新疆柯爾克孜羊布病血清學(xué)調(diào)查及其診斷方法的研究

多里坤·努爾沙發(fā)，阿曼古力·馬木提，閆晶華，阿依吐拉·肉孜，馬 偉，米吉提·木和塔爾汗，木沙·玉努司，努爾古麗·托胡迪買買提，阿曼吐爾·阿力克，地力夏提·阿布都克孜爾

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊 830063；2.新疆烏恰縣畜牧獸醫(yī)站,新疆 烏恰 845450；3.新疆阿合奇縣畜牧獸醫(yī)站,新疆 阿合奇 843500）

新疆柯爾克孜羊布病血清學(xué)調(diào)查及其診斷方法的研究

多里坤·努爾沙發(fā)1，阿曼古力·馬木提1，閆晶華1，阿依吐拉·肉孜1，馬 偉1，米吉提·木和塔爾汗1，木沙·玉努司2，努爾古麗·托胡迪買買提3，阿曼吐爾·阿力克3，地力夏提·阿布都克孜爾1

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊 830063；2.新疆烏恰縣畜牧獸醫(yī)站,新疆 烏恰 845450；3.新疆阿合奇縣畜牧獸醫(yī)站,新疆 阿合奇 843500）

用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT），試管凝集試驗(yàn)(SAT),牛布魯氏菌抗體ELISA試驗(yàn)，改進(jìn)SAT試驗(yàn)及布病細(xì)菌學(xué)檢查方法和AMOS-PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果被檢柯爾克孜羊均為陰性。ELISA方法敏感性比SAT高3.4和4.3個(gè)百分點(diǎn),比RBT高8.4個(gè)百分點(diǎn),低0.51個(gè)百分點(diǎn)，改進(jìn)SAT對(duì)RBT符合率93.5%。經(jīng)細(xì)菌學(xué)方法分離了5株羊3型布魯氏菌、該菌株對(duì)PCR方法的符合率是100%，對(duì)噬菌體裂解試驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)和量化、最佳用量為5 μL。ELISA方法不同批號(hào)間沒有明顯的質(zhì)量差異、敏感性明顯高于其它檢測方法、該方法特異性需要做進(jìn)一步研究，改進(jìn)SAT方法在加樣準(zhǔn)確率和安全操作等方面有較高的優(yōu)越性。改進(jìn)后的噬菌體方法成功裂解了被檢分離布魯氏菌，收集流產(chǎn)胎兒區(qū)域主要流行的優(yōu)勢菌是羊3型布魯氏菌。

柯爾克孜羊；布病血清學(xué)檢測；細(xì)菌學(xué)方法

布魯氏菌病是布魯氏菌屬引起的伴隨終身的慢性人畜共患病[1]，布魯氏菌屬是革蘭氏陰性菌，對(duì)人類身體健康及牛、羊、山羊、豬等動(dòng)物的危害性極大，在牛、羊、豬群中引起流產(chǎn)。人主要通過接觸被布魯氏菌污染的環(huán)境和未消毒的奶等飲食的消費(fèi)而患病，對(duì)人的傳染而言、羊種布魯氏菌是首要的、其次是牛種布魯氏菌[2]，布病在世界范圍內(nèi)廣泛流行[3]，羊種和牛種布魯氏菌是我國流行的主要菌種[4]。為了解我國新疆畜禽品種資源保護(hù)名錄的品種柯爾克孜羊布病疫情，對(duì)阿合奇縣、烏恰縣境內(nèi)的柯爾克孜羊群中的4000只羊、以流行病學(xué)調(diào)查和血清學(xué)監(jiān)測方法進(jìn)行了檢測，并對(duì)布病防制效果進(jìn)行評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 主要診斷試劑及試劑盒

布氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、試管凝集抗原、布氏菌病試管凝集試驗(yàn)陽性、陰性血清由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司購置；(Bovine Brucella Antibody ELISA AniGen B.Brucella Ab ELISA2.0)牛布魯氏菌抗體ELISA試劑盒（韓國進(jìn)口）由天杰仁和生物科技（北京）有限公司購置；胰蛋白月示（TRYPTOSE）（英國進(jìn)口）、布氏肉湯（BRUCELLA BROTH）、布氏瓊脂粉（BRUCELLA AGAR）（美國進(jìn)口）、瓊脂粉、氯化鈉、葡萄糖由國內(nèi)購置；單相特異性A、M血清、粗糙型R血清、Tb、Bk噬菌體由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所購置；布魯氏菌A19、S2、M5苗由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)所提供；2×Taq PCR Master Mix由北京莊盟國際生物基因科技有限公司購置。

