四種伏牛山原生藥用植物的抗癌活性

高嘉嶼，楊 櫹，鄧瑞雪，張延萍，尹衛(wèi)平

（河南科技大學(xué)a.化工與制藥學(xué)院；b.新區(qū)醫(yī)院，河南 洛陽 471023）

四種伏牛山原生藥用植物的抗癌活性

高嘉嶼a，楊 櫹b，鄧瑞雪a，張延萍a，尹衛(wèi)平a

（河南科技大學(xué)a.化工與制藥學(xué)院；b.新區(qū)醫(yī)院，河南 洛陽 471023）

基于伏牛山原生藥用植物白花蛇舌草、淫羊藿、魚腥草和冬凌草在腫瘤治療中的臨床應(yīng)用，研究了該四種藥物對食管癌和肝癌細(xì)胞中的抑制活性。通過萃取獲得藥物不同濃度的乙醇提取物后，使用噻唑藍(lán)（MTT）法測定了EC109食管癌和HepG2肝癌細(xì)胞接受不同濃度不同時(shí)間藥物刺激后的生長狀況。其中，淫羊藿和魚腥草的最低IC50僅為0.18 mg／mL和0.16 mg／mL，而白花蛇舌草和冬凌草的最低IC50分別達(dá)到0.52 mg／mL和0.66 mg／mL。此研究結(jié)果首次證明：白花蛇舌草、淫羊藿、魚腥草和冬凌草對于食管癌EC109和肝癌HepG2細(xì)胞有濃度依賴和時(shí)間相關(guān)的體外生長抑制作用，為其臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

抗癌；伏牛山藥用植物；食管癌；肝癌；細(xì)胞毒性；凋亡

0 引言

惡性腫瘤是中國當(dāng)前重大的公共衛(wèi)生問題，據(jù)中國腫瘤登記年報(bào)2012公布的數(shù)據(jù)，中國每年癌癥死亡約250萬人。其中，河南地區(qū)高發(fā)的肝癌和食管癌的發(fā)病率位居癌癥死亡率的第三位和第四位，且目前尚無有效治療手段［1］。位于河南省中西部的伏牛山以其獨(dú)特的地理位置孕育了大量的藥用植物，在中醫(yī)抗肝癌和食管癌方劑中有著重要的作用，構(gòu)成了當(dāng)?shù)孛耖g抗癌防癌的基礎(chǔ)。

本文報(bào)道的四味藥材白花蛇舌草、淫羊藿、魚腥草和冬凌草在伏牛山區(qū)廣泛分布。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論的認(rèn)識(shí)，它們有清熱解毒和扶正培本的作用，可實(shí)現(xiàn)腫瘤類疾患的標(biāo)本兼治［2］。臨床應(yīng)用表明：包含有此四種藥用植物的中藥方劑對中晚期肝癌或食管癌患者的臨床癥狀有明顯改善，可不同程度地提高患者生存率。盡管此四種藥物的抗癌作用已經(jīng)在多種體內(nèi)外腫瘤模型中被證實(shí)，但是對于它們在食管癌和肝癌代表細(xì)胞株EC109和HepG2上的活性研究目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究使用不同濃度的乙醇對白花蛇舌草、淫羊藿、魚腥草和冬凌草進(jìn)行萃取，并以EC109和HepG2細(xì)胞為藥靶，對獲得的醇提物進(jìn)行細(xì)胞毒性測試，其結(jié)果將為此四種抗癌植物的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

白花蛇舌草、淫羊藿、魚腥草和冬凌草2013年3月購于洛陽好一生大藥房，經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材工程技術(shù)研究中心高致明教授鑒定對應(yīng)藥用植物為真品，樣品保存于伏牛山藥用植物資源標(biāo)本館（20137951-20137954）。EC-109和HepG2細(xì)胞株由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，使用DMEM高糖型培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）含體積分?jǐn)?shù)為10%的特級(jí)胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司），培養(yǎng)環(huán)境為37℃和5%CO2。

1.2 試驗(yàn)方法

藥物用粉碎機(jī)粉碎至300目細(xì)粉，加入體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、70%的乙醇溶液，置于超聲波清洗機(jī)中充分振蕩提取20 min，重復(fù)5次，過濾，收集濾液。重復(fù)萃取1次，將2次濾液合并，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，獲得相應(yīng)藥物不同乙醇濃度的提取物，待用。

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200 μL濃度為1.5×104個(gè)細(xì)胞每亳升的懸濁液。培養(yǎng)24 h后，加入10 μL相應(yīng)濃度的提取物（5 mg／mL、2.5 mg／mL、1.25 mg／mL、0.625 mg／mL、0.312 5 mg／mL和0.156 25 mg／mL），無藥培養(yǎng)基為對照。每個(gè)濃度重復(fù)測試3次。培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除全部液體后加入100 μL異丙醇，在酶標(biāo)儀上讀取光密度（OD，590 nm）。細(xì)胞的生長抑制率計(jì)算如下：（（對照OD－樣品OD）／對照OD）×100%。

