā)現(xiàn)只存在于在種子油中積累C8～C14脂肪酸的植物種類(lèi)中[15]。由于這些硫酯酶決定了輸出質(zhì)體的脂肪酸種類(lèi)，使其成為控制種子油脂肪酸組成的重要靶標(biāo)。目前蓖麻種子的FatA和FatB均被克隆、測(cè)序和鑒定[16]，分別為RcFatA和RcFatB，且均為單拷貝基因。RcFatA和RcFatB的開(kāi)放閱讀框分別編碼371和419個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量分別為42.2ku和46.5ku，等電點(diǎn)分別為6.7和7.0。通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR研究蓖麻不同發(fā)育時(shí)期種子和營(yíng)養(yǎng)組織的AAT基因的表達(dá)水平顯示，此酶受到胚胎發(fā)育的時(shí)序調(diào)控。在蓖麻種子發(fā)育的3～5期RcFatA和RcFatB基因表達(dá)水平最高，與油脂積累時(shí)期相一致[17]，而在其他時(shí)期表達(dá)量顯著降低。與擬南芥不同的是，RcFatB在種子1～4期及所研究的各營(yíng)養(yǎng)組織中的表達(dá)水平比RcFatA要高，而在擬南芥所有研究材料中FatB的表達(dá)水平都比FatA低，且FatB表達(dá)量變化不大。研究RcFatA和RcFatB異源表達(dá)的大腸桿菌脂肪酸組成發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，RcFatA的表達(dá)降低了不飽和脂肪酸的相對(duì)含量，而RcFatB的表達(dá)正好相反，增加了不飽和脂肪酸的相對(duì)含量，因此RcFatA和RcFatB分別作用于不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸，釋放的游離脂肪酸可能進(jìn)入β-氧化途徑降解。利用離子交換層析分別分離純化大腸桿菌表達(dá)的RcFatA和RcFatB后，利用相同濃度的不同脂酰-CoA作為底物，分析他們的底物特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RcFatA對(duì)棕櫚酰-ACP和軟脂酰-ACP催化效率低，而對(duì)油酰-ACP和棕櫚油酰-ACP催化效率高，且對(duì)油酰-ACP底物有最高活性；與其他FatB蛋白對(duì)油酰-ACP催化活性低不同的是，RcFatB對(duì)油酰-ACP有最高催化活性，對(duì)棕櫚酰-ACP雖具有高催化活性，但比其他FatB對(duì)棕櫚酰-ACP的催化活性低。兩個(gè)酶的最大反應(yīng)速度的區(qū)別是：1)RcFatA催化油酰-ACP及棕櫚油酰-ACP的反應(yīng)速度非常大；2)兩者催化飽和脂肪酸的反應(yīng)速度差別不大。對(duì)油酰-ACP作為底物的最大反應(yīng)速度，RcFatA比RcFatB高一個(gè)數(shù)量級(jí)，而對(duì)棕櫚酰-ACP最大反應(yīng)速度，RcFatA是RcFatB的7倍。RcFatA和RcFatB在不同底物情況下，Km值相差不大，但由于最大反應(yīng)速度的不同，其kcat和催化效率(kcat/Km)顯著不同。RcFatA的kcat和催化效率顯著高于其他已研究的FatA，而與此相反的是，RcFatB的kcat小于其他已研究的FatB，但由于具有低Km值，其催化效率相似。提取3～4期蓖麻種子的粗勻漿和可溶性成分，研究硫酯酶活性，分析顯示去除膜蛋白后的可溶性成分有更高的硫酯酶活性，催化油酰-ACP水解的活性最高，而催化棕櫚酰-ACP和軟脂酰-ACP的活性是催化油酰-ACP活性的3.5%，催化棕櫚油酰-ACP的活性是催化油酰-ACP的11%。以上結(jié)果均顯示了RcFatA和RcFatB對(duì)底物的特異性，RcFatA對(duì)油酰-ACP的高催化效率和RcFatB對(duì)油酰-ACP的特異親和力共同作用，使蓖麻中積累更多的蓖麻醇酸酯[16]。