1.2 儀器耗材

試管、吸管、玻片、平皿、接菌棒、剪刀、鑷子、酒精燈、生物培養(yǎng)箱、水浴鍋、顯微鏡、高速離心機(jī)、微量加樣器、移液槍頭、酶標(biāo)儀、PCR儀、電泳儀、圖象分析儀等。

1.3 方法

1.3.1 操作標(biāo)準(zhǔn)

布病虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT），動(dòng)物布病試管凝集試驗(yàn)（SAT）按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)〈動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)＞(2002)操作。

1.3.2改進(jìn)SAT試驗(yàn)的建立及應(yīng)用

按李璐[8]介紹的方法，有兩方面的改進(jìn)：其一、是用移液器取代吸管，其二、是按比例將原方法中第一管的1 250 μL體系變成1 000 μL體系，按如下操作：第一管中加入920 μL稀釋液。第2～4管各加入500 μL稀釋液。取被檢血清80 μL，加入第1管內(nèi)。將移液器調(diào)至500 μL刻度吹打混合均勻，取500 μL混合液加入第2管混勻。再吸第2管混合液500 μL至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液500 μL。鹿、牛等血清的稀釋可依本法、按比例變成1 000 μL體系，為960 μL稀釋液加40 μL待檢血清。

1.3.3 牛布魯氏菌抗體ELISA試驗(yàn)

由天杰仁和生物科技（北京）有限公司提供說明進(jìn)行。

1.3.4 動(dòng)物布魯氏菌細(xì)菌學(xué)檢查方法及噬菌體裂解試驗(yàn)中接種方式的改進(jìn)和該體的量化

按上述方法對(duì)收集流產(chǎn)胎兒用胰蛋白月示培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)和菌型鑒定，對(duì)于噬菌體是用移液器取代吸管接種該體及接種量定位5 μL。

1.3.5 布魯氏菌AMOS PCR方法

1.3.5.1模板制備及滅能操作 在無菌條件下，從培養(yǎng)菌株中用接種棒勾取少量放進(jìn)有500 μL無離子水的2.0 mL離心管內(nèi)，充分混勻后，用封口膜封口，放進(jìn)100℃水浴鍋滅能10 min，迅速放置于冰箱冷卻10～15 min備用。

1.3.5.2 布魯氏菌AMOS 50 μL體系的建立及應(yīng)用 PCRmix 12.5 μL、引物（P1、P2、P3、P4、P5）2 μL、模板2 μL、雙蒸水（廠家提供ddH2O）補(bǔ)充至25.5 μL。

1.3.5.3 AMOS-PCR反應(yīng)條件 95℃預(yù)變性5 min→40循環(huán)(94℃變性1 min→60℃退火1.5 min→72℃延伸1.5 min)→72℃延伸10 min。

1.3.5.4電泳制板 1%瓊脂糖凝膠板的配方和制備：將1～1.2 g瓊脂糖放入100 mL 1%TAE電泳緩沖液裝三角瓶中，加熱融化1 min（微波爐）。溫度降至60℃左右時(shí)，加入10 mg/mL溴化乙錠 （EB）或（goodvlew）5 μL均為鋪板，厚度為3～5 mm。

1.3.5.5 1%TAE緩沖液制備 用雙蒸水1倍稀釋廠家提供TAE電泳緩沖原液。

1.4 樣本

1.4.1 血清學(xué)檢測試驗(yàn)用牛血樣

2011-2013年收集新疆莫地懷疑感染布病牛血清共821份，數(shù)量分別為62份、237份、429份及93 份RBT陽性牛血清。1.4.2 病原學(xué)檢測病料，冷凍保存了新疆莫地流產(chǎn)羊群收集的部分羊流產(chǎn)胎兒。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果（見表1）

表1 RBT.SAT.ELISA試驗(yàn)檢測結(jié)果對(duì)比

2011年-2012年、ELISA陽性檢出率與RBT完全一致，同時(shí)ELISA比SAT分別多檢出陽性血樣2份和10份，前者的敏感性比后者高3.2和4.3個(gè)百分點(diǎn)。上述表1中198份RBT陽性牛血清經(jīng)ELISA檢測，結(jié)果陽性197份、陰性1份，ELISA陽性率比RBT低0.51%，符合率達(dá)到了99.49%，表1中429樣本經(jīng)ELISA檢測，結(jié)果比RBT多檢出陽性樣本36份，ELISA敏感性比RBT高8.4百分點(diǎn)及低0.51百分點(diǎn)。93份RBT陽性牛血清經(jīng)改進(jìn)SAT試驗(yàn)檢測，結(jié)果陽性87份、陰性6份，標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清對(duì)照成立，該方法比RBT陽性率的符合率是93.5%。