結(jié)果數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。樣本間數(shù)據(jù)對比使用單因素方差分析（ANOVA）。對照組和樣本組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由Student’s t-test計(jì)算獲取。當(dāng)P＜0.05時(shí)，結(jié)果視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 白花蛇舌草醇提物在體外對食管癌和肝癌細(xì)胞的生長抑制作用

圖1和圖2分別為白花蛇舌草醇提物在體外對食管癌細(xì)胞EC109和肝癌細(xì)胞HepG2的生長抑制作用。由圖1和圖2可知：白花蛇舌草3種濃度的乙醇提取物在體外對EC109食管癌和HepG2肝癌細(xì)胞均有濃度依賴性的生長抑制作用。在EC109細(xì)胞中，70%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇提取物在72 h抑制作用最強(qiáng)，其IC50可達(dá)到0.52 mg／mL。而HepG2則在48 h對該藥70%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇提取物最為敏感，IC50為0.68 mg／mL。除此之外，較高乙醇濃度白花蛇舌草提取物的抑癌作用總是強(qiáng)于低濃度提取物。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，提示白花蛇舌草的有效抗癌部位可能為黃酮、多糖、萜以及蒽醌類成分［3］。

白花蛇舌草的體外細(xì)胞毒性已被報(bào)道于多種癌細(xì)胞株中，但對于食管癌EC109細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞的作用此處為首次報(bào)道。其50%細(xì)胞生長抑制濃度大于0.5 mg／mL，與其他類型癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性報(bào)道較為一致［4－5］。白花蛇舌草殺傷癌細(xì)胞的主要藥理機(jī)制為通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，如Bcl-2、Bax、Fas／FasL、Caspase和MMP等，從而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞周期生長、腫瘤血管生成，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡［4－6］。而此結(jié)論也與本試驗(yàn)顯微鏡觀察較為一致：相對于對照組EC-109或是HepG2細(xì)胞飽滿，大小均勻的形態(tài)，接受白花蛇舌草刺激后的癌細(xì)胞皺縮明顯，體積變小，大小不一，隨著藥物濃度升高，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、碎片增多，大量細(xì)胞凝聚成團(tuán)塊狀，呈典型的凋亡狀態(tài)。綜上所述，白花蛇舌草的醇提物在體外對食管癌EC109和肝癌HepG2的細(xì)胞毒性明顯，且呈濃度依賴性并與作用時(shí)間相關(guān)，其殺傷機(jī)制可能為凋亡相關(guān)的蛋白調(diào)節(jié)。

圖1 白花蛇舌草醇提物在體外對食管癌細(xì)胞EC109的生長抑制作用

圖2 白花蛇舌草醇提物在體外對肝癌細(xì)胞HepG2的生長抑制作用

2.2 淫羊藿醇提物在體外對食管癌和肝癌細(xì)胞的生長抑制作用

圖3和圖4分別為淫羊藿醇提物在體外對食管癌細(xì)胞EC109和肝癌細(xì)胞HepG2的生長抑制作用。由圖3和圖4可知：10%、30%和70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇淫羊藿提取物均可以抑制EC109和HepG2的生長，并且其作用伴隨著濃度的增加而增強(qiáng)。其中，食管癌細(xì)胞在藥物刺激48 h時(shí)最敏感，其體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取物的IC50僅為0.18 mg／mL；而肝癌細(xì)胞在藥物刺激72 h時(shí)最敏感，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取物的IC50為0.33 mg／mL。同白花蛇舌草相似，較高濃度的乙醇所提取的淫羊藿部位抗癌作用相對較強(qiáng)，結(jié)合文獻(xiàn)分析，黃酮類化合物可能為其主要活性成分［7］。

盡管淫羊藿作為主要組分被記載于眾多抗癌方劑當(dāng)中，但其醇提取部位體外的抗食管癌EC109和肝癌HepG2活性于此為首次報(bào)道。除此之外，也有報(bào)道淫羊藿黃酮成分對人血癌HL-60、肝癌H7402和鼠血癌WEHI-3等數(shù)種腫瘤細(xì)胞有生長抑制作用［8］。其活性可通過影響癌細(xì)胞生長周期（G0／G1期抑制），進(jìn)而啟動(dòng)凋亡程序而實(shí)現(xiàn)，其中相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白／mRNA包括bcl-2、c-myc和p21［9］。據(jù)此，淫羊藿對于EC109和HepG2細(xì)胞的抗癌機(jī)制可推測為凋亡相關(guān)的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。

