不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細(xì)胞影響的生物學(xué)研究*

黃 正，楊松濱，劉益杰，褚立希，馮 偉，陳世宣

(上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是中老年人的一種常見疾病，慢性起病，造成患者關(guān)節(jié)疼痛、畸形和功能障礙。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，通過一定大小和頻率的力學(xué)刺激來治療骨關(guān)節(jié)炎，具有明顯緩解癥狀和改善關(guān)節(jié)功能的作用［1］。但是力學(xué)治療采用多大的力度和頻率，至今尚無定論，而且治療OA的機(jī)制也尚未明確。關(guān)節(jié)軟骨的退變是OA發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制。越來越多的研究表明，軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨的主要組成部分，其凋亡與OA的進(jìn)程關(guān)系密切［2］。在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中，力學(xué)信號可以通過多種途徑調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化能力。本研究團(tuán)隊的前期工作中已經(jīng)證實，短期內(nèi)持續(xù)的壓力能刺激軟骨細(xì)胞增殖，172kPa的持續(xù)壓力下，軟骨細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)［3-6］。但是力學(xué)治療不僅講究加壓力度，施壓的頻率對治療效果也有影響。因此在持續(xù)性壓力的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究不同頻率的周期性壓力，對揭示力學(xué)方法治療OA的機(jī)理研究具有重要意義。本研究將持續(xù)施加的壓力改進(jìn)為施加不同頻率的周期性壓力，觀察不同頻率組的軟骨細(xì)胞增殖和整合素α1β1分泌的差異，進(jìn)一步揭示手法治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器：胎牛血清(GIBCO，美國)，培養(yǎng)液(Hyclone，美國)，Hank＇s液(Solarbio，中國)，雙抗(GIBCO，美國)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國)，Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，型號：311，美國)，超凈臺(再鑫儀器，VCM-620，中國)，低溫高速臺式離心機(jī)(Eppendorf，美國)，熒光倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，型號：CKX43，日本)，全自動酶標(biāo)儀(Bio-Tek，型號：ELX900，美國)。

1.2 施加不同頻率的周期性壓力控制裝置：通過前期研究使用的裝置［6］，將壓力定為172kPa，加壓頻率按照分組要求設(shè)置B1 組0.2Hz，B 兩組0.5Hz，B3 組1Hz，B4 組2Hz和 B5 組5Hz。

1.3 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與傳代：①取出生時間不到12h的新生新西蘭兔2只，處死;②置于75%酒精100mL浸泡15min消毒;③放置在消毒容器里，于超凈臺中進(jìn)行軟骨分離：剪刀剝離新生兔四肢長骨，剔除干凈肌肉、肌腱和筋膜等軟組織，用手術(shù)刀分離四肢骨骺端透明軟骨，并盡量切碎成小于1m3碎屑;④軟骨細(xì)胞消化分離：將切碎軟骨組織放入兩個無菌離心管，每管軟骨體積約為1mL，加入4mL(4倍于軟骨體積)0.25%胰蛋白酶，在37℃水浴鍋中消化約40min，加入4mL培養(yǎng)液(與胰蛋白酶等體積)終止消化，放入低溫高速臺式離心機(jī)配平后設(shè)定1500轉(zhuǎn)/min，離心5min，吸除上清液;加入4mL濃度為0.5mg/mLⅡ型膠原酶進(jìn)一步消化，37℃水浴鍋中消化4h后，將液體通過200目篩網(wǎng)過濾，濾下的液體放入離心管再經(jīng)低溫高速臺式離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/min，離心5min，吸棄上清液，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，分別接種于4個培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，放入37℃、5%二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天原代軟骨細(xì)胞貼壁即可換培養(yǎng)液，并于熒光倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況?？梢娫浌羌?xì)胞呈小圓、多角等形態(tài)，胞漿淡、飽滿，見圖1。

每天將培養(yǎng)皿在超凈臺中更換培養(yǎng)液一次，注意無菌操作，避免細(xì)胞污染。一般于24-48h后，顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞貼壁情況良好，細(xì)胞呈梭形。等長滿培養(yǎng)皿底部80-90%左右，即可進(jìn)行消化傳代。傳代使用1：3的比例，傳至第三代細(xì)胞表型穩(wěn)定，即可進(jìn)行實驗見圖2。