2.2 病原學(xué)檢測結(jié)果

上述收集流產(chǎn)胎兒經(jīng)布魯氏菌細(xì)菌學(xué)方法分離了5株可疑布魯氏菌，該株菌經(jīng)柯茲羅夫斯基染色法鏡檢均為被染成桔紅色，背景為蘭色，綠色球桿菌等形態(tài)符合布魯氏菌的染色特征，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均為凝集，陰性血清均為未凝集，在單項(xiàng)特異性血A、M血清中均為凝集，符合羊3型的特點(diǎn)，R血清均為沒有凝集，因此排除了粗糙型布魯氏菌的可能性，上述被檢菌均為在Tb噬菌體不同稀釋度上全部不溶解，而且對(duì)Bk不同稀釋度全部溶解，因此判為羊種布魯氏菌，排除了其它布魯氏菌種的可能性，該株菌均為未產(chǎn)生硫化氫，不需要二氧化碳，符合羊種布魯氏菌的特征。根據(jù)上述特征，這5株菌鑒定為羊3型布魯氏菌。A19、M5苗對(duì)照試驗(yàn)成立。

2.3 AMOS-PCR檢測結(jié)果

對(duì)上述5株羊3型布魯氏菌用AMOS-PCR方法檢測結(jié)果現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶,見圖1。

圖1 5株分離菌株

AMOS-PCR擴(kuò)增結(jié)果M:Marker,1：M5號(hào)苗菌株,2:A19號(hào)苗菌株,3：S2號(hào)苗菌株,4:羊3型分離株,5:羊3型分離株,6:羊3型分離株,7:羊3型分離株,8:羊3型分離株,9:生理鹽水。羊種(M5)、牛種(A19)、豬種(S2)布魯氏菌擴(kuò)增片段分別為731bp、498bp、285bp。

3討論

3.1 關(guān)于柯爾克孜羊及檢測結(jié)果分析

我國柯爾克孜羊，經(jīng)長期自然選擇形成的地方優(yōu)良品種、以獨(dú)有的特征被列為新疆畜禽品種資源保護(hù)名錄的品種[12]，在新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州境內(nèi)種群規(guī)模為100萬只以上，柯爾克孜羊適應(yīng)高原長途遷移,高效利用當(dāng)?shù)刂脖?抗寒,抗病,繁殖率和幼畜成活率高(可能母畜活動(dòng)有關(guān))[13]、等生命特征適應(yīng)該地區(qū)不同的地理環(huán)境[14],除了上述優(yōu)點(diǎn)、該羊種為我們提供優(yōu)質(zhì)肉、乳等食品，并為當(dāng)?shù)孛癖姮F(xiàn)實(shí)生活中常用的民族服飾、氈房等生活用品提供粗毛，深受人們的喜愛。為了促進(jìn)該特有品種健康發(fā)展，我們對(duì)該羊種部分羊群進(jìn)行布病流行病學(xué)調(diào)查的同時(shí)，以抽樣采血方式實(shí)施了布病血清學(xué)檢測，檢測結(jié)果均為陰性，根據(jù)調(diào)查及檢測結(jié)果，該羊群中沒有檢出陽性畜的主要原因可能與幾種防制措施的實(shí)際應(yīng)用有直接關(guān)聯(lián)，其一、該品種長期施行了自繁自育；其二、對(duì)幼畜進(jìn)行了布病疫苗接種；其三、按期對(duì)該區(qū)域?qū)嵤┝吮O(jiān)測及從外地基本不調(diào)入牲畜等。要全面了解該品種布病疫情情況，還需要開展大量的流行病學(xué)調(diào)查和血清學(xué)檢測，今后布病防制工作中該區(qū)域要繼續(xù)確保已取得的較好布病防制效果，根據(jù)疫情情況、按有關(guān)規(guī)定、施行綜合防制措施的同時(shí)進(jìn)一步加強(qiáng)布病防制宣傳工作，在布病防制工作中真正營造群防群控等好的一面，為該品種的長期健康發(fā)展創(chuàng)造有利環(huán)境。

