三聚氰胺酶聯(lián)免疫試劑盒檢測牛奶樣品結(jié)果淺析

王遠(yuǎn)麗

（新疆昌吉州畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，新疆 昌吉 831100）

三聚氰胺酶聯(lián)免疫試劑盒檢測牛奶樣品結(jié)果淺析

王遠(yuǎn)麗

（新疆昌吉州畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，新疆 昌吉 831100）

為探索牛奶中三聚氰胺檢測的快速有效方法，本試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫檢測方法對(duì)隨機(jī)抽樣的一批牛奶樣本進(jìn)行三聚氰胺檢測，經(jīng)過檢測分析本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度平均為91.2%，板內(nèi)變異系數(shù)均小于10%；標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合系數(shù)R2為0.9579，曲線拐點(diǎn)為2；檢測數(shù)據(jù)可靠，實(shí)驗(yàn)較為成功，說明抽測樣品符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，三聚氰胺酶聯(lián)免疫試劑盒檢測牛奶樣品結(jié)果可靠，可用于生產(chǎn)中牛奶樣品的三聚氰胺初篩。

三聚氰胺；酶聯(lián)免疫；結(jié)果分析

牛奶中違法添加三聚氰胺提高劣質(zhì)奶的蛋白檢測含量，對(duì)人體危害很大，曾在國內(nèi)造成轟動(dòng)。影響酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高的特點(diǎn)，能最大限度地減少檢測操作的誤差和工作強(qiáng)度，目前已廣泛應(yīng)用于食品安全、農(nóng)藥殘留和獸藥殘留等領(lǐng)域的監(jiān)測工作。但對(duì)于檢測數(shù)據(jù)處理、檢測結(jié)果的可靠性、判斷疑似陽性結(jié)果確有些模糊，本文從三聚氰胺ELISA檢測數(shù)據(jù)著手，充分分析實(shí)驗(yàn)報(bào)告各項(xiàng)數(shù)據(jù)，詳細(xì)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品采集

2013年6月對(duì)昌吉市轄區(qū)內(nèi)奶牛養(yǎng)殖場的牛奶樣本進(jìn)行抽檢，隨機(jī)抽檢10份樣本，用三聚氰胺酶聯(lián)免疫試劑盒（以下簡稱ELISA試劑盒，北京望爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)CA301）快速檢測方法進(jìn)行初步篩查，對(duì)疑似陽性樣本再進(jìn)行液相色譜法分析確認(rèn)。

1.2 ELISA試劑盒操作簡介

使用前將試劑盒在室溫（20℃～25℃）放置30 min，使用前將液體試劑搖勻。

從樣品中取20 μL牛奶樣本直接測定。

按每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣本溶液至少兩個(gè)平行樣計(jì)算，將所需數(shù)目的酶標(biāo)板條插入板架中。

加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本液20 μL至微孔后，再加酶標(biāo)二抗50 μL/孔，抗體工作液80 μL/孔，輕輕振蕩混勻。用蓋板膜蓋板，25℃下避光反應(yīng)20 min。

倒出孔中液體，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體，加250 μL洗滌工作液至每個(gè)孔中，5 s后再倒掉孔中液體，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。再加250 μL洗滌工作液，重復(fù)操作4～5次。

加底物液A液和B液各50 μL/孔，輕輕振蕩混勻于25℃下避光放置10 min顯色。

加終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，置酶標(biāo)儀于450/630 nm波長處測量吸光度值。

2 結(jié) 果

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度見表1、表2和圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照

表2 樣品測定結(jié)果

圖1 牛奶中三聚氰胺檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度為（87.7%+47.3*2%）/2=91.2%；板內(nèi)、板間變異系數(shù)為表1所列的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的變異系數(shù)值，均小于10%；標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合系數(shù)R2為0.9579，曲線拐點(diǎn)為2；檢測數(shù)據(jù)可靠，實(shí)驗(yàn)較為成功。檢測樣本中最高的8號(hào)樣品數(shù)值為14.1 μg/kg，未超出國家標(biāo)準(zhǔn)，全部檢測的10份樣本檢測數(shù)值均符合國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 討 論