圖1 原代軟骨細(xì)胞：細(xì)胞剛貼壁，生長稀疏，形態(tài)呈小圓形、多角形，胞漿淡、飽滿。

圖2 第三代軟骨細(xì)胞：細(xì)胞生長旺盛、緊密，形態(tài)呈梭形、長條形。

1.4 各組軟骨細(xì)胞增殖的測定：第三代兔軟骨細(xì)胞生長狀態(tài)良好、表型穩(wěn)定，用0.25%胰酶消化分離后離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/min，離心5min，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，按3×105個/孔密度接種到6孔板，并分為：A組常規(guī)培養(yǎng)不施加壓力，B組172kPa壓力以不同頻率干預(yù)2h/d：B1組頻率0.2Hz，B2組0.5Hz，B3 組1Hz，B4 組 2Hz，B5 組 5Hz)。干預(yù) 3d 后各組按 5×104密度分別接種到96孔板，每組8孔，細(xì)胞過夜貼壁。第2天測定細(xì)胞增殖：吸棄96孔板培養(yǎng)上液，每孔加入100μL含10%WST-1試劑的培養(yǎng)液，37℃孵育2h后，450nm波長測定各孔吸光度OD值。根據(jù)各孔的吸光度和對照孔的比值分析軟骨細(xì)胞的增殖情況。

1.5 各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中整合素α1β1的測定：軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及傳代同1.4，細(xì)胞消化分離后按3×105個/孔密度接種到6孔板，分組與干預(yù)方法同1.4。3d后收集各孔細(xì)胞上清液，放入離心管，離心機(jī)按照1500轉(zhuǎn)/min，離心20min，仔細(xì)收集上液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定各組培養(yǎng)上清液中整合素α1β1的含量。

2 結(jié)果

2.1 不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細(xì)胞增殖的影響：相同大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力干預(yù)軟骨細(xì)胞2h/d，作用3d后，細(xì)胞 OD 值對照組 A 組為1.08±0.13，B1組為1.19±0.11，B2 組為1.23 ±0.08，B3 組為1.35 ±0.06，B4 組為1.45 ±0.09，B5組為1.37±0.12。加壓各組與對照組比較 OD值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組各組間OD值差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，峰值出現(xiàn)在B4組。見表1。

表1 不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細(xì)胞增殖及整合素α1β1分泌的影響

2.2 不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細(xì)胞分泌整合素α1β1的影響：相同大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力干預(yù)軟骨細(xì)胞2h/d，作用3d后，整合素α1β1水平對照組A組為3.02±0.26pg/mL，B1組為 3.28 ±0.19pg/mL，B2 組為 3.43 ±0.11pg/mL，B3 組為3.77 ±0.24pg/mL，B4 組為 4.01 ±0.09pg/mL，B5組為3.94±0.13pg/mL，周期性加壓各組與對照組比較整合素α1β1值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組各組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義，峰值出現(xiàn)在B4組。見表1。

相同大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力刺激兔軟骨細(xì)胞，均能增加軟骨細(xì)胞的增殖作用和整合素的含量。其中以2Hz的頻率作用最強(qiáng)。

3 討論

OA是一種慢性、進(jìn)展性骨關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率很高，給患者和社會帶來重大負(fù)擔(dān)。目前已得到共識的觀點是，關(guān)節(jié)軟骨的退變是導(dǎo)致OA發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［7］。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。膠原纖維是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)，能形成復(fù)雜的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，將軟骨細(xì)胞包裹在內(nèi)，使關(guān)節(jié)軟骨能承受壓力、張力及剪切力。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞類型［8］，這些力學(xué)刺激通過膠原纖維傳導(dǎo)至軟骨細(xì)胞，引起細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理變化，最終調(diào)節(jié)軟骨的退變。