3.2 血清學(xué)檢測試驗(yàn)評(píng)價(jià)

本研究找到一個(gè)敏感性高、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速、便利、安全、先進(jìn)等優(yōu)點(diǎn)具備的檢測方法、對(duì)收集血樣，按年份、連續(xù)三年、用同一個(gè)產(chǎn)品的傳統(tǒng)RBT抗原、SAT抗原和相對(duì)比較敏感、快速、便捷、安全的間接ELISA試劑盒、不同批號(hào)、檢測被檢樣本和對(duì)照樣本，經(jīng)檢測結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)、ELISA的敏感性比SAT分別高3.2和4.3個(gè)百分點(diǎn)、分別檢出了2份和10份、SAT方法檢測陰性的布魯氏菌牛血清[7]，ELISA敏感性比RBT高8.4個(gè)百分點(diǎn)、低0.51個(gè)百分點(diǎn)、該方法同樣檢出了RBT檢測陰性的36份牛血清[7]。上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)、在一定程度上、再次證明張芳毓介紹[15]ELISA檢測布魯氏菌抗體的敏感性比SAT高10～100倍的論證及王佳等[16]提出ELISA比RBT敏感性高3～4倍,檢出率高5.34%等試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)于本次ELISA試驗(yàn)檢出率比RBT底0.51個(gè)百分點(diǎn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)、我們不能排除其他致病菌所引起的疑問、要證明這一點(diǎn)還需要做大量的有關(guān)研究。在日常檢測中、不同檢測方法,具備較高的敏感性和特異性的同時(shí)必須具有良好的穩(wěn)定性[17]，經(jīng)過被檢樣本和標(biāo)準(zhǔn)樣本檢測、上述各診斷液及試劑盒的良好穩(wěn)定性得到了再次驗(yàn)證。對(duì)于ELISA試驗(yàn)的特異性而言，今后的工作中需要做進(jìn)一步研究和評(píng)價(jià)，通過本試驗(yàn)，ELISA的快速、準(zhǔn)確、便捷、比較安全（小產(chǎn)生氣溶膠）、用量小等優(yōu)點(diǎn)再次被證明。改進(jìn)SAT方法，在樣本和診斷試劑的準(zhǔn)確加樣、減少氣溶膠的產(chǎn)生、減少用量、操作便利等方面比傳統(tǒng)SAT方法有較高的優(yōu)越性[8]，便于進(jìn)行大面積檢測工作。

3.3 病原學(xué)檢測

本次試驗(yàn)所用培養(yǎng)基的pH值，自然達(dá)到了布魯氏菌生長所需pH值（6.8）范圍的界限，因此沒有進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)。接種病料前對(duì)制備好的培養(yǎng)基放入37℃溫箱72 h進(jìn)行了無菌檢驗(yàn)，無菌合格后方可使用，要確保培養(yǎng)基各成分準(zhǔn)確加入，檢菌工作開始前對(duì)上述合格培養(yǎng)基先接S2苗，該菌順利生長后開始正式檢菌工作，采取該辦法排除了因培養(yǎng)基不合格而影響檢菌工作的不利隱患。所用儀器設(shè)備、玻璃器材、試劑和消耗品進(jìn)行了嚴(yán)格滅菌消毒的同時(shí)，加強(qiáng)了個(gè)人防護(hù)措施。本試驗(yàn)對(duì)采集流產(chǎn)胎兒外表用3%來蘇兒進(jìn)行消毒，無菌條件下取不同臟器接種分離培養(yǎng)。要防止被檢菌變異情況的發(fā)生，抓緊時(shí)間，減少傳代次數(shù)，及時(shí)地進(jìn)行了鑒定工作。噬菌體的裂解試驗(yàn)是菌種鑒定工作中一項(xiàng)重要區(qū)別指征[11]、試驗(yàn)操作中準(zhǔn)確操作和把握該體的用量、對(duì)實(shí)驗(yàn)的的順利進(jìn)行、起關(guān)鍵作用，關(guān)于接種和量化噬菌體稀釋液的文章卻很小見，為提高該體接種量的準(zhǔn)確性和操作便于性，本試驗(yàn)、是用移液器取代接菌棒進(jìn)行接種、該體最佳用量是5 μL，傳統(tǒng)方式用接菌棒接該體時(shí)，首先準(zhǔn)確把握正確用量是比較難；其次，如操作者在接種當(dāng)中因手顫抖等人為因素有可能污染接種面，造成誤判結(jié)果的可能性，本試驗(yàn)對(duì)上述傳統(tǒng)方式進(jìn)行改進(jìn)的同時(shí)，克服了傳統(tǒng)方法中的上述不足。本試驗(yàn)AMOS-PCR羊種的符合率達(dá)到了100%[18]，并且再次證明了該試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室診斷中敏感、快捷、便利、安全、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。為今后檢菌工作提供了科學(xué)依據(jù)。

