雞傳染性支氣管炎強毒分離株遺傳進化分析和免疫保護試驗

胡北俠，黃慶華，楊少華，許傳田 ，張 偉，張 琳，王莉莉，黃艷艷，張秀美

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南250100；2.山東省微山畜牧局，微山277600）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitious，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitious virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病。IBV基因組為單股正鏈RNA，長約27.6 kb，編碼4種結構蛋白：即纖突蛋白（spike protein，S）、基質(zhì)蛋白（membrane protein，M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）和膜蛋白（envelope，E）[1,2]。S蛋白位于IBV粒子的表面，由S1和S2兩個亞單位組成，S1蛋白是血清中和抗體的主要誘導者，并與病毒的組織嗜性和免疫保護密切相關[2,3]。

疫苗免疫是雞傳染性支氣管炎的主要防控措施之一，但由于IBV很容易通過基因突變、插入、缺失和重組發(fā)生變異，給此病的免疫預防不斷帶來新的挑戰(zhàn)。近年來，IBV對山東養(yǎng)雞業(yè)（特別是商品肉雞）的危害日益嚴重。雖然H120、MA5和491等多種IB弱毒活疫苗用于該病的免疫預防，臨床上仍然經(jīng)常發(fā)生IBV的感染，造成巨大經(jīng)濟損失。本實驗室2012年從山東省發(fā)病雞群分離鑒定了1個IBV強毒株SDIB821/2012，為了明確該流行株的分子特征，對其S1基因進行了測序和遺傳進化分析。此外，選擇3個常用IB弱毒活疫苗進行了免疫保護試驗，為明確雞群不斷發(fā)生IB免疫失敗的原因和有效防控本病提供科學的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒、SPF雞胚和SPF雞 IBV分離株SDIB821/2012從山東省某商品肉雞群分離，該雞群于7日齡用IB活疫苗H120滴鼻、點眼免疫，10日齡左右雞群開始發(fā)病，主要病理變化為氣管出血、腎臟腫大和心臟等內(nèi)臟器官表面大量尿酸鹽沉積，累計死淘率60%左右。動物回歸試驗結果顯示，SDIB821/2012（以105.0EID50滴鼻）對14日齡SPF雞致死率60%，病死雞病理變化與臨床發(fā)病雞群基本一致。

9～11日齡SPF雞胚、3日齡SPF雞購自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞研究中心。SPF雞于隔離器內(nèi)飼養(yǎng)，飼料和飲水均經(jīng)無菌處理。

1.2 雞傳染性支氣管炎疫苗 雞傳染性支氣管炎弱毒活疫苗491和MA5均為Nobillis公司生產(chǎn)；H120 為國內(nèi)某生物制品廠生產(chǎn)。

1.3 引物、菌種、質(zhì)粒和試劑 S1基因引物序列參考文獻[4]，由上海生物工程有限公司合成；pEASY-T1載體購自北京全式金公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、Trizol和Gel Extraction Kit均購自大連寶生物工程有限公司；DH5α菌種為本實驗室保存；IBV抗體ELISA檢測試劑盒為IDEXX公司生產(chǎn)；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.4 IBV分離株S1基因的擴增、克隆與測序 按TRIzol試劑（Invitrogen）說明書提取病毒基因組RNA。應用RT-PCR 方法，擴增病毒S1基因。將回收后的PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體進行連接反應后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)菌液PCR 鑒定后，委托北京六和華大基因科技股份有限公司測序。

1.5 IBV分離株S1基因核苷酸序列的比較分析 利用lasergene7.0和MEGA 4.1生物軟件，將SDIB821/2012的S1基因分別與本實驗室分離的IBV流行株和GenBank中國內(nèi)外IBV參考株進行同源性比較和系統(tǒng)進化分析。