2.2 蓖麻油酰-12-羥化酶

蓖麻油酰-12-羥化酶(FAH12)，將磷脂酰膽堿上sn-2-油?；呋纬蓅n-2-蓖麻油酰基。Van de Loo等[18]通過(guò)差異篩選，從發(fā)育蓖麻胚乳的cDNA文庫(kù)中富集種子特異性克隆，克隆到FAH12全長(zhǎng)cDNA克隆，包括186bp的5’非編碼區(qū)、1161bp的開(kāi)放閱讀框、101bp的3’非編碼區(qū)。開(kāi)放閱讀框編碼387個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)計(jì)分子質(zhì)量為44.4 ku。FAH12序列包括3個(gè)富含組氨酸模序(在殘基108-113，145-149和319-323)，在所有膜結(jié)合脫氫酶中是保守的，并且認(rèn)為在這些酶活性位點(diǎn)的形成是非常重要的。FAH12探針和基因組DNA嚴(yán)格雜交表明，這一克隆在蓖麻中為單拷貝基因[18]。同樣，通過(guò)Blast搜尋整個(gè)蓖麻基因組，也確信FAH12基因?yàn)閱慰截怺1]。

Van de Loo等[18]進(jìn)一步通過(guò)Northern雜交分析了FAH12的表達(dá)模式。FAH12探針與發(fā)育種子中約等于1.6kb的單鏈RNA有雜交信號(hào)，與葉RNA無(wú)任何可見(jiàn)的雜交信號(hào)，但過(guò)度曝光后，在葉中也可以檢測(cè)到同樣大小的條帶，同時(shí)在種子中的雜交帶則非常寬，證明FAH12在種子中相對(duì)特異性表達(dá)。通過(guò)種子cDNA文庫(kù)與FAH12基因嚴(yán)格雜交顯示文庫(kù)中有1/560的克隆是FAH12，也證明FAH12在種子中是特異性強(qiáng)表達(dá)。將CMV 35S啟動(dòng)子后接FAH12 cDNA來(lái)轉(zhuǎn)基因煙草，通過(guò)對(duì)獲得的T2代轉(zhuǎn)基因煙草葉片脂肪酸組成的色譜分析，發(fā)現(xiàn)除了蓖麻油酸之外，脂肪酸的組成在轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，表明此克隆編碼蓖麻油酰羥化酶，即油酰-12-羥化酶。

FAH12的cDNA在轉(zhuǎn)基因擬南芥[19]和轉(zhuǎn)基因亞麻薺[20]中表達(dá)均有HFA的積累。盡管HFA在擬南芥中合成并形成三酰甘油，但與天然存在的蓖麻籽種子油HFA的積累水平相比，積累水平很低。經(jīng)過(guò)許多研究者的努力，在轉(zhuǎn)基因FAH12擬南芥中HFA的含量最高約占種子總脂肪酸的17%[19]，即使使用脂肪酸脫氫酶或脂肪酸延長(zhǎng)酶的缺失突變體表達(dá)FAH12，在擬南芥種子中HFA的含量也小于20%[21]。同樣，在其他工業(yè)用脂肪酸轉(zhuǎn)基因植物中也只積累有限的相應(yīng)脂肪酸[22]，這些不盡人意的結(jié)果說(shuō)明蓖麻籽中積累大量的蓖麻醇酸酯不僅僅是FAH12的作用，同時(shí)也需要其他的酶來(lái)共同促進(jìn)蓖麻醇酸酯的積累。

2.3 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶

二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)是一種跨膜酶，催化脂酰-CoA為底物在sn-1,2-二酰甘油(DAG)sn-3位上?；纬蒚AG，是TAG生物合成的最后一步，被認(rèn)為是很多油料種子中合成TAG的關(guān)鍵酶[23]。有兩種不同的DGAT，即DGAT1和DGAT2，分別屬于不同的基因家族，普遍存在于真核細(xì)胞中。已有報(bào)道，蓖麻中也存在這2種酶[24-26]。

