大米過氧化氫酶活性的2種測(cè)定方法比較

郎 杰 朱銀碩

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050061)

大米在儲(chǔ)藏過程中會(huì)由于自身陳化作用而劣變，降低大米品質(zhì)，大米的儲(chǔ)藏保鮮問題一直倍受重視。檢測(cè)大米等谷物的陳化程度或新鮮度有很多指標(biāo)[1]，酶活性檢測(cè)也是其中之一，例如在糧油檢驗(yàn)中的過氧化氫酶(CAT)活動(dòng)度檢驗(yàn)。

大米儲(chǔ)藏中的代謝會(huì)產(chǎn)生少量過氧化氫使大米脂質(zhì)等成分氧化而品質(zhì)下降。大米中的過氧化氫酶可將產(chǎn)生的過氧化氫分解減輕氧化作用，大米中的過氧化氫酶活性與大米儲(chǔ)藏品質(zhì)有密切關(guān)系[2]。

過氧化氫酶的測(cè)定方法有十幾種[3]，例如氣量法、滴定法、分光光度法、熒光法、電化學(xué)法等。糧油檢驗(yàn)的國家標(biāo)準(zhǔn)一直使用高錳酸鉀滴定法[4-5]。滴定法優(yōu)點(diǎn)是所用設(shè)備簡(jiǎn)單，不需貴重儀器，缺點(diǎn)是測(cè)定中憑肉眼觀測(cè)滴定終點(diǎn)，不可避免地存在較大的人為判斷誤差，以及操作中滴定液流量的控制誤差。以鉬酸銨作為反應(yīng)終止劑和顯色劑對(duì)過氧化氫酶進(jìn)行分光光度法測(cè)定，已廣泛用于動(dòng)物血清測(cè)定及臨床檢驗(yàn)，但在糧谷類測(cè)定中尚未采用。本試驗(yàn)應(yīng)用鉬酸銨比色法與高錳酸鉀滴定法一同測(cè)定大米中過氧化氫酶活性，以探討鉬酸銨法用于糧谷檢驗(yàn)的可行性。同時(shí)也選擇不同產(chǎn)地大米測(cè)定其過氧化氫酶活性是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇6種市售商品大米，分別產(chǎn)自黑龍江的佳木斯和哈爾濱地區(qū)、遼寧盤錦地區(qū)、河北唐山地區(qū)、安徽阜陽地區(qū)和廣東佛山地區(qū)(品種略去)，依次標(biāo)號(hào)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。各稱取100 g測(cè)定水分，將其余大米放置冰箱預(yù)冷(-15 ℃)24 h，粉碎過100目篩(150 μm孔徑)后仍置冰箱備用。

1.2 主要試劑和儀器

過氧化氫(H2O2含量30%)、高錳酸鉀和鉬酸銨等試劑均為分析純。草酸鈉基準(zhǔn)試劑購自阿拉丁試劑有限公司。

UV-752型可見紫外分光光度計(jì)：上海光譜分析儀器廠； Avanti J-25型高速冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 過氧化氫酶提取與測(cè)定

1.3.1 高錳酸鉀滴定法(國標(biāo)法)

過氧化氫酶提取及活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，包括試劑配制和標(biāo)定。

稱取5.00 g(已扣除水分)過篩后的大米粉，加入50.0 mL pH 7.8 PBS(磷酸鹽緩沖液)，研磨振蕩混合后置冰箱預(yù)冷1 h，在冷凍離心機(jī)中6 000 r/min離心15 min，收集上清液得到過氧化氫酶粗提液。提取的粗酶液立即按文獻(xiàn)描述方法進(jìn)行測(cè)定并按文獻(xiàn)[5]公式進(jìn)行計(jì)算。每樣本(大米)分為6組測(cè)定，分2批由2人分別進(jìn)行，每組測(cè)定設(shè)3次重復(fù)。同時(shí)用標(biāo)定的過氧化氫配制0.01%～2.00%的一系列標(biāo)準(zhǔn)液滴定做高錳酸鉀滴曲線,以檢驗(yàn)不同濃度與滴定液體積的線性關(guān)系。

1.3.2 鉬酸銨比色法(鉬酸銨法)

過氧化氫酶提取與前項(xiàng)相同。測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[6]略作改動(dòng)。底物溶液為60 mmol/LH2O2(用高錳酸鉀標(biāo)定)，PBS為60 mmol/L的Na2HPO4和NaH2PO4(pH 7.8)。