1.6 IB弱毒活疫苗對SDIB821/2012的免疫保護試驗

1.6.1 試驗雞分組與免疫 3日齡SPF雞60只，隨機分成4組（A、B、C、D），每組15只。A、B和C組為免疫組，于3日齡通過滴鼻、點眼途徑免疫IB弱毒活疫苗（1羽份/只），D組為對照組，以相同劑量無菌0.01 mol/L PBS緩沖液（pH7.2）滴鼻、點眼。

1.6.2 試驗雞攻毒 免疫后14 d，免疫組和對照組試驗雞分別用IBV分離株SDIB821/2012攻毒，攻毒劑量為105EID50/只，攻毒方式為滴鼻。攻毒前各組試驗雞分別隨機取3只撲殺，采集氣管組織和泄殖腔棉拭進行疫苗株排毒檢測，同時采集血清分別檢測ELISA抗體和針對SDIB821/2012的中和抗體。

1.6.3 試驗雞臨床癥狀及發(fā)病死亡情況 攻毒后共觀察14 d，每天觀察試驗雞食欲、精神、是否有呼吸道等臨床癥狀，病死雞剖檢觀察主要病理變化。記錄各組試驗雞發(fā)病死亡情況。

1.6.4 試驗雞攻毒后排毒檢測 分別于攻毒后3、5、7 d對各組試驗雞采集喉頭和泄殖腔棉拭，接種SPF雞胚，進行病毒分離，每組每次采3只。對病死雞取氣管、肺臟和腎臟組織進行病毒分離，每組累計取3只（若無試驗雞死亡，于d7撲殺3只取樣）。

表1 試驗雞分組和攻毒后發(fā)病死亡情況Table 1 Experiment design and results of vaccination-challenge test

2 結果

2.1 分離株SDIB821/2012S1基因遺傳進化分析和同源性比較 SDIB821/2012毒株S1基因長度為1620 bp，編碼540個氨基酸（含裂解位點）。遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，包括SDIB821/2012在內(nèi)的 13個山東IBV流行株（黑色三角形標注）與國內(nèi)外參考株和疫苗株形成4個進化分支（圖1），SDIB821/2012與12個山東分離株均屬于以參考株QXIBV為代表的基因Ⅰ型（QX-like）?；颌蛐桶?91疫苗株和3個參考株，基因Ⅲ型包括疫苗株H120、2886、MA5和M41?；颌粜桶?個國內(nèi)分離株，其中YN株是一個IBV強毒株，對30日齡SPF雞致死率為65%[5]。S1基因序列比較結果顯示SDIB821/2012與同屬于基因Ⅰ型的參考株核苷酸和氨基酸同源性分別為93.4%～99.3%和91.6%～98.5%，與疫苗株H120和MA5同源性均為76.9%和74.8%，與491同源性為78.4%和77.6%，與強毒株YN同源性為80.7%和80.4%。

2.2 試驗雞免疫后14 d抗體滴度與氣管、泄殖腔疫苗株病毒檢測情況 各免疫組試驗雞于攻毒之前每組取3只，撲殺后取氣管組織、泄殖腔棉拭和血清樣品進行病毒和抗體檢測。結果顯示各組試驗雞免疫后14 d，氣管組織和泄殖腔棉拭存在不同程度排毒，說明IB疫苗免疫后14 d仍然在雞群中存在?？贵w檢測結果顯示各組試驗雞免疫后14 d ELISA抗體和針對SDIB821/2012的中和抗體均為陰性。對照組（D組）氣管和泄殖腔病毒檢測陰性，ELISA和中和抗體陰性（表2）。

2.3 試驗雞攻毒后臨床癥狀及發(fā)病死亡情況 試驗雞攻毒后d2個別雞出現(xiàn)精神沉郁，d3開始出現(xiàn)死亡，d4～6達死亡高峰，病死雞表現(xiàn)氣管出血、粘液，腎臟花斑腎，肝臟、肺臟充血、部分病死雞心臟表面有白色尿酸鹽（圖略），與臨床發(fā)病雞群病理變化基本相同。d7存活雞精神基本恢復。各組試驗雞發(fā)病死亡情況見表1。

