川烏抗腫瘤初步研究

黃秀曼,劉迎輝,杜鋼軍*

(1.南陽市第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)科,河南南陽473000;2.河南大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所,河南開封475004)

川烏抗腫瘤初步研究

黃秀曼1,2,劉迎輝2,杜鋼軍2*

(1.南陽市第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)科,河南南陽473000;2.河南大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所,河南開封475004)

目的 初步研究川烏的抗腫瘤作用。方法 體內(nèi)實驗:建立小鼠肝癌H22皮下移植動物模型,灌胃給藥后測定原位腫瘤體積、質(zhì)量及免疫器官指數(shù);體外實驗:用MTT法測定川烏對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 體內(nèi)實驗:在本實驗劑量下,與模型組比較,川烏組腫瘤生長減緩,抑瘤率為32.05﹪,胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均升高;體外實驗:實驗所用濃度的川烏對小鼠肺癌細(xì)胞有生長抑制作用。結(jié)論 川烏有一定抗腫瘤作用。

川烏;H22;Lewis;MTT

癌癥是僅次于心血管疾病導(dǎo)致人類死亡的另一個主要殺手,且發(fā)生率呈逐年上升趨勢。中醫(yī)作為中國傳統(tǒng)文化的一部分已有幾千年的歷史,《華佗神醫(yī)秘傳》中就有關(guān)于乳巖的記載:“巖”反復(fù)連結(jié),根深蒂固,雖在表皮,連生內(nèi)臟。手術(shù)或放療皆屬局部性的治療,藥物治療因具全身治療優(yōu)勢而成為中晚期肝癌常用的治療方法[1]。在常規(guī)的化學(xué)藥品治療過程中,昂貴的費用以及嚴(yán)重的毒副作用,給患者帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及身體的損害。擁有高選擇、強活性、低毒副作用的中草藥,在對抗腫瘤方面具有獨特的優(yōu)勢。

川烏為毛茛科植物烏頭的干燥母根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為下品,可祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、行淤止痛[2-3]。中藥川烏來源于毛茛科植物烏頭的干燥塊根,其性熱,味辛、苦,有大毒?，F(xiàn)代藥理研究表明,川烏的藥理作用主要包括鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用,局部麻醉作用,抗炎作用,對心血管系統(tǒng)有強心作用,對免疫功能有抑制作用,抗腫瘤作用等[4]。但因其毒性大,臨床上常因用藥不當(dāng)而造成中毒甚至死亡。為指導(dǎo)臨床正確使用川烏對腫瘤的治療,我們對川烏的抗腫瘤作用做了初步研究。

1 材料

1.1 藥品

川烏,購自開封市天濟(jì)大藥房。川烏打粉后與CMC-Na按1∶20的比例研磨,供體內(nèi)實驗使用。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)液、胰酶(美國GIBCO公司);MTT (美國Sigma公司);DMSO(鄭州派尼化學(xué)試劑廠);生理鹽水;D-hanks緩沖液等。

1.3 動物與瘤株

昆明小鼠,雌性,22～25 g,河南省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供(合格證號:豫動合字101號);H22肝癌,本實驗室昆明鼠腹水傳代保存;小鼠Lewis肺癌細(xì)胞,本實驗室傳代培養(yǎng)提供。

1.4 儀器

HDL潔凈臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);快速混勻器SK-1(常州國華電器有限公司); El X800酶標(biāo)儀(美國BIO-IEK公司);TDL-508臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);YN-ZD-2電熱蒸餾水器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);CHA-S恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司); BD-400冰柜(河南冷柜廠);LGR16-W高速冷凍離心機(北京京立離心機有限公司);倒置生物顯微鏡(南京江南光電集團(tuán)股份有限公司);電子天平(上海精密儀器有限公司)。

