Luminex液相芯片技術(shù)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用展望

楊顯超 吳秀娟 李凱航 王 建

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103)

Luminex液相芯片技術(shù)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用展望

楊顯超 吳秀娟 李凱航 王 建*

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103)

液相芯片技術(shù)是以100種熒光編碼微球做為生物探針的載體,生物分子在懸浮液態(tài)體系中進(jìn)行反應(yīng),以流式細(xì)胞術(shù)做為光學(xué)檢測(cè)手段的一種新型生物芯片技術(shù)。它以其易于操作、高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精密度以及寬的線性測(cè)定范圍等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域,本文就液相芯片技術(shù)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用作一展望。

液相芯片；獸醫(yī)；檢測(cè)；應(yīng)用

目前動(dòng)物疫病和人畜共患病多病原協(xié)同感染的臨床現(xiàn)象越來(lái)越普遍，這給疫病的診斷提出了更高要求，單病原診斷技術(shù)已經(jīng)無(wú)法滿足臨床的需要，高通量、針對(duì)有共性的特定病原的鑒別診斷才能保證診斷的可靠性和準(zhǔn)確性。特別是在出現(xiàn)類似黃浦江漂浮死豬事件和人感染H7N9禽流感疫情的公共衛(wèi)生事件和疫苗免疫效果評(píng)估時(shí)，動(dòng)物疫控實(shí)驗(yàn)室對(duì)高通量、高速度、多功能性、靈敏度高、準(zhǔn)確性高的多重?cái)?shù)據(jù)獲取和分析平臺(tái)需求尤為迫切。而液相芯片系統(tǒng)有機(jī)地整和了熒光編碼微球技術(shù)、激光分析技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、信號(hào)處理技術(shù)等多項(xiàng)技術(shù)，具有高通量、高速度、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，既可用于臨床流行病診斷、監(jiān)測(cè)、疫苗免疫效果評(píng)估，也可用于基因表達(dá)、SNP分型、細(xì)胞因子檢測(cè)等科研領(lǐng)域，尤其是對(duì)于多種病原的診斷和篩選具有極大優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)獲得2005年度國(guó)際臨床診斷技術(shù)革新大獎(jiǎng)，代表著生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展方向，在國(guó)際臨床診斷技術(shù)領(lǐng)域的領(lǐng)軍地位得到了最具權(quán)威的認(rèn)可。

1 液相芯片技術(shù)的原理

1997年由美國(guó)Luminex公司開發(fā)出了xMAP的檢測(cè)技術(shù)，標(biāo)志著液相芯片技術(shù)的誕生。液相芯片體系由許多大小均一的圓形微球（直徑5.5～5.6μm）為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種微球上固定有不同的探針?lè)肿?，將這些微球懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了一個(gè)液相芯片系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)可以對(duì)同一個(gè)樣品中的多種不同分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，每一種固定有探針的微球都有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)，或稱熒光編碼。在微球制造過(guò)程中摻人了紅色和橙色兩種熒光染料（這兩種染料各有10種不同區(qū)分），從而把微球分為100種不同的顏色，形成一個(gè)具有獨(dú)特光譜地址的含有100種不同微球的陣列。不同顏色微球在分類激光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光互不相同，這種分類熒光是識(shí)別不同微球的唯一途徑。利用這100種微球，可以分別標(biāo)記上100種不同的探針?lè)肿?。檢測(cè)時(shí)先后加人樣品和報(bào)告分子與標(biāo)記微球反應(yīng)，樣品中的目的分子（待檢測(cè)的抗原或抗體、生物素標(biāo)記的靶核酸片段、酶等）能夠與探針和報(bào)告分子特異性結(jié)合，使交聯(lián)探針的微球攜帶上報(bào)告分子藻紅蛋白，隨后利用儀器（如Luminex100）對(duì)微球進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果分析。儀器采用微流技術(shù)使微球快速單列通過(guò)檢測(cè)通道，并使用紅色和綠色兩種激光分別對(duì)單個(gè)微球上的分類熒光和報(bào)告分子上的報(bào)告熒光進(jìn)行檢測(cè)。紅色激光可將微球分類，從而鑒定各個(gè)不同的反應(yīng)類型（即定性）；綠色激光可確定微球上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量（即定量）。因此，通過(guò)紅綠雙色激光的同時(shí)檢測(cè)，完成對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)、定性和定量分析。

原理圖：

2 液相芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

液相芯片技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)在于：僅需少量樣本即可同時(shí)定性、定量檢測(cè)同一樣本中的多種不同目的分子，即多重檢測(cè)。具體說(shuō)來(lái)，與現(xiàn)有用于臨床診斷的化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)化光法及ELISA法相比，液相芯片技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)。

