SCCmec相關(guān)的psm－mec在血液來(lái)源人葡萄球菌中的分布

楊永長(zhǎng)，陳亮，肖代雯，喻華，劉華，黃文芳

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610072）

psm－mec是2009年Queck等在SCCmec上發(fā)現(xiàn)的一種新基因，其位于移動(dòng)遺傳元件SCCmec（Staphylococcal Cassette Chromosome mec）上，主要存在于院內(nèi)感染相關(guān)的SCCmec II和III型葡萄球菌中［1］。研究發(fā)現(xiàn)，psm－mec具有調(diào)控毒力和生物被膜的能力，psm－mec缺陷和psm－mec突變可增加耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的毒力，降低其生物被膜形成能力，在無(wú)生物被膜形成能力的表皮葡萄球菌中，導(dǎo) 入psm－mec 可 誘 導(dǎo) 生 物 被 膜 形 成［2－5］。Monecke等［6］發(fā)現(xiàn)psm－mec同樣存在于人葡萄球菌中，人葡萄球菌可在嬰幼兒和免疫抑制患者中引起菌血癥［7－9］。到目前為止，尚未見(jiàn)血液來(lái)源人葡萄球菌psm－mec的相關(guān)報(bào)道。為了探討psm－mec在人葡萄球菌中的功能，本研究首先采用分子生物學(xué)技術(shù)分析psm－mec在血液分離人葡萄球菌中的分布特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

25株人葡萄球菌來(lái)自2011年6月～2013年1月我院臨床分離血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本，所有菌株采用VITEK－2COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定。

1.2 儀器與試劑

全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK－2 COMPACT，法國(guó)生物梅里埃），PCR擴(kuò)增儀（PTC－200，美國(guó)Bio－Rad），Gel Doc XR＋凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad），SAV－570電泳儀（美國(guó)Savant）；PCR反應(yīng)體系、100bp DNA marker購(gòu)自北京康為世紀(jì)，mecA、psm－mec和SCCmec分型引物由上海invitrogen合成。

1.3 細(xì)菌收集和DNA提取

復(fù)蘇低溫保存的人葡萄球菌，接種至血平板，37℃5%CO2培養(yǎng)24h，收集細(xì)菌，10 000rpm離心5 min，沉淀加40μL DNA提取液，加熱100℃10 min后，10 000rpm離心5min，上清液即為人葡萄球菌DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增人葡萄球菌mecA及psm－mec基因

根據(jù)文獻(xiàn)［1］設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增人葡萄球菌的mecA 和psm－mec基因，mecA 引 物 序列為：mecA F 5＇－TCCAGATTACAACTTCACCAGG－3＇，mecA R 5＇－CCACTTCATATCTTGTAACG－3＇ ，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為527bp。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 5μL，上下游引物各0.25μL，DNA 1.5 μL，DH2O 3μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5mim。psm－mec引物序列為：psm－mec F 5＇－CGAAAGCCTGAAT GCAAGTCT－3＇psm－mec R 5＇－GGATTTCACTGGTGTTAT TACAAGC－3＇PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為130bp。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 5μL，上下游引物各0.25 μL，DNA 1.5μL，DH2O 3μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，42℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5mim。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后Bio－Rad凝膠成像儀檢測(cè)。

1.5 多重PCR檢測(cè)耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec型別

根據(jù)文獻(xiàn)［10］設(shè)計(jì)引物，SCCmec擴(kuò)增位點(diǎn)，引物序列和產(chǎn)物大小如表1所示。配制200nmol／L引物 KDP F1／R1、RIF4F3／R9為 M1；800nmol／L的引物DCS F2／R1、MECI P2／P3、IS431P4為 M2；400nmol的引物CIF2F2／R2、MECI P2／P3、RIF5 F10／R13、pUB110R1、pT181R為 M3。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10μL，ddH2O 6μL，引物 M1 0.5μL、M2 0.5μL、M3 1μL，DNA 2μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃30s，72℃30s，50℃30s，72 ℃ 1min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸4min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后Bio－Rad凝膠成像儀檢測(cè)。

表1 人葡萄球菌SCCmec擴(kuò)增位點(diǎn)，引物序列和片段大小

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增mecA和psm－mec基因的檢測(cè)結(jié)果

PCR凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，25株血液分離的人葡萄球菌中，mecA陽(yáng)性菌株占84