3組試管分別標(biāo)記為空白管1、空白管2和測(cè)試管，均加入5 mL 60 mmol/L過氧化氫溶液，再向空白管1中加入5 mL 50 mmol/L鉬酸銨溶液和3 mL煮沸的提取酶液；空白管2中加入5 mL 50 mmol/L鉬酸銨溶液和3 mL PBS；測(cè)試管中加入3 mL 提取酶液，搖勻后在30 ℃下水浴15 min，然后立即加入5 mL 50 mmol/L鉬酸銨溶液搖勻。與前2管一起用分光光度計(jì)在410 nm處測(cè)定吸光度。以每分鐘分解1 μmol過氧化氫為1個(gè)酶活單位(U)，參照文獻(xiàn)[6]中公式計(jì)算酶活性。然后換算為酶活動(dòng)度(mgH2O2/g)。

式中:分子項(xiàng)60為反應(yīng)液H2O2濃度/μmol，5為反應(yīng)液量/mL，50為提取酶液量/mL；分母項(xiàng)中3為待測(cè)酶液量/mL，5為大米樣品質(zhì)量/g，15為反應(yīng)時(shí)間/min。

每樣本(大米)分為6組測(cè)定，每組測(cè)定設(shè)3次重復(fù)。再由不同試驗(yàn)者重復(fù)測(cè)定1次。同時(shí)用標(biāo)定的過氧化氫配制0.01%～2.00%的一系列標(biāo)準(zhǔn)液再按空白管2方法做鉬酸銨吸光曲線,以檢驗(yàn)不同濃度與吸光度的線性關(guān)系。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)定過氫化氫的高錳酸鉀滴定曲線和鉬酸銨吸光曲線比較

用標(biāo)定的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的過氧化氫(0.01%、0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%、2.00%)分別進(jìn)行高錳酸鉀滴定和鉬酸銨比色做標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),2條曲線幾乎完全平行，高錳酸鉀滴定體積與過氧化氫濃度的相關(guān)性為R2=0.999(r=0.999**，P<0.01)，鉬酸銨比色的吸光度與過氧化氫濃度的相關(guān)性為R2=0.998 6(r=0.999**，P<0.01)，都達(dá)到極顯著相關(guān)，表明二者在測(cè)定過氧化氫的線性關(guān)系和濃度適應(yīng)范圍上幾乎是相同的。

圖1 標(biāo)定過氧化氫的高錳酸鉀滴定曲線和鉬酸吸光曲線比較

表1 高錳酸鉀滴定法測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶活動(dòng)度(mgH2O2/g)分析

2.2高錳酸鉀滴定法對(duì)6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶活動(dòng)度的測(cè)定及分析

高錳酸鉀滴定法測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地大米中過氧化氫酶活動(dòng)度平均10.22 mgH2O2/g，活動(dòng)度變化約在8.05～12.02 mgH2O2/g間，產(chǎn)地偏北方地區(qū)樣本相對(duì)略高于偏南方地區(qū)樣本。2批測(cè)定的均值差與均數(shù)之比未超過文獻(xiàn)[5]的國標(biāo)誤差限度，符合測(cè)定要求。2批測(cè)定結(jié)果為顯著相關(guān)(表2)。但從方差分析表中可以看出，誤差一項(xiàng)明顯較高，使產(chǎn)地因素差異不夠顯著。

2.3鉬酸銨比色法對(duì)6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶活動(dòng)的測(cè)定及分析

鉬酸銨法測(cè)定結(jié)果表明，6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶活動(dòng)度平均為11.66，活動(dòng)度變化在9.05～13.88 mgH2O2/g 之間，大米產(chǎn)地活動(dòng)度趨勢(shì)與高錳酸鉀法測(cè)定一致，但各樣本測(cè)定值均略高于高錳酸鉀法。2批測(cè)定的均值差與均數(shù)之比小于高錳酸法測(cè)定法，同樣未超過文獻(xiàn)[5]的國標(biāo)誤差限度，符合測(cè)定要求。2批測(cè)定結(jié)果為極顯著相關(guān)。從方差分析表中可以看出，誤差一項(xiàng)的變異遠(yuǎn)小于產(chǎn)地因素變異，略大于測(cè)定組因素。與高錳酸鉀法相比，用鉬酸銨法測(cè)定產(chǎn)地因素差異較為顯著。

2.4 2種方法測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶活性的比較分析

為比較2種測(cè)定方法的差異，將2種方法的測(cè)定結(jié)果列于表5。

表2 高錳酸鉀滴定法測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶方差分析表

表3 鉬酸銨比色法測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶活動(dòng)度(mgH2O2/g)分析

表4 鉬酸銨法測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶方差分析表

表5 2種方法測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地大米過氧化氫酶活性比較

注：酶活動(dòng)度均數(shù)為6次測(cè)定平均值；測(cè)定組內(nèi)活動(dòng)度差值為同一樣本在不同測(cè)定組中的最小值與最大值差；表5中均數(shù)差異顯著比較為L(zhǎng)SD(P<0.05)，字母不重復(fù)者間為差異顯著；鉬酸銨法1和2表示2批重復(fù)性測(cè)定。

