凍結(jié)過程中腎細(xì)胞體積變化的實(shí)驗(yàn)研究與數(shù)值計(jì)算

王雅博，諸 凱,,3，張于峰，安 娜，王艷嬌

凍結(jié)過程中腎細(xì)胞體積變化的實(shí)驗(yàn)研究與數(shù)值計(jì)算

王雅博1，諸 凱1,2,3，張于峰1，安 娜2，王艷嬌2

(1. 天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津300072；2. 天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；3. 天津大學(xué)中低溫?zé)崮芨咝Ю媒逃恐攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072)

以腎細(xì)胞為研究對(duì)象，采用低溫顯微系統(tǒng)研究了不同降溫速率時(shí)細(xì)胞的脫水傳質(zhì)過程，觀察了凍結(jié)過程中細(xì)胞體積的變化；同時(shí)，采用差示掃描量熱儀(DSC)測(cè)定了腎細(xì)胞凍結(jié)過程中的放熱量，通過理論模型計(jì)算出細(xì)胞凍結(jié)過程中的體積變化．由低溫顯微鏡直接觀察和DSC方法獲得了相似的細(xì)胞體積和體積變化趨勢(shì)．最后，針對(duì)不同的降溫速率，根據(jù)細(xì)胞水分滲透模型計(jì)算出細(xì)胞膜水分的滲透系數(shù)和表觀滲透活化能．這些參數(shù)的獲得為優(yōu)化細(xì)胞的保存條件提供了理論依據(jù)．

腎細(xì)胞；低溫保存；細(xì)胞水分滲透；差示掃描量熱儀

對(duì)生物組織而言，胞內(nèi)水的質(zhì)量大約占細(xì)胞總質(zhì)量的80%．在常溫下細(xì)胞與周圍的溶液處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)、外的溫度和濃度相同．在冷卻過程中，細(xì)胞外的溶液先被冷卻到溶液的凝固點(diǎn)以下，當(dāng)降溫速率較慢時(shí)，由于胞外冰晶的形成導(dǎo)致細(xì)胞外溶液濃度增加，形成高滲透壓，促使細(xì)胞內(nèi)水分不斷通過細(xì)胞膜外流，細(xì)胞不斷脫水、皺縮[1]．另一方面，快速降溫將形成胞內(nèi)冰，胞內(nèi)冰的產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞是致命的．為了獲得最優(yōu)的細(xì)胞存活率，細(xì)胞降溫過程要避免慢速降溫引起的“溶液效應(yīng)”及快速降溫產(chǎn)生的“胞內(nèi)冰”．胞外冰產(chǎn)生后，細(xì)胞內(nèi)存留的水分是決定細(xì)胞保存成功與否的重要因素．為了深入理解細(xì)胞低溫保存過程，需要在凍結(jié)過程中測(cè)定細(xì)胞膜對(duì)水分的滲透特性[2]．細(xì)胞膜對(duì)水分的滲透特性可以通過細(xì)胞體積隨外界環(huán)境(滲透壓)的變化來反映[3]．

目前有兩種方法用于研究細(xì)胞凍結(jié)過程中的體積變化：低溫顯微觀察和差式掃描量熱儀(differential scanning calorimetry，DSC)．Acharya等[4]利用低溫顯微鏡研究了Jurkat細(xì)胞和Hela細(xì)胞在不同降溫速率下的體積變化規(guī)律，并計(jì)算出相對(duì)溫度(0,℃)下，細(xì)胞膜對(duì)水分的滲透系數(shù)和表觀活化能．Choi等[5]根據(jù)低溫顯微鏡觀察獲得的細(xì)胞體積，計(jì)算了凍結(jié)過程中人真皮纖維細(xì)胞懸浮和貼壁狀態(tài)下的動(dòng)力學(xué)參數(shù). Devireddy等[6]采用低溫顯微鏡和DSC測(cè)量并計(jì)算了淋巴細(xì)胞在不同降溫條件下的細(xì)胞體積變化及動(dòng)力學(xué)參數(shù). DSC還可用于計(jì)算不規(guī)則形狀細(xì)胞凍結(jié)過程中的體積變化規(guī)律[7-8]．Mori等[9]聯(lián)合使用低溫顯微鏡和DSC研究了細(xì)胞懸液凍結(jié)過程中的水分運(yùn)輸和胞內(nèi)冰形成機(jī)理．