2.4 試驗雞攻毒后喉頭和泄殖腔棉拭以及內(nèi)臟組織病毒分離結果 對免疫組、對照組d3、5、7試驗雞喉頭和泄殖腔棉拭樣品以及病死雞氣管、腎臟和肺臟組織樣品進行病毒分離。檢測結果顯示，491、MA5和H120免疫組和對照組喉頭、泄殖腔棉拭和內(nèi)臟組織病毒均可檢測到病毒（表3）。

圖1 IBV分離株SDIB821/2012與參考株 S1基因（1611 bp）遺傳進化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of SDIB821/2012 and reference strains based on S1 gene sequences using neighbor-joining method ( Mega 4.1)

表2 試驗雞免疫后14 d疫苗株氣管、泄殖腔排毒和抗體檢測結果Table 2 Shedding of IBV and antibody detection in trachea and cloacal of chicdens at 14 days post vaccination

表3 試驗雞攻毒后喉頭、泄殖腔棉拭和內(nèi)臟器官排毒檢測結果Table 3 The result of IBV shedding in laryngeal, cloacal and some internal organs of chickens challenged with SDIB821/2012

3 討論

近年來，IBV對山東省商品肉雞的危害越來越嚴重。SDIB821/2012是本實驗室2012年從山東省某發(fā)病的商品肉雞分離的毒株。免疫保護試驗中對照組17日齡SPF雞用SDIB821/2012攻毒后2 d開始出現(xiàn)精神沉郁，3～6 d死亡率約為67%（8/12），且病死雞臨床癥狀和病理變化與臨床發(fā)病雞群基本一致，表明SDIB821/2012致病性較強。

遺傳進化分析結果顯示，SDIB821/2012屬于以QXIBV為代表的基因Ⅰ型。此類IBV于1997年首次在我國青島市發(fā)病雞群中分離，現(xiàn)在是國內(nèi)IBV流行株的主要基因型[6,7]，而且亞洲和歐洲多個國家均有此類毒株的流行[8-10]，表明此類IBV毒株具有廣泛的傳播能力，應引起足夠的關注。YN毒株也是一個IBV強毒株，2005年從云南省某發(fā)病雞群中分離，研究發(fā)現(xiàn)YN對30日齡SPF雞的致死率為65%[5]。遺傳進化分析顯示YN屬于基因Ⅳ型，與SDIB821/2012遺傳距離較遠，S1基因核苷酸同源性為80.7%，表明二者具有不同的進化來源。

IB疫苗對SDIB821/2012免疫保護試驗結果顯示，根據(jù)攻毒后各組試驗雞發(fā)病死亡情況，491對流行株SDIB821/2012免疫保護率最高（90%），MA5和H120對SDIB821/2012保護率僅為33%和40%。國內(nèi)外相關研究也證明H120活疫苗對QX基因型流行株免疫效果不理想[11,12]，與本研究結果相符。各免疫組試驗雞攻毒后喉頭、泄殖腔棉拭以及氣管、腎臟和肺臟組織均可檢測到病毒。而國外學者Terregino等[3]研究發(fā)現(xiàn)，SPF雞用IB活疫苗491和MA5分別于1日齡和14日齡免疫后能夠抵抗QX基因型IBV流行株的攻擊，免疫雞群攻毒后沒有明顯的臨床癥狀，氣管和腎臟組織也檢測不到病毒。造成本研究結果與之差異的原因可能在于免疫程序、攻毒毒株和劑量不同，有必要通過相關試驗進一步驗證。

抗體檢測結果顯示，SPF雞用3種IB弱毒活疫苗免疫后14 d，ELISA抗體和針對SDIB821/2012的中和抗體均為陰性，而491免疫組攻毒后具有90%的臨床保護率，表明對于IBV弱毒活苗而言，細胞免疫和局部的粘膜免疫在抗病毒感染中起主要作用。

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