從過氧化氫酶活動(dòng)度的測(cè)定結(jié)果看，鉬酸銨法測(cè)定的6個(gè)產(chǎn)地樣本平均數(shù)高于高錳酸鉀滴定法1.44個(gè)活動(dòng)度。從測(cè)定的穩(wěn)定性方面，鉬酸銨法明顯好于高錳酸鉀法，高錳酸鉀法測(cè)定組內(nèi)平均差值為5.78，鉬酸銨法為3.44，雖然二者都存在波動(dòng)，但鉬酸銨法的波動(dòng)相對(duì)較小。由前面的方差分析表中也可以看到，高錳酸鉀法的誤差大于鉬酸銨法。由此，2種方法對(duì)多個(gè)樣本測(cè)定結(jié)果的差異顯著性比較時(shí)，鉬酸銨法更能反映不同樣本間的差異。如表5中的不同產(chǎn)地樣本過氧化氫酶活動(dòng)度差異顯著性的成對(duì)比較中，高錳酸鉀法只出現(xiàn)5對(duì)差異顯著，鉬酸銨法則出現(xiàn)11對(duì)差異顯著。對(duì)于比較不同樣本的過氧化氫酶活動(dòng)度，鉬酸銨法更為適合。鉬酸銨法對(duì)6個(gè)產(chǎn)地樣品的過氧化氫酶活動(dòng)度的2批測(cè)定(表5中的B和C)與高錳酸鉀法測(cè)定(表5中的A)的相關(guān)性為極顯著。

3 討論

鉬酸銨法目前多用于測(cè)定動(dòng)物血清中過氧化氫酶。用高錳酸鉀滴定法測(cè)定大米過氧化氫酶活動(dòng)度只限于糧油檢驗(yàn)報(bào)告中，在專業(yè)性學(xué)術(shù)刊物中鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)應(yīng)用2種方法對(duì)大米過氧化氫酶進(jìn)行測(cè)定比較，測(cè)定數(shù)據(jù)表明鉬酸銨法明顯優(yōu)于目前國家標(biāo)準(zhǔn)中的高錳酸鉀滴定法。高錳酸鉀法測(cè)定數(shù)據(jù)波動(dòng)相對(duì)較大，原因主要是操作中滴定液的流量憑手感控制以及終點(diǎn)顏色變化憑肉眼觀察，容易導(dǎo)致誤差產(chǎn)生。其次，高錳酸鉀滴定雖是等當(dāng)量反應(yīng)，但受反應(yīng)液酸度影響很大也會(huì)引起誤差。與高錳酸鉀滴定法相比較，鉬酸銨法穩(wěn)定性較好，操作相對(duì)較為簡(jiǎn)單，可大批量測(cè)定，由此認(rèn)為糧谷類過氧化氫酶檢驗(yàn)采用鉬酸銨法取代國家標(biāo)準(zhǔn)中的高錳酸鉀滴定較為可行。但鉬酸銨比色法要作為標(biāo)準(zhǔn)方法用于糧谷檢測(cè)，許多操作細(xì)節(jié)及各項(xiàng)反應(yīng)條件設(shè)置還有待于進(jìn)一步優(yōu)化或改進(jìn)。

至于本試驗(yàn)測(cè)定中鉬酸銨法測(cè)定值略高于高錳酸鉀滴定法，推測(cè)其原因可能在于酶提取液中的微量淀粉等物質(zhì)在保溫反應(yīng)中顆粒膨大增加少量光吸收，尤其是作為空白的煮沸酶液，這可嘗試通過減少酶提取液用量，以及對(duì)酶提取液嚴(yán)格過濾解決?；蛞部赡苓€有其他原因，這有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)也嘗試了用直接紫外分光光度法和重鉻酸鉀比色法測(cè)定大米的過氧化氫酶(數(shù)據(jù)未列出)，但其穩(wěn)定性和適用性均不強(qiáng)于高錳酸鉀滴定法。還有一些利用過氧化氫與喹啉、魯米諾、聯(lián)苯胺等發(fā)色物質(zhì)反應(yīng)生成有色物質(zhì)進(jìn)行比色測(cè)定的方法，例如聯(lián)吡啶或喹啉等可與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生熒光，過氧化氫酶可分解H2O2減少熒光產(chǎn)生，由此檢測(cè)過氧化氫酶活性[7]；魯米諾可受過氧化氫酶催化H2O2分解時(shí)產(chǎn)生的氧自由基激發(fā)而發(fā)光，測(cè)定發(fā)光值的增加可反映CAT活性[8]。這類方法雖反應(yīng)靈敏，但對(duì)測(cè)定條件及反應(yīng)時(shí)間要求嚴(yán)格，控制不當(dāng)則穩(wěn)定性明顯降低，測(cè)定過程較難掌握。