筆者采用低溫顯微系統(tǒng)觀察并獲得了腎細(xì)胞凍結(jié)過程中的體積變化．使用DSC測(cè)定了腎細(xì)胞懸液慢速冷凍過程中的放熱量，并通過理論模型計(jì)算得到細(xì)胞凍結(jié)過程中的細(xì)胞體積變化．根據(jù)細(xì)胞體積隨外界環(huán)境的變化，計(jì)算細(xì)胞在凍結(jié)過程中，細(xì)胞膜滲透系數(shù)和水分透過細(xì)胞膜的表觀滲透活化能[10]．

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 腎活細(xì)胞懸液的制備

將BALB/C(巴比賽)鼠脫臼處死，取出腎臟剪碎，用0.074,mm(200目)尼龍網(wǎng)研磨．然后用生理鹽水緩慢沖洗，收集細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)在80%以上[11]．

1.2 差示掃描量熱儀

采用TA-Q1000型差示掃描量熱儀記錄樣品凍結(jié)過程中的熱流曲線．使用前，用高純銦對(duì)儀器進(jìn)行溫度校準(zhǔn)得到爐子常數(shù)為1.19．實(shí)驗(yàn)掃描溫度范圍為25～-60,℃．

1.3 低溫顯微系統(tǒng)

低溫顯微系統(tǒng)包括光學(xué)顯微鏡和BCS-196冷熱臺(tái)及其溫度控制系統(tǒng)．顯微鏡裝有CCD，圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)上的圖像采集卡轉(zhuǎn)換后予以存儲(chǔ)．冷熱臺(tái)可實(shí)現(xiàn)-196～125,℃內(nèi)升降溫速率的精確控溫，精度為0.01,℃．

在進(jìn)行顯微觀察時(shí)，樣品的準(zhǔn)備尤其重要．為了獲得單層細(xì)胞，筆者采用的方法是：將一片載玻片置于另一片石英載玻片之上，利用液體的表面張力將細(xì)胞懸液吸入至兩載玻片之間．由此得到的試樣是體現(xiàn)單層(monolayer)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，有利于觀察細(xì)胞體積的變化，并且可以防止觀察過程中細(xì)胞懸液的蒸發(fā)和泄漏．

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫顯微鏡的動(dòng)態(tài)觀察

以不同降溫速率(5,℃/min，10,℃/min，20,℃/ min)降溫至-35,℃，采用低溫顯微鏡觀察細(xì)胞的脫水傳質(zhì)變化過程．為了消除時(shí)間因素的影響，降溫至-35,℃后恒溫30,min．由于胞內(nèi)冰對(duì)細(xì)胞的破壞較大，所以有些細(xì)胞在凍結(jié)過程中逐漸在視野中“消失”，因此只選擇在凍結(jié)過程中保持細(xì)胞完整形狀的細(xì)胞進(jìn)行分析．圖1給出了以5,℃/min的速率降溫時(shí)，胞外冰產(chǎn)生過程中細(xì)胞體積的直觀變化．使用Image-Pro軟件測(cè)量細(xì)胞的投影面積．每次選取3個(gè)細(xì)胞，測(cè)量3次，求平均值．在計(jì)算過程中，將細(xì)胞認(rèn)為是理想球體，低溫顯微鏡得到的投影面積與細(xì)胞體積兩者存在如下關(guān)系：