圖3 淫羊藿醇提物在體外對食管癌細(xì)胞EC109的生長抑制作用

圖4 淫羊藿醇提物在體外對肝癌細(xì)胞HepG2的生長抑制作用

2.3 魚腥草醇提物在體外對食管癌細(xì)胞的生長抑制作用

體積分?jǐn)?shù)10%、30%以及70%的乙醇魚腥草提取物在體外對于食管癌EC109細(xì)胞的生長有濃度依賴性的抑制作用（見圖5）。其中，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇的提取物在24 h即可達(dá)到對EC109的最大殺傷效果，其IC50僅需0.16 mg／mL；而低濃度的乙醇提取物需較長時(shí)間，在72 h才獲得最低IC50為0.58 mg／mL。此結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道推測，魚腥草醇提物中的有效抗癌成分應(yīng)為黃酮類化合物及生物堿［10］。

圖5 魚腥草醇提物在體外對食管癌細(xì)胞EC109的生長抑制作用

魚腥草的體外抗癌活性已被報(bào)道于多種癌細(xì)胞株中，其IC50值為0.1～0.4 mg／mL［11－12］，同此次發(fā)現(xiàn)的在食管癌EC109細(xì)胞上的活性較為一致。魚腥草刺激能夠抑制cyclin D1，cyclin A，Bax／Bcl-2，CDK 4和CDK 2的表達(dá)，并同時(shí)上調(diào)p27，caspase-8，caspase-9和caspase-3水平，從而誘導(dǎo)A549肺癌和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［11］。而對于血癌細(xì)胞Molt-4，魚腥草則通過下調(diào)Bcl-xl蛋白表達(dá)，提升Smac／Diablo，Bax和GRP78水平，從而實(shí)現(xiàn)經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的細(xì)胞凋亡［12］。據(jù)此可以推斷：魚腥草醇提物所誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞生長抑制也應(yīng)經(jīng)過對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)而達(dá)成的。

2.4 冬凌草醇提物在體外對食管癌細(xì)胞的生長抑制作用

冬凌草乙醇提取物均對食管癌細(xì)胞EC109有濃度依賴性的生長抑制作用，并且其效力在48 h達(dá)到最大（見圖6）。其中，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取物的IC50達(dá)0.66 mg／mL。在全部3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，冬凌草醇提物的活性均隨著乙醇濃度的增加而增強(qiáng)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，其抗癌活性成分應(yīng)來源于多糖、黃酮類和萜類化合物［13］。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，冬凌草及其有效活性成分對白血病細(xì)胞、宮頸癌、膀胱癌、乳腺癌和肝癌等數(shù)種癌細(xì)胞呈現(xiàn)有細(xì)胞毒性作用［14－16］。冬凌草的主要抗癌機(jī)制包括調(diào)節(jié)Bax、survivin、cdc2、cdc25c、p16、p21、p27、c-myc［17］和caspase 3／8［18］等一系列凋亡相關(guān)蛋白，從而將癌細(xì)胞的生長靜止于G0／G1期或G2／M期，同時(shí)啟動(dòng)程序化死亡信號(hào)［17－18］。此次發(fā)現(xiàn)的冬凌草在EC109食管癌細(xì)胞上的活性相較于已報(bào)道的體外抗癌活性較為一致，但此藥物抗食管癌的藥理機(jī)制尚不明確，結(jié)合已知文獻(xiàn)，提示凋亡相關(guān)蛋白應(yīng)為其進(jìn)一步研究的藥物靶點(diǎn)。

圖6 冬凌草醇提物在體外對食管癌細(xì)胞EC109的生長抑制作用

3 結(jié)論

（1）四種伏牛山原生藥用植物白花蛇舌草、淫羊藿、魚腥草和冬凌草的醇提物在體外對于食管癌細(xì)胞EC109或肝癌細(xì)胞HepG2具有濃度依賴的生長抑制作用，其中70%的乙醇提取物活性最強(qiáng)。

（2）白花蛇舌草、淫羊藿、魚腥草和冬凌草醇提物的抗癌活性與時(shí)間相關(guān)，其中除魚腥草在24 h即達(dá)到最大作用外，其他3種藥物均需48～72 h才可在目標(biāo)癌細(xì)胞株中獲取最低IC50（最強(qiáng)效果）。

（3）四種藥物在體外對于食管癌或是肝癌的殺傷效果同此前文獻(xiàn)報(bào)道的抗癌活性較為一致，并提示其抗癌作用是通過對凋亡相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)。其中，淫羊藿和魚腥草70%乙醇提取物對食管癌細(xì)胞的IC50僅需0.15 mg／mL左右，有進(jìn)一步深入研究其作用單體活性成分和分子藥理機(jī)制的潛力。

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R285.5

A

1672－6871（2014）04－0077－05

河南省國際科技合作計(jì)劃基金項(xiàng)目（104300510064）

高嘉嶼（1980－），男，遼寧沈陽人，副教授，博士，主要研究方向?yàn)榭拱┨烊划a(chǎn)物藥理.

2013－12－19