He等[24]在蓖麻種子中克隆到一個(gè)RcDGAT1基因，編碼521個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為59.9 ku，序列全長(zhǎng)為2067bp，包括266bp的5’非編碼區(qū)和235bp的3’非編碼區(qū)，為單拷貝基因。利用RT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)蓖麻種子發(fā)育過(guò)程中RcDGAT1的表達(dá)模式與FAH12表達(dá)模式有很大差別，說(shuō)明此RcDGAT1蛋白水平及酶活性受到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。檢測(cè)RcDGAT1對(duì)DAG的特異性發(fā)現(xiàn)，RcDGAT1優(yōu)先利用RR-DAG形成TAG。提取不同發(fā)育時(shí)期的蓖麻種子，經(jīng)Western雜交后發(fā)現(xiàn)，RcDGAT1蛋白在26DAP時(shí)出現(xiàn)，持續(xù)增長(zhǎng)到47DAP，并且在54DAP時(shí)仍保持較高水平，然后快速降低，在61DAP時(shí)降到很低水平[24]。之前預(yù)測(cè)的RcDGAT1蛋白的分子質(zhì)量為60 ku，但在蓖麻總蛋白提取物中檢測(cè)到的RcDGAT1只有50 ku，顯示RcDGAT1蛋白存在翻譯后加工的過(guò)程，在26DAP和33DAP的微粒體制備物中可以觀察到全長(zhǎng)的RcDGAT1蛋白。RcDGAT1活性在19DAP前幾乎檢測(cè)不到，26DAP時(shí)增長(zhǎng)到顯著水平，40DAP時(shí)達(dá)到最大，之后到54DAP快速降低，與TAG合成相一致，從側(cè)面說(shuō)明RcDGAT1與TAG的合成密切相關(guān)[17]。但RcDGAT1轉(zhuǎn)化到含F(xiàn)AH12基因的擬南芥中并沒(méi)有顯著增加HFA的含量[22]。Kroon等[25]克隆RcDGAT2基因，在基因組中為單拷貝基因，并進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)定量PCR研究了RcDGAT1和RcDGAT2的時(shí)間和組織特異性表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RcDGAT1在葉子和不同時(shí)期的種子中表達(dá)水平相差不多，且最大表達(dá)量在種子10DAP，之后降低；與之顯著不同的是，RcDGAT2的在種子中的表達(dá)與葉子中的表達(dá)相比，最多增大18倍(25DAP)。

FAH12在擬南芥中表達(dá)時(shí)最多產(chǎn)生17%的HFA，Burgal等[22]利用發(fā)育中蓖麻種子建立的cDNA文庫(kù)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，得到幾個(gè)編碼蓖麻種子油代謝途徑相關(guān)酶的cDNA克隆。這些cDNA在FAH12轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的表達(dá)顯示，蓖麻RcDGAT2可使HFA從17%增加到近30%，且與對(duì)照相比，并不影響種子大小及總TAG的積累。RcDGAT2唯一獨(dú)特的明顯特點(diǎn)是N-端12個(gè)殘基的區(qū)域，包含9個(gè)天冬酰胺殘基，其中6個(gè)是連續(xù)的。此區(qū)域的功能重要性，以及對(duì)HFA底物高親和性的決定因素，需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。經(jīng)研究后發(fā)現(xiàn)，RcDGAT2更偏好蓖麻油酰-CoA的酰基供體和包含HFA的的二酰甘油底物，進(jìn)一步在酵母細(xì)胞中表達(dá)RcDGAT2，經(jīng)過(guò)生化分析，證實(shí)了對(duì)含HFA的二酰甘油底物的強(qiáng)烈偏好[22]。酶促分析顯示，重組RcDGAT2對(duì)蓖麻油酰-DAG的偏好比油酰-DAG或亞油酰-DAG高近10倍，RcDGAT2 mRNA在發(fā)育種子各個(gè)時(shí)期中的積累比RcDGAT1均要高，且在種子發(fā)育過(guò)程中表達(dá)先增加后減弱。Li等[27]通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)蓖麻發(fā)育種子中RcDGAT2表達(dá)水平比在不積累獨(dú)特脂肪酸的大豆或擬南芥高的多。這些研究結(jié)果說(shuō)明在蓖麻T(mén)AG生物合成中RcDGAT2對(duì)于蓖麻油酸的積累有非常重要的作用[10]。