由低溫顯微觀察發(fā)現(xiàn)(見圖1)，隨著溫度的下降，溶液中會(huì)突然出現(xiàn)分散的冰晶，繼而冰晶呈樹枝狀生長(zhǎng)．這一過程體現(xiàn)為胞外冰的形成．胞外冰形成初期對(duì)細(xì)胞外形沒有明顯的影響．隨著胞外冰晶的增多，細(xì)胞外濃度增大，細(xì)胞內(nèi)水分通過細(xì)胞膜流出細(xì)胞，細(xì)胞皺縮；并且由于胞外冰的擠壓，部分細(xì)胞扭轉(zhuǎn)變形．圖2為以不同速率降溫時(shí)，細(xì)胞體積隨溫度變化的曲線．隨著溫度的降低，細(xì)胞體積逐漸減?。?dāng)溫度降至-25,℃后，無論以何種降溫速率降溫，細(xì)胞體積都不再產(chǎn)生明顯變化；并且在恒溫階段，細(xì)胞體積也不再發(fā)生改變．這是由于以5,℃/min或10,℃/min降溫時(shí)，細(xì)胞逐漸接近其非滲透平衡體積．在5,℃/min降溫工況時(shí)，細(xì)胞的最小體積為0.26V0；10,℃/min時(shí)，細(xì)胞的最小體積為0.25V0．而快速降溫(20,℃/min)時(shí)，一部分來不及滲出的水分在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)形成冰晶. 在20,℃/min降溫工況時(shí)，細(xì)胞的最小體積為0.34V0.

將細(xì)胞看作理想球體并根據(jù)投影面積計(jì)算出的細(xì)胞體積與實(shí)際細(xì)胞體積之間存在一定的誤差．這是因?yàn)樵谶M(jìn)行細(xì)胞顯微觀察時(shí)，只能觀察并記錄細(xì)胞在二維平面的投影，不能直接獲得三維體積．雖然未凍結(jié)的細(xì)胞基本呈圓形，但在凍結(jié)過程中由于胞外冰的擠壓作用及細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差，細(xì)胞形狀發(fā)生變化．雖然將細(xì)胞假設(shè)為理想球體進(jìn)行計(jì)算存在一定的誤差，但是由于細(xì)胞體積非常小，國(guó)內(nèi)外的研究普遍采用這一假設(shè)[4,6,9]．

圖1 5,℃/min降溫時(shí)胞外冰產(chǎn)生過程中細(xì)胞體積變化Fig.1 Volume change of renal cells during extracellular ice freezing at different temperatures(5,/min℃)

圖2 細(xì)胞體積隨溫度變化的顯微觀察結(jié)果Fig.2 Volumetric response of renal cells as a function of temperature from cryomicroscope

2.2 DSC測(cè)定

2.2.1 DSC測(cè)定細(xì)胞體積的理論模型

根據(jù)Devireddy等[6]提出的測(cè)定細(xì)胞水分滲透特性的DSC方法，在細(xì)胞懸液的凍結(jié)過程中，細(xì)胞體積隨溫度的變化與DSC測(cè)得的熱流數(shù)據(jù)之間有如下關(guān)系[6-7]：

整理后可得

式中：ΔqDSC為分別凍結(jié)活細(xì)胞(具有滲透活性的細(xì)胞)和死細(xì)胞(失去滲透活性的細(xì)胞)過程中，釋放的總熱流量的差值；Δq(T)DSC為分別凍結(jié)活細(xì)胞和死細(xì)胞至某一溫度T時(shí)，釋放的熱流差值；V0為初始細(xì)胞體積；Vb為細(xì)胞的非滲透平衡體積．

2.2.2 DSC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3為活細(xì)胞(具有滲透活性的細(xì)胞)和死細(xì)胞(失去滲透活性的細(xì)胞)在凍結(jié)過程中釋放的總熱流量曲線．從圖3中可以看出，凍結(jié)過程中活細(xì)胞釋放的總熱量要高于死細(xì)胞．活細(xì)胞在慢速冷卻過程中，由于胞外冰形成，細(xì)胞外溶液濃度增加，形成高滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)的自由水外流．自由水凍結(jié)過程釋放的熱量為αβΔHf，其中：α為細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)；β 為細(xì)胞內(nèi)自由水的體積分?jǐn)?shù)，β=1-Vb/V0；ΔHf為水的相變潛熱．

圖3 凍結(jié)活細(xì)胞和死細(xì)胞過程中釋放的總熱流量曲線Fig.3 Total heat release during freezing of live and dead cells