2 方法

2.1 對小鼠H22肝癌皮下移植腫瘤的影響

取生長良好的荷腹水型肝癌昆明小鼠處死,取腹水,加無菌生理鹽水稀釋成5×106個細(xì)胞/m L的稀釋液。于狀態(tài)良好的小鼠前肢右腋皮下接種。將接種后的小鼠按體質(zhì)量隨機分為模型組和川烏組,每組10只。模型組:灌胃蒸餾水0.2 m L/10 g;川烏組:灌胃川烏粉混懸液0.2 m L/10 g。方法均為每天2次,每次間隔8 h以上。腫瘤接種后即日開始給藥,灌胃2周。治療期間每隔一日監(jiān)測小鼠體質(zhì)量1次,待腫瘤長出后用游標(biāo)卡尺每日測腫瘤長度和寬度1次,腫瘤大小按下列公式計算:腫瘤體積(mm3)=腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2。

全程治療結(jié)束后,次日處死小鼠,剝離腋部腫瘤、肝臟、脾臟和胸腺,并稱重,計算腫瘤抑制率及肝臟、胸腺、脾臟指數(shù)。

臟器指數(shù)(%)=內(nèi)臟器官質(zhì)量(mg)/處死當(dāng)日體質(zhì)量(g)×100%;腫瘤抑瘤率(%)= (1-T/C)×100%。

式中:C為模型組平均瘤質(zhì)量(g);T為川烏組平均瘤質(zhì)量(g)。

2.2 對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響

取小鼠Lewis肺癌傳代細(xì)胞,加3 m L胰酶消化,振蕩搖勻,37℃孵化2 min,加入2 m L培養(yǎng)基以中和胰酶,離心2次,棄去上清液,加入培養(yǎng)基吹打均勻,吹打成單細(xì)胞懸液,在細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個細(xì)胞/m L,備用。上述細(xì)胞點入96孔培養(yǎng)板,每孔100μL,另設(shè)置空白對照組及4個濃度梯度給藥組(藥物用培養(yǎng)基稀釋),每組設(shè)置4個平行對照孔,分別加入空白培養(yǎng)基100μL,30倍稀釋藥物100μL,60倍稀釋藥物100μL,120倍稀釋藥物100μL,240倍稀釋藥物100μL,置于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi),37℃條件下培養(yǎng)48 h,甩出板內(nèi)溶液,加入5 g/L的MTT 100μL/孔,放置4 h,甩出96孔板中溶液,加入DMSO 100μL/孔,混勻,酶標(biāo)儀于570 nm測OD值。

生長指數(shù)=給藥組OD值/模型組OD值× 100%;抑制率=1-給藥組OD值/模型組OD值× 100%。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對H22肝癌荷瘤小鼠體質(zhì)量、腫瘤及免疫器官的影響

與模型組小鼠相比較,川烏組瘤質(zhì)量減小,胸腺、脾臟指數(shù)均增大,見表1、圖1;對瘤體積的影響,見表2、圖2;小鼠生長狀態(tài)良好,P＞0.05,見圖1。川烏對小鼠肝癌有一定的抑制作用,抑瘤率為32.05%。

表1 川烏對H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤質(zhì)量的影響(±s,n=10)

表1 川烏對H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤質(zhì)量的影響(±s,n=10)

組別 劑量/(m L/10 g) 瘤質(zhì)量/g 胸腺指數(shù)/(mg/g) 脾臟指數(shù)/(mg/g) 抑瘤率/%模型組 - 3.37±0.87 2.15±1.38 65.15±10.39 -川烏組 0.2 2.29±0.30 3.01±0.90 57.95±2.81 32.05

圖1 H22荷瘤小鼠生長曲線

表2 川烏對H22肝癌荷瘤小鼠瘤體積的影響(±s,n=10)

表2 川烏對H22肝癌荷瘤小鼠瘤體積的影響(±s,n=10)

組別 劑量/(m L/10 g) 瘤體積/mm3模型組 - 7 381.10±2 856.54川烏組 0.2 3 262.24±2 174.41

圖2 瘤體積生長曲線

3.2 對小鼠脾細(xì)胞增殖以及對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響

實驗結(jié)果顯示,隨藥物濃度的改變,抑制率也有所改變,藥物濃度升高,則抑制率升高,見表3。

表3 川烏對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率

4 討論

近代藥理研究表明,川烏具有抗炎、麻醉鎮(zhèn)痛、強心、降血壓、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理作用,化學(xué)成分是雙酯型二萜類生物堿,包括烏頭堿(Aconitine),次烏頭堿(Hypaconitine),杰斯烏頭堿(Jasaconitine),異翠雀堿(Isodelphinine)等。此類生物堿毒性很大,是烏頭中的主要毒性成分[5]。本次實驗的抑瘤率為32.05%,顯示川烏對腫瘤的生長有一定的抑制作用。