過氧化氫酶活性在國標(biāo)GB/T 5522—2008中用過氧化氫酶活動(dòng)度表示有待商榷。從過氧化氫酶活動(dòng)度的單位mgH2O2/g來看，是表示每克樣品中能催化過氧化氫分解的質(zhì)量(mg)，實(shí)際仍是表達(dá)的酶活性大小的概念。國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUB,現(xiàn)名為國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟 IUBMB)酶學(xué)委員會(huì)曾于1961年規(guī)定每分鐘催化1 μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為1個(gè)國際單位(IU或U)，雖已廣泛使用但并未被國際計(jì)量委員會(huì)(CIPM)承認(rèn)為SI單位。國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)與國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)推薦使用的酶活性單位katal(符號(hào)kat)于1999年被國際計(jì)量大會(huì)(CGPM)批準(zhǔn)，也尚未獲得國際計(jì)量委員會(huì)承認(rèn)，但其成為新的國際單位制(SI)基本已成事實(shí)。所以酶的活性單位傾向于使用kat(1 kat=1 mol/s)[9-10]。質(zhì)量催化活性單位應(yīng)為kat/kg或其分?jǐn)?shù)單位[11]。kat和U的關(guān)系為：1U=16.67×10-9kat =16.67×10-6mkat =16.67×10-3μkat =16.67 nkat。

盡管酶的活動(dòng)度、酶的活性單位U (IU)及kat都未納入我國的國際單位制標(biāo)準(zhǔn)GB 3100—1993中，但從3個(gè)單位的比較看，kat單位相對(duì)更規(guī)范一些。我國在某些出版行業(yè)已要求酶的活性單位使用kat[12]。因此建議過氧化氫酶檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中改用kat較好，更便于與其他研究結(jié)果進(jìn)行比較。

4 結(jié)論

通過試驗(yàn)中鉬酸銨法和高錳酸鉀滴定法對(duì)不同產(chǎn)地大米樣本過氧化氫酶活動(dòng)度測(cè)定的比較和分析，認(rèn)為鉬酸銨法在測(cè)定糧谷過氧化氫酶方面優(yōu)于現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中的高錳酸鉀滴定法，其優(yōu)點(diǎn)在于測(cè)定中體現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，重復(fù)測(cè)定間波動(dòng)性明顯低于高錳酸鉀法，因此在比較不同樣本過氧化氫酶活性差異具有相對(duì)較高的分辨力；由于鉬酸銨法比色測(cè)定較為簡(jiǎn)單，可進(jìn)行大批量樣本測(cè)定。另外由于鉬酸銨法所需試劑少，操作簡(jiǎn)便，容易掌握，而高錳酸鉀法配制試劑時(shí)間長(zhǎng)而麻煩，滴定操作也不便于大批量樣本測(cè)定，所以鉬酸銨法適用性更強(qiáng)。通過以上分析認(rèn)為鉬酸銨法更適用于糧油檢驗(yàn)中的過氧化氫酶檢測(cè)。

[1]祁明霞,林艷,解彬.大米新鮮度及其影響因素的研究[J].啤酒科技,2007(9):23-29

[2]宋偉,陳瑞,劉璐.不同儲(chǔ)藏條件下糙米中過氧化氫酶活動(dòng)度的變化規(guī)律[J].糧食儲(chǔ)藏,2010,39 (6):28-33

[3]朱星曄,韓育梅.過氧化氫酶的檢測(cè)方法及其在大米貯藏中的應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2010(8):103-105

[6]程魯京,孟澤.鉬酸銨顯色法測(cè)定血清過氧化氫酶[J].臨床檢驗(yàn)雜志,1994,12(1):6-8

[7]薛細(xì)平,陳榮,趙一兵,等.過氧化氫酶的熒光法測(cè)定及其在海洋環(huán)境污染評(píng)估中的應(yīng)用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,42(1):83-86

[8]譚亞芳,孫樹秦,賴炳森.一種優(yōu)化的測(cè)定過氧化氫酶活性的方法[J].生物技術(shù),2001,11(5):39-41

[9]秦社彩.生物農(nóng)醫(yī)領(lǐng)域中的酶活性單位[J].科技與出版,1999(2):24-25

[10]鐘傳欣.酶活力的量和單位的用法探討[J].貴州教育學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,19(12):73-74

[11]何揚(yáng)舉,董邦權(quán),潘伯榮.kat是酶活性的SI單位[J].編輯學(xué)報(bào),2004,16(1):30

[12]中國高等學(xué)校自然科學(xué)學(xué)報(bào)研究會(huì)編.中國高等學(xué)校自然科學(xué)學(xué)報(bào)編排規(guī)范[M].北京:北京工業(yè)大學(xué)出版社,1993:54.