3.1 準(zhǔn)確度

本試劑盒檢測牛奶準(zhǔn)確度應(yīng)為100%+15%，本實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度為（87.7%+47.3*2%）/2=91.2%，在要求的區(qū)間范圍100%+15%之內(nèi)，這項(xiàng)指標(biāo)是表示待檢物在樣品分析過程中的損失程度，損失越少，回收率（準(zhǔn)確度）越高。在實(shí)驗(yàn)過程中添加陽性樣本（一般添加國家要求的定量限的1-2倍）是為了驗(yàn)證整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的可信度，包括樣品的前處理，點(diǎn)板等過程。鑒于本實(shí)驗(yàn)不需要前處理，直接取20 μL牛奶樣品直接測定，所以91.2%說明陽性添加樣品的前處理過程的回收率較高，整個(gè)點(diǎn)板操作過程是值得可信的，否則所得數(shù)據(jù)不可靠，實(shí)驗(yàn)應(yīng)該重做。同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)直線回歸、曲線回歸均有多種常用方式可采用，各有特點(diǎn)。

3.2 精密度

試劑盒板內(nèi)板間變異系數(shù)均小于10%，本次實(shí)驗(yàn)板內(nèi)變異系數(shù)均小于10%。這說明使用的試劑盒重復(fù)性好，檢測員洗板操作規(guī)范一致，檢測員在洗板過程中未出現(xiàn)板干燥的情況，洗板拍干后及時(shí)進(jìn)行了下一步操作。

3.3 靈敏度

此試劑盒靈敏度為5 μg/kg，試劑盒靈敏度值愈低，試劑盒愈好。在選購試劑盒時(shí)，相同試劑盒選靈敏度值低的檢測值較準(zhǔn)確。另外，試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化會(huì)直接影響檢測結(jié)果。

3.4 最低檢測限

此方法最低檢測限5 μg/kg，小于GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》定量限2.0 mg/kg，也小于GB/T 22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法》檢測限為50 μg/kg，能夠滿足我們的檢測要求，可以選用此試劑盒。另外，試驗(yàn)結(jié)果中低于5 μg/kg的值均為超出檢測范圍，表示未檢出。

3.5 曲線擬合系數(shù)R2

表二中的R2曲線擬合系數(shù)愈接近1愈好，一般要求在0.95以上；在洗板過程中如果出現(xiàn)板干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3.6 拐點(diǎn)

point of inflection拐點(diǎn)一般要求小于等于3，本次實(shí)驗(yàn)為2。

3.7 OD值

0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630 nm）值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之不用。室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

3.8 樣本的結(jié)果

每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的濃度值應(yīng)減去空白孔的濃度值。例如8號(hào)樣品最終所得數(shù)值應(yīng)為：15.3-1.2= 14.1 μg/kg；在Linear Regression直線圖中若直線與X軸的交點(diǎn)小于濃度最大值，則說明存在系統(tǒng)誤差，最大可能是溫度低于說明中要求的溫度25℃。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，三聚氰胺酶聯(lián)免疫試劑盒檢測牛奶樣品結(jié)果可靠，可用于生產(chǎn)中牛奶樣品的三聚氰胺初篩。

[1]《生物體系中的化學(xué)測量》Kent k.Stewart Richard E.EBDL著.

[2]趙曉聯(lián),等.酶聯(lián)免疫吸附法在食品分析中的應(yīng)用[J].衛(wèi)生研究,1998,（V27）：82-84.

[3]趙曉聯(lián),等.酶聯(lián)免疫吸附法測定黃曲霉毒素B1誤差分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2001，8第11卷(4).

[4]耿慶華，等.農(nóng)畜產(chǎn)品中三聚氰胺間接競爭ELISA檢測方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，(03).

The Results Analyses of Melamine Detection in Milk by Melamine ELISA Kit

WANG Yuan-li
（Changji Livestock Testing Center，Changji 831100，China）

For finding an effective method to rapidly detect melamine in milk,the ELISA kit is used to detect melamine for random sampling of milk samples.the result show that the analysis of the experiment averaged 91.2%and The coefficient of variation within the board less than 10%;fitting coefficient of standard curve t R2 is 0.9579,inflection point of the curve 2;detection data are reliable.indicating that sampling tests samples meet the relevant national standards.The results of this experiment show that the ELISA kits to detect melamine in milk samples results are reliable and can be used in the production of melamine screening milk samples.

melamine;milk;ELISA;analysis result

S817.3

：A

：1003－6377（2014）03－0066-03

2014-04-16

王遠(yuǎn)麗（1978-），女，獸醫(yī)師，主要從事畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測、監(jiān)管工作及畜牧養(yǎng)殖技術(shù)服務(wù)工作。