2.4 磷脂︰二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶

磷脂︰二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)是一種在種子成熟過(guò)程中不依賴(lài)于脂酰-CoA的TAG合成酶，通過(guò)催化磷脂sn-2位點(diǎn)上的?；D(zhuǎn)移到DAG sn-3位點(diǎn)上形成TAG和LPC[28]。PDAT在酵母中首次報(bào)道，由LOR1編碼[29]。Dahlqvist等[29]利用蓖麻微粒體制備物可以將2-[14C]蓖麻油酰-DAG作為底物形成TAG，證明在發(fā)育的蓖麻微粒體制備物中具有PDAT活性，且對(duì)蓖麻油酸具有高特異性。Kim等[28]從蓖麻中克隆到3個(gè)PDAT基因，分別為RcPDAT1-1、RcPDAT1-2、RcPDAT2，其中RcPDAT1-1和RcPDAT2分別與擬南芥PDAT1-1和PDAT2具有相同的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式，RcPDAT1-1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在其他組織中表達(dá)量較種子中多，兩者分別與FAH12在擬南芥中共表達(dá)，并不增加HFA的含量。RcPDAT2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；而RcPDAT1-2為蓖麻中所特有，在擬南芥中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)基因，由PDAT1進(jìn)化，也定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并與合成蓖麻油酸的FAH12基因有相同的種子表達(dá)優(yōu)勢(shì)，對(duì)HFA具有特異活性，含F(xiàn)AH12基因的擬南芥植株中表達(dá)RcPDAT1-2顯著增加HFA的產(chǎn)量(增加到25%)，同時(shí)減少油酸含量，并且顯著增加種子中TAG的含量，增加粒重，還對(duì)種子發(fā)芽和生長(zhǎng)沒(méi)有有害的影響。進(jìn)一步研究顯示即使FAH12、RcPDAT1-2與RcDGAT2共表達(dá)，與含F(xiàn)AH12和RcPDAT1-2基因的植株相比，并沒(méi)有顯著增加HFA的含量，可能原因是RcPDAT和RcDGAT兩者競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)移HFA到DAG的sn-3位點(diǎn)。van Erp等[30]從cDNA文庫(kù)克隆了RcPDAT1A、RcPDAT1B和RcPDAT2，RcPDAT1A和RcPDAT1B在氨基酸水平上和AtPDAT1的相似性分別為83.8%和87.3%，RcPDAT2和AtPDAT1相似性為73.9%，而和AtPDAT2相似性為78%。使RcPDAT1A與FAH12共表達(dá)，HFA顯著性增加到27%，分析種子發(fā)育過(guò)程中不同酯的脂肪酸組成，顯示TAG中HFA增加的同時(shí)PC中的HFA顯著減少。這些研究說(shuō)明PDAT在蓖麻中積累大量HFA中起到重要作用。van Erp等[30]還進(jìn)行了FAH12、RcPDAT1A和RcDGAT2 3個(gè)基因在擬南芥中的共表達(dá)，結(jié)果顯示在擬南芥種子中HFA含量增加了約1.3%，其原因可能是所用啟動(dòng)子強(qiáng)度不同所導(dǎo)致。由于2篇文獻(xiàn)中對(duì)PDAT的命名差別，對(duì)這些序列進(jìn)行了比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，RcPDAT1-1和RcPDAT1B序列相同，RcPDAT1-2與RcPDAT1A序列99%相同，2篇文獻(xiàn)中的RcPDAT2序列有99%相同。這些結(jié)果表明蓖麻子中特異性的PDAT在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生含HFA的TAG合成中是一個(gè)關(guān)鍵酶。