整合素是軟骨細(xì)胞的一種膠原受體，由α和β兩個亞單位組成，能夠接受來自細(xì)胞外基質(zhì)傳導(dǎo)到細(xì)胞的力學(xué)刺激信號。整合素在力學(xué)刺激下與相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白結(jié)合后發(fā)生空間結(jié)構(gòu)改變，介導(dǎo)了軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號通路，它是軟骨細(xì)胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的前提，并進(jìn)一步調(diào)控軟骨的增殖、分化、生長、凋亡甚至影響到細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)［9，10］。有研究發(fā)現(xiàn)［11］，整合素作為最重要的細(xì)胞表面力學(xué)刺激受體之一，通過細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架信號傳導(dǎo)通路，完成力學(xué)刺激的傳導(dǎo)，在防止細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)，甚至在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等生理和病理方面均起著重要的作用［12，13］。已知軟骨細(xì)胞表達(dá)的整合素有：整合素 α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β1、α10β1、αVβ3、αVβ5 等，正常成人軟骨細(xì)胞以 β1型整合素表達(dá)為主［11］，特別是 α1β1、α3β1 和 α5β1，因此 α1β1具有很高的研究價值。

力學(xué)方法治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制離不開生物力學(xué)和軟骨細(xì)胞研究。軟骨細(xì)胞對骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生和發(fā)展起著關(guān)鍵作用。軟骨細(xì)胞的增殖分化與力學(xué)刺激有密切關(guān)系，整合素就是揭示這種關(guān)系的關(guān)鍵因子，因此研究力學(xué)方法對骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，可以從力學(xué)刺激-整合素-軟骨細(xì)胞-骨關(guān)節(jié)炎這條途徑著手。

在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)撵o水壓力刺激軟骨細(xì)胞，能上調(diào)Ⅱ型膠原、蛋白多糖和糖氨聚糖等mRNA的表達(dá);并且在一定水平內(nèi)靜水壓越高，軟骨細(xì)胞表型越穩(wěn)定［3，4］。周期性力學(xué)刺激能促進(jìn)基質(zhì)合成，而持續(xù)性靜壓力則使基質(zhì)合成減少［14］。Kian［15］對體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加24h周期性的牽張力，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原表達(dá)上調(diào)，同時作為其受體的整合素α1與之同步上調(diào)，而整合素α5則只有較小的變化。馬軍利等［16］研究發(fā)現(xiàn)一定大小和適宜時間的靜壓力能促進(jìn)整合素α2的表達(dá)，持續(xù)時間較長、較大的靜壓力則抑制軟骨整合素α2的表達(dá)。這些研究涉及到力學(xué)刺激的大小和作用時間等參數(shù)，但是沒有深入研究力學(xué)刺激頻率對軟骨細(xì)胞代謝和基因表達(dá)的影響。

研究力學(xué)方法對骨關(guān)節(jié)炎治療的機(jī)制，必須同時闡明力學(xué)大小和刺激頻率對軟骨細(xì)胞的影響機(jī)制，二者缺一不可。本研究在前期持續(xù)性壓力對軟骨細(xì)胞作用的實驗基礎(chǔ)上，采用同樣加壓力度、不同頻率的周期性壓力刺激軟骨細(xì)胞，研究不同的刺激頻率對軟骨細(xì)胞增殖以及整合素表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：施加 172kPa，刺激頻率分別 0.2Hz、0.5Hz、1Hz、2Hz、5Hz 的周期性壓力，均能增加軟骨細(xì)胞的增殖作用和整合素α1β1的含量。其中頻率為2Hz的周期性壓力作用最強(qiáng)。說明力學(xué)刺激能夠通過上調(diào)整合素α1β1，引起基質(zhì)成分的變化，進(jìn)一步可以上調(diào)軟骨細(xì)胞的增殖作用。但并非頻率越高作用越強(qiáng)。本實驗中以2Hz頻率的周期性壓力作用最強(qiáng)。這對揭示不同頻率的力學(xué)方法對骨關(guān)節(jié)炎治療效果的機(jī)制具有重要意義，并且在臨床治療骨關(guān)節(jié)炎時，對采取何種推拿手法，使用多大的力度和頻率進(jìn)行力學(xué)方法治療具有指導(dǎo)意義。但是哪種頻率和多大的力度組合能得到最佳治療效果，還有這種組合的力學(xué)刺激在力學(xué)信號通路方面的研究尚未闡明，這將成為今后研究的重點和趨勢。

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