此次實驗MTT主要有兩個用途:①藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定;②細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無此功能。

川烏對免疫功能影響的研究結(jié)果目前尚不統(tǒng)一,有報道烏頭中烏頭堿對小鼠免疫器官和體液、細(xì)胞免疫均有不同程度的抑制作用[6]。

目前,在川烏的研究中還存在一些問題。首先,川烏的成分復(fù)雜,其毒性成分和有效成分的研究都集中在烏頭堿,但川烏中烏頭堿所占的比例很小;其次,川烏在體內(nèi)的毒藥物動力學(xué)過程以及與機體的交互作用研究困難;第三,川烏炮制減毒與配伍減毒的規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)等尚未完善,證治毒理學(xué)、配伍禁忌、妊娠禁忌等中藥毒性理論基礎(chǔ)研究不足。這些問題均須深入研究,為川烏在臨床上的安全應(yīng)用提供保障[7]。

綜上所述,川烏有一定的抗腫瘤作用,但在腫瘤治療應(yīng)用中需注意劑量,最好與功能互補的中藥聯(lián)合應(yīng)用。川烏對多種癌細(xì)胞均有直接殺傷效應(yīng)和抑制作用[8],提示川烏在中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤方面有一定的應(yīng)用前景。

[1]任正剛,楊秉輝.肝癌的化學(xué)藥物治療[J].中國處方藥, 2005(5):34-36.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:36-37.

[3]白向陽.川烏的毒性與抗腫瘤作用概述[J].實用中醫(yī)藥雜志,2005,21(2):125.

[4]曾瑾,羅霞,江南,等.生川烏水煎液抗腫瘤作用的實驗研究[J].四川大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,44(6):1 344-1 348.

[5]錢信忠.有毒中藥大辭典[M].天津:天津科技翻譯出版公司,1992:64.

[6]王雅賢,賈亮,張德山,等.烏頭堿對小鼠免疫功能影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥信息,1989,3(5):40.

[7]劉強強,郭海東,徐策,等.川烏毒理作用研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2012,19(8):110-112.

[8]Chao J C,Chu C C.Effects of Ginkgo biloba ex tract o ncell proliferation and cy totox icity in human hepatocellularcarcinoma cells[J].Wor1d J Gastroenterol,2004,10 (1):37.

[責(zé)任編輯 時 紅]

Preliminary study of Radix Aconiti on anti-tumor

HUANG Xiuman1，2，LIU Yinghui2，DU Gangjun2*
（1.The first people's hospital of Nanyang Department of Clinical medicine，Nanyang，Henan 473000，China；2.Institute of Pharmacy，Pharmaceutical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To study the anti-tumor of Radix Aconiti preliminarily.Methods In vivo，the model of H22liver cancer was established to observe anti-tumor by measuring the volume，weight of in situ tumor and immune organs index after ig of Radix Aconiti medicinal liquor.In vitro，the effects of Radix Aconiti medicinal liquor on Lewis cells by MTT assay.Results In vivo，compared with the model group，the tumor in Radix Aconiti group was smaller，the tumor inhibitory rate was 32.05%，both of thymus index and spleen index increased.In vitro，Radix Aconiti medicinal liquor at used doses inhibited proliferation of lewis lung cancer cells.Conclusion Radix Aconiti medicinal liquor has beneficial effects on tumor treatment.

Radix Aconiti；H22；Lewis；MTT

R285.5

A

1672-7606(2014)02-0082-03

2013-09-30

國家自然科學(xué)基金項目(81173094);河南省高校青年骨干教師項目(2010GGJS-025);河南省科技廳重點攻關(guān)項目(112101310308);河南大學(xué)省部共建項目(SBGJ090704)。

黃秀曼(1988-),女,河南南陽人,碩士研究生,從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)研究工作。

*通訊作者:杜鋼軍(1971-),男,博士,教授,從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)的研究工作。