2.5 磷脂酰膽堿二酰甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶

磷脂酰膽堿二酰甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶(PDCT)，通過(guò)催化DAG和PC間膽堿磷酸頭部的交換而相互變化，使DAG中的油?；M(jìn)入PC，經(jīng)酰基編輯后形成蓖麻油?；?，再次形成DAG。Lu等[31]報(bào)道了PDCT是種子中TAG積累過(guò)程中不飽和脂肪酸合成所必須的酶，在野生型擬南芥中，種子TAG中有49.1%的脂肪酸是多不飽和脂肪酸(亞油酸和亞麻酸)，這些脂肪酸是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分別由脂肪酸脫氫酶FAD2和FAD3催化油酰-PC形成，而在PDCT缺陷的rod1突變體中，這些脂肪酸在TAG中只占29.4%，說(shuō)明有40%的油酸通過(guò)PDCT經(jīng)脂酰-PC形成亞油酸和亞麻酸。在油積累種子組織中rod1基因的高表達(dá)與突變分析及酶學(xué)分析相一致，顯示PDCT催化的PC與DAG的互變?cè)赥AG中富集多不飽和脂肪酸是一種重要的機(jī)制[31]。

在蓖麻中此酶由RcROD1編碼，包含285個(gè)氨基酸殘基，與擬南芥AtROD1序列相比，兩者在N末端和C末端有很大不同，而在中間區(qū)域有70%的同一性，存在與AtROD1相同的跨膜區(qū)和催化位點(diǎn)。雖然兩者在序列上有很大差異，在酵母中表達(dá)AtROD1和RcROD1均有PDCT活性，且RcROD1的活性要比AtROD1高，但兩者對(duì)蓖麻油酰-PC均不顯示有偏好。Hu等[32]研究發(fā)現(xiàn)：第一，與RcPDAT1A表達(dá)系相似，RcROD1表達(dá)系增加TAG中HFA含量，而減少PC中HFA含量，顯示PDCT可以有效的將在PC中產(chǎn)生的HFA轉(zhuǎn)移；第二，RcROD1顯著增加包含HFA(尤其是含2個(gè)和3個(gè)HFA)的TAG含量。在含2個(gè)HFA的TAG中，RcROD1可使sn-2位點(diǎn)含HFA增加，而使sn-1/3位點(diǎn)的HFA降低。由于HFA是由FAH12作用于PC的sn-2位點(diǎn)，超表達(dá)RcROD1可以增強(qiáng)sn-2位點(diǎn)上HFA從PC到DAG的轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生更多的sn-2 HFA-DAG，之后經(jīng)DGAT和PDAT催化在DAG sn-3位點(diǎn)含HFA的TAG，從而產(chǎn)生更多的含HFA的TAG。第三，PDCT增加形成PC的?；鞯耐瑫r(shí)降低PC外途徑的延長(zhǎng)反應(yīng)。通過(guò)減少作為DGAT2底物的羥化脂酰-CoA，快速的PC-DAG互相轉(zhuǎn)變可能對(duì)對(duì)酰基編輯有影響；最后，RcROD1補(bǔ)償了由于表達(dá)FAH12的種子油含量的降低。這些結(jié)果都顯示蓖麻PDCT有效轉(zhuǎn)化PC(特別是羥化脂酰-PC)形成DAG，最終形成TAG[32]。

3 結(jié)束語(yǔ)