2.1 高通量

可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)、定性、定量分析。從理論上說(shuō)，如果不存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)的通量等于微球的種類數(shù)，目前最多可達(dá)到100種。這與傳統(tǒng)方法的逐個(gè)檢測(cè)相比是一個(gè)質(zhì)的飛躍。

2.2 樣本用量少

由于在同一個(gè)反應(yīng)孔中可以同時(shí)完成100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，所以大大節(jié)省了樣本用量，液相芯片的血清用量較ELISA法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法要少得多。

2.3 操作簡(jiǎn)單、快速

由于是基于液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，因此反應(yīng)速度快，孵育時(shí)間比傳統(tǒng)的固相檢測(cè)短。進(jìn)行免疫學(xué)分析時(shí)，若使用高親和力抗體，2～3h內(nèi)即完成檢測(cè)，而核酸雜交分析在PCR擴(kuò)增后lh 內(nèi)可得到結(jié)果。

2.4 靈敏度高

微球表面積大，每個(gè)微球上可包被10萬(wàn)個(gè)捕獲抗體，如此高密度的捕獲抗體保證了能夠最大程度地與樣本中的抗原分子結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度。最低檢測(cè)濃度可達(dá)到0.lp/ml，是ELISA靈敏度的10～100倍。

2.5 檢測(cè)范圍廣

可達(dá)3-5個(gè)數(shù)量級(jí)（如Bio-Rad公司細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)范圍達(dá)到可達(dá)到0.2～ 32000 pg/ml）。

2.6 特異性強(qiáng)

無(wú)需洗滌就能夠自行將和微球結(jié)合的與未結(jié)合的分子區(qū)分開來(lái)，只讀取單個(gè)微球上的熒光信號(hào)，信噪比好。

2.7 準(zhǔn)確性高

微球上的報(bào)告分子熒光強(qiáng)度與結(jié)合的待測(cè)分子成正比。由于液相芯片技術(shù)的檢測(cè)范圍大，因此不需要象ELISA檢測(cè)中那樣需將樣本多倍稀釋，從而減小了誤差。

2.8 重復(fù)性好

這是由于：與ELISA依靠酶放大作用的比色讀數(shù)相比，液相芯片技術(shù)中的熒光讀值更加直接、穩(wěn)定、靈敏；每種微球檢測(cè)100個(gè)，最終取熒光強(qiáng)度的中值作為結(jié)果，這相當(dāng)于對(duì)每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)了100次，而ELISA僅為雙復(fù)孔或三復(fù)孔，因此液相芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性是ELISA無(wú)法比擬的。

2.9 費(fèi)用低

同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣本中的多項(xiàng)指標(biāo)可節(jié)約時(shí)間、樣本、試劑、耗材和勞動(dòng)（比ELISA法低10～100倍），降低檢測(cè)成本，同時(shí)還提高了分析效率，僅需少量樣本即可獲得大量信息。

2.10 靈活

適用于各種蛋白質(zhì)和核酸的分析。商品化試劑盒的使用者只需增減探針交聯(lián)微球和標(biāo)記分子即可滿足不同檢測(cè)項(xiàng)目的需要。

3 液相芯片的不足

在蛋白分析過(guò)程中，由于部分血清中含有異嗜性抗體，可與微球或捕獲抗體直接連接，從而形成非特異性的背景值，給實(shí)驗(yàn)造成嚴(yán)重干擾，這種效應(yīng)類似于在免疫測(cè)定中由異嗜性抗體導(dǎo)致的干擾[1]。血清預(yù)先與聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、proprietary試劑培育，可以有效的減少非特異性的背景信號(hào)的產(chǎn)生，但是proprietary 試劑在減少背景信號(hào)的同時(shí)也減少特異性信號(hào)的產(chǎn)生[2]。應(yīng)用luminex的SeroMap 微球僅能部分的解決這些問(wèn)題。在核酸檢測(cè)時(shí)要設(shè)計(jì)好偶聯(lián)探針，保證其特異性。液相芯片是一個(gè)開放的技術(shù)平臺(tái)，在進(jìn)行多重PCR時(shí)，應(yīng)注意防止PCR 產(chǎn)物污染實(shí)驗(yàn)室。

4 液相芯片技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

液相芯片是繼平面芯片之后的一種新型芯片技術(shù)，是一種非常靈活的多元分析平臺(tái)，在核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的大規(guī)模分析中具有巨大的應(yīng)用潛力，可用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體-配體識(shí)別分析等眾多領(lǐng)域的研究，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用分析等都可以在同一個(gè)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)。鑒于液相芯片技術(shù)在高通量定性和定量檢測(cè)上令人矚目的優(yōu)勢(shì)，目前它在基因組學(xué)研究、蛋白質(zhì)組學(xué)研究、藥物開發(fā)、基礎(chǔ)研究和臨床診斷等方面的應(yīng)用十分廣泛，近幾年來(lái)以此為平臺(tái)的產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用十分活躍，研究者既可以根據(jù)研究需要自行制備探針交聯(lián)微球，建立反應(yīng)體系，也可使用種類繁多的商品化試劑盒進(jìn)行分析。大體說(shuō)來(lái)，液相芯片技術(shù)的應(yīng)用包括兩大部分：液相蛋白芯片和液相基因芯片，前者主要是基于抗原一抗體反應(yīng)，而后者實(shí)質(zhì)為核酸雜交。現(xiàn)將液相芯片技術(shù)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用展望如下：