同一樣品經(jīng)快速冷卻(一般快速降溫速率達(dá)200,℃/min)后，基本上所有細(xì)胞都經(jīng)歷胞內(nèi)冰而死亡．由于胞內(nèi)冰破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜碎片與基質(zhì)溶為一體，因此原來細(xì)胞內(nèi)的自由水可以看作是與細(xì)胞懸液具有相同濃度的溶液．這部分自由水在凍結(jié)過程中釋放的潛熱為αβΔHec，其中ΔHec為等滲溶液的相變潛熱．由于純水的相變潛熱高于等滲溶液(生理鹽水)的相變潛熱，因此，αβΔHf≥αβΔHec，且兩者的差值就可作為計(jì)算細(xì)胞體積的依據(jù)．根據(jù)凍結(jié)過程的放熱量，通過式(1)計(jì)算出細(xì)胞無量綱體積．

將低溫顯微測(cè)量結(jié)果與DSC方法計(jì)算的細(xì)胞體積進(jìn)行比較可以看出，計(jì)算結(jié)果能夠真實(shí)反映細(xì)胞在凍結(jié)過程中的體積變化規(guī)律，如圖4所示．通過對(duì)3種降溫速率獲得的細(xì)胞體積變化規(guī)律進(jìn)行比較可知，降溫至某一溫度時(shí)，降溫速率越快，細(xì)胞脫水越不充分，細(xì)胞體積越大.同時(shí)，根據(jù)圖4可知，計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值存在一定的誤差，并且這一誤差隨著降溫速率的增大而增大.以5,℃/min降溫時(shí)，計(jì)算結(jié)果的平均誤差為2.3%，最大誤差為4.8%；而以20,℃/min降溫時(shí)，計(jì)算結(jié)果的平均誤差增大至2.5%，最大誤差增大至8.0%.這是由于在低溫顯微實(shí)驗(yàn)中，只選擇能夠保持細(xì)胞完整形狀的活細(xì)胞分析其脫水過程.但DSC反映的是大量細(xì)胞的平均反應(yīng).眾所周知，快速降溫將導(dǎo)致胞內(nèi)冰的產(chǎn)生，因此在快速降溫(大于5,℃/min)時(shí)，DSC測(cè)量的活細(xì)胞降溫?zé)崃髑€是胞外冰和胞內(nèi)冰形成放熱曲線的疊加.低溫顯微實(shí)驗(yàn)也顯示：當(dāng)降溫速率小于等于5,℃/min時(shí)，腎細(xì)胞在凍結(jié)過程中幾乎沒有胞內(nèi)冰出現(xiàn)；當(dāng)降溫速率大于5,℃/ min時(shí)，在-7～-25,℃這一溫度范圍內(nèi)，胞內(nèi)冰逐步出現(xiàn).Mori等[9]及Seki等[12]的研究也證實(shí)了這一結(jié)論.因此對(duì)于腎細(xì)胞，在利用DSC測(cè)量細(xì)胞體積變化時(shí)，降溫速率應(yīng)小于5,℃/min，以避免胞內(nèi)冰的影響.

圖4 DSC計(jì)算的細(xì)胞體積與低溫顯微細(xì)胞體積的比較Fig.4Comparison of volumetric response of renal cells between cryomicroscopy and DSC

2.3 細(xì)胞膜水分滲透參數(shù)

2.3.1 細(xì)胞膜水分滲透模型

Mazur[1]根據(jù)熱力平衡原理提出了凍結(jié)過程中單個(gè)懸浮細(xì)胞體積變化情況的數(shù)學(xué)模型，具體描述如下：

其中

式中：V為某一溫度下的細(xì)胞體積，將細(xì)胞看作為理想的球體；T為絕對(duì)溫度；Lp為細(xì)胞膜的水分滲透系數(shù)；Lpg為TR=273.15K 時(shí)細(xì)胞膜的水分滲透系數(shù)；ELp為表觀滲透活化能；R為氣體常數(shù)；B為降溫速率；Ac為滲透過程中的有效膜面積，Ac=4πr02；vw為水的偏摩爾體積；ns為細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)的物質(zhì)的量；φs為氯化鈉的分解常數(shù)，φs=2．