蓖麻油是蓖麻油酸的唯一商業(yè)來(lái)源。然而，蓖麻子含有蓖麻毒蛋白、蓖麻堿、過(guò)敏原等毒素，這使得它在種植，收割和加工中存在著危險(xiǎn)，并且種子必需人工收割，不適宜大面積種植。油酰-12-羥化酶的克隆為我們進(jìn)行其它油料作物的分子育種提供了機(jī)會(huì)，但與天然蓖麻相比，在擬南芥中的表達(dá)結(jié)果不理想，種子油中只有低水平蓖麻醇酸酯的積累。有兩個(gè)反應(yīng)能導(dǎo)致蓖麻油酸水平的降低，一是油酰脫氫酶與油酰羥化酶競(jìng)爭(zhēng)油酸庫(kù)，另一個(gè)是蓖麻油酸的延長(zhǎng)反應(yīng)和進(jìn)一步脫氫反應(yīng)。了解蓖麻組裝TAG的過(guò)程及積累近90%的蓖麻油酸的特異性的原因是成功進(jìn)行基因改良作物研究的基礎(chǔ)，同時(shí)，相關(guān)脂類(lèi)的基本代謝途徑的研究也有利于通過(guò)基因工程生產(chǎn)其他的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的脂肪酸。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究，蓖麻醇酸酯在蓖麻種子中的大量積累，是相關(guān)酶對(duì)底物特異性選擇的結(jié)果，現(xiàn)已確定了幾個(gè)關(guān)鍵酶促步驟，包括：AAT[16]、FAH12[18]、DGAT[22]、PDAT[28,30]、PDCT[31]、PLA2[33]、LPCAT[34]等，使得利用遺傳工程手段調(diào)控脂肪酸代謝途徑、改變脂肪酸成分成為可能，為生產(chǎn)無(wú)蓖麻毒蛋白的轉(zhuǎn)基因植物提供可能，同時(shí)為提高植物脂作為大量可再生的低碳資源提供了機(jī)遇。在過(guò)去的許多年里，人們已經(jīng)意識(shí)到在代謝工程中僅對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行操作產(chǎn)生的價(jià)值有限，因此，為達(dá)到最佳的代謝通量應(yīng)著眼于更復(fù)雜的途徑，即同時(shí)涉及多個(gè)基因的過(guò)表達(dá)或抑制[35]。Brown等[36]研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻油酰-CoA并不是發(fā)育中種子胚乳的主要脂酰-CoA，顯示在此組織中代謝通路和酶底物的選擇性對(duì)于三酰甘油合成是非常重要的，通過(guò)對(duì)組織特異性的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析后，獲得一些可能對(duì)RRR合成有重要作用的候選基因，在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)一步表達(dá)這些基因可能使其產(chǎn)生的HFA水平更高。實(shí)踐表明，脂類(lèi)的積累涉及到多條生物合成與分解代謝途徑，不可能通過(guò)特異表達(dá)一種基因來(lái)大幅提高脂類(lèi)含量，而調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，帶動(dòng)代謝途徑中一系列基因超量表達(dá)，可以使脂類(lèi)水平大大提高。最近，在突變擬南芥種子中鑒定出WRI1(Wrinkled 1)轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥WRI1突變種子中TAG含量與野生型相比降低了80%。超表達(dá)WRI1可顯著增加種子TAG含量。在玉米中超表達(dá)WRI1基因，種子含油量提高48%，擬南芥中異源表達(dá)油菜WRI1，種子含油量提高了10～40%，說(shuō)明WRI1基因在提高植物種子含油量育種方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值[36]。Tajima等[37]依據(jù)蓖麻全基因組序列，鑒定了幾個(gè)與WRI1同源的基因，經(jīng)半定量PCR及免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果顯示RcWRI1可能在種子發(fā)育過(guò)程中對(duì)于TAG儲(chǔ)存具有重要作用。Brown等[36]也得到了一些在蓖麻油代謝中有作用的轉(zhuǎn)錄因子，研究這些轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)將有助于揭示這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控蓖麻油合成機(jī)理，同時(shí)對(duì)于進(jìn)一步改良油料作物含油量有重要的理論意義和實(shí)際意義。

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