4.1 動(dòng)物細(xì)菌性傳染病的檢測(cè)

近年來(lái)應(yīng)用液相芯片技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌性傳染病病原體檢測(cè)的研究日漸增多，涉及大腸桿菌、志賀氏菌、沙門菌、李斯特菌、空腸彎曲菌、葡萄球菌、霍亂弧菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肉毒梭菌、腦膜炎奈瑟菌。

大腸桿菌、沙門菌、李斯特菌和空腸彎曲菌是食源性疾病常見(jiàn)的細(xì)菌性病原體，臨床常規(guī)的檢驗(yàn)方法包括培養(yǎng)、生化檢測(cè)、酶標(biāo)法和核酸擴(kuò)增等，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要多次檢測(cè)才可以明確所有的病原體。呂東月等[3]采用xMAP液相懸浮芯片檢測(cè)方法，建立一管同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、沙門菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、創(chuàng)傷弧菌和空腸彎曲菌的快速篩查方法。Dunbar SA 等[4]利用液相芯片技術(shù)完成對(duì)食源性疾病常見(jiàn)細(xì)菌病原體的多通道定量檢測(cè)。Zhao J等[5]將液相芯片與多重PCR結(jié)合，快速篩檢樣品中志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、嗜肺軍團(tuán)菌和肉毒梭菌等10株致病菌。邱楊等[6]建立沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌等5種致病菌的快速液相芯片檢測(cè)方法。

4.2 動(dòng)物病毒性傳染病的檢測(cè)

液相蛋白芯片技術(shù)還可應(yīng)用于動(dòng)物疾病的檢測(cè)診斷，如禽流感、口蹄疫等。張曉娜[7]成功地建立了檢測(cè)AIVH5、H7、H9、 NDV、IBV和ILTV 6種病毒核酸的單重液相芯片和多重液相芯片的方法，為禽呼吸系統(tǒng)病毒性疾病的快速、高通量鑒別診斷搭建了新的技術(shù)平臺(tái)，也為檢測(cè)其他病毒性疾病病原的研究提供了新的思路；朱向博[8]研究成功構(gòu)建了同時(shí)檢測(cè) PPV、PCV2、PRRSV、CSFV 的四重液相芯片快速檢測(cè)方法，為豬病的快速高通量鑒別診斷搭建新技術(shù)平臺(tái)，也為液相芯片技術(shù)在動(dòng)物多病毒快速高通量檢測(cè)、鑒別診斷等應(yīng)用方面奠定了基礎(chǔ)；劉志玲[9]等應(yīng)用液相芯片技術(shù)原理，以原核表達(dá)的重組牛白血病病毒gp51蛋白為抗原，建立了檢測(cè)牛白血病病毒抗體的Liquchip液相蛋白芯片檢測(cè)方法。

5 液相芯片的應(yīng)用展望

液相芯片技術(shù)出現(xiàn)于以功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為核心的后基因組時(shí)代，從20世紀(jì)末發(fā)明至今僅十余年時(shí)間，卻已經(jīng)應(yīng)用于生命科學(xué)研究中的諸多領(lǐng)域。當(dāng)然，液相芯片技術(shù)在動(dòng)物疾病診斷檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用也將會(huì)更加的寬泛。該技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多種目的物，而且對(duì)同一樣本可同時(shí)檢測(cè)不同的指標(biāo)，達(dá)到多重檢測(cè)的目的。在進(jìn)出口動(dòng)物檢疫中，對(duì)幾種常檢、必檢的動(dòng)物傳染病檢疫可一次完成，并且檢測(cè)樣本需要量少，對(duì)活檢動(dòng)物無(wú)多大影響。在動(dòng)物食品的獸藥殘留上，可對(duì)多種不同的獸藥進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，可大大提高檢測(cè)效率，滿足口岸檢疫中快速檢驗(yàn)的要求。待該技術(shù)發(fā)展成熟時(shí)，對(duì)動(dòng)物病毒類傳染病、細(xì)菌類傳染病甚至是病毒與細(xì)菌混合感染的傳染病都可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，迅速作出診斷，可為重特大類動(dòng)物疾病預(yù)警的快速反應(yīng)機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。因此，在動(dòng)物疾病診斷領(lǐng)域，液相蛋白芯片將會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃（滬農(nóng)青字（2014）第2-11號(hào)）