2.3.2 細(xì)胞膜水分滲透參數(shù)的確定

采用龍格-庫(kù)塔格式對(duì)方程(3)離散，根據(jù)由低溫顯微鏡觀察的細(xì)胞體積變化數(shù)據(jù)，求出不同溫度下細(xì)胞膜水分滲透系數(shù)Lp[13]．應(yīng)用MATLAB中的lsqnonlin函數(shù)對(duì)方程進(jìn)行非線性回歸的最小二乘優(yōu)化[2]．計(jì)算結(jié)果如表1所示．

由表1可以看出，降溫速率很大程度上影響細(xì)胞膜對(duì)水分的滲透特性．細(xì)胞膜的水分滲透系數(shù)是反映水分通過細(xì)胞膜難易程度的參數(shù)．隨降溫速率的增加，相對(duì)溫度(TR=273.15,K)下，細(xì)胞膜水分滲透系數(shù)(Lpg)不斷減小，這是由于較慢的降溫速率使細(xì)胞內(nèi)的水分有更多的時(shí)間滲出，與細(xì)胞外液達(dá)到化學(xué)勢(shì)平衡．表觀滲透活化能是決定滲透反應(yīng)速率的另一個(gè)重要因素，是指增大細(xì)胞膜上高分子鏈間的距離，使細(xì)胞內(nèi)水分子通過細(xì)胞膜流至細(xì)胞外所需的能量[14]．通過計(jì)算結(jié)果可知，腎細(xì)胞膜表觀滲透活化能隨降溫速率的增加而減小，說明快速降溫時(shí)，水分流失所需的活化能較小．

表1 腎細(xì)胞水分流失參數(shù)Tab.1 Water transport parameters of renal cell

3 結(jié) 論

(1) 分別采用DSC和低溫顯微系統(tǒng)獲得了胞外冰存在條件下的腎細(xì)胞體積．通過這兩種方法獲得的細(xì)胞體積，無論體積本身還是變化趨勢(shì)都非常相似．降溫初期細(xì)胞體積變化明顯，隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓逐漸平衡，細(xì)胞體積變化減慢直至穩(wěn)定．同一溫度下，降溫速率越快，細(xì)胞脫水越不充分，細(xì)胞體積越大．對(duì)于腎細(xì)胞，DSC方法只能比較精確地反映慢速降溫(≤5,℃/min)時(shí)的細(xì)胞體積變化，快速降溫(＞5,℃/min)時(shí)由于胞內(nèi)冰的出現(xiàn)使活細(xì)胞凍結(jié)曲線發(fā)生波動(dòng)影響計(jì)算的精確性．

(2) 計(jì)算了胞外冰存在條件下細(xì)胞膜水滲透參數(shù)．通過計(jì)算可知在相同的溫度時(shí)，滲透系數(shù)隨降溫速率的增加而降低，表明較慢的降溫速率有利于細(xì)胞的脫水．同時(shí)，表觀滲透活化能同樣隨降溫速率的增加而降低．細(xì)胞體積變化和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的獲得，對(duì)確定最優(yōu)的降溫速率，具有極強(qiáng)的指導(dǎo)意義．

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(責(zé)任編輯：田 軍)

Experimental Study and Numerical Calculation of Volume Change of Renal Cell During Freezing

Wang Yabo1，Zhu Kai1,2,3，Zhang Yufeng1，An Na2，Wang Yanjiao2
(1. School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Tianjin Key Laboratory of Refrigeration Technology，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；3. Key Laboratory of Efficient Utilization of Low and Medium Grade Energy，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

The renal cell was treated as the object forstudy. The cryomicroscopy was used to study the mass transfer process and the volume change of cells at different cooling rate. Meanwhile, the heat release during cooling was assessed by differential scanning calorimetry (DSC), and the volume change was calculated by the theoretic model. The data obtained from cryomicroscopy and DSC are in good agreement in terms of cell volume and changing trends. The membrane permeability and the activation energy were calculated according to cell volume data obtained by cryomicroscopy. These parameters can provide theoretical basis for the optimization of cell preservation conditions.

renal cell；cryopreservation；water transport；differential scanning calorimetry (DSC)

Q65

A

0493-2137(2014)02-0149-06

10.11784/tdxbz201205023

2012-05-08；

2012-10-26.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51076117).

王雅博(1984— )，女，博士研究生，wang_yabo@tju.edu.cn.

諸 凱，zhukai210@tju.edu.cn.