本調(diào)查中被檢柯爾克孜羊經(jīng)布病血清學(xué)檢測沒有檢出陽性畜，根據(jù)調(diào)查結(jié)果、肯定防制效果和該品種今后的健康發(fā)展提出了綜合預(yù)防措施等建議。本研究應(yīng)用ELISA方法、對(duì)被檢及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣本進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果跟其他血清學(xué)檢測方法對(duì)比的同時(shí)該方法的應(yīng)用價(jià)值給予了評(píng)價(jià)。用改進(jìn)SAT方法對(duì)被檢陽性樣本及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣本進(jìn)行了檢測，并且該方法的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

利用細(xì)菌學(xué)方法胰蛋白月示（TRYPTOSE）培養(yǎng)基，從羊流產(chǎn)胎兒不同臟器中直接檢測5株羊3型布魯氏菌，病原檢測區(qū)域主要流行的優(yōu)勢菌是羊3型布魯氏菌，該菌株的毒力測定需做進(jìn)一步研究。對(duì)噬菌體接種方式和用量進(jìn)行改進(jìn)、最佳用量范圍是5 uL。

經(jīng)AMOS-PCR檢測發(fā)現(xiàn)被檢分離菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)苗株擴(kuò)增產(chǎn)物完全一致，擴(kuò)增條帶均為731bp。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過柯爾克孜羊血清學(xué)調(diào)查，為基層培養(yǎng)了掌握布病相關(guān)知識(shí)的布病防制人員。

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Xinjiang Kirgiz Sheep Brucellosis Serological Survey and Research of Diagnostic Methods

DUOLIKUN·Nuershafa1，AMANGULI·Mamuti1，YAN Jing-hua1，AYITULA·Rouzi1，MA-wei1，
MIJITI·Muhetaerhan1,MUSHA·Yunusi2，NUERGULI·Tuohudi3，AMANTUER·Alike3，DILIXIATI·Abudukezier1（1.Xinjiang Uygur Autonomous Region Animal Health Epidemic Prevention and Monitoring Station，Urumqi 830063，China；2.Wuqia County Animal Husbandry and Veterinary Station，Wuqia Xinjiang 845450，China；3.Aheqi County Animal Husbandry and Veterinary Station，Aheqi Xinjiang 843500，China)

Using the brucellosis serological test to understand the brucellosis epidemic situation of in our country Xinjiang Kirgizsheep and carry out the different brucella serology and etiology detection method for testing other collecting blood samples and sheep aborted fetuses,at the same time evaluate the application value of that different methods and improved methods results,provide basis for scientific prevention of brucellosis.Use the Rose Bengal test(RBT),the Serum AgglutinationTest(SAT),the improved SAT test,Bovine Brucella Antibody ELISA test,bacteriology examination methods and AMOS-polymerase chain reaction (PCR)test.Results the tested Kirgizsheep were negative,the sensitivity of ELISA was respectively higher than the SAT 3.4and 4.3 precentage,compare with RBT 8.4 precentage higher and 0.51precentage lower.The improved SAT coincidence rate with RBT was 93.5%.By the method of bacteriology Isolated 5 strains of biovar 3 B.melitensis,that strains accuracy with PCR was100%.To the phage cracking test implementing modification and quantitative steps,the optimum usage of phage was 5 ul.ELISA method had no obvious quality differences between different batches and sensitivity was significantly higher than other test methods, that methods specificity need to do further research.The Improved SAT method’s sample adding accuracy and operation safety had a highest advantages.The modification method of phage were succeesfully cracking the isolated strains of brucellosis.The aborted fetuses sample collecting area main prevalence of bacterium was biovar 3 B.melitensis.

Kirgiz sheep；brucellosis serological test；bacteriology examination methods

S852.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1003－6377（2014）04－0042-06

2014-03-24

新疆少數(shù)民族科技人才特殊培養(yǎng)計(jì)劃科研項(xiàng)目 （201123109）

多里坤·努爾沙發(fā)（1969-），男（哈薩克族），高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事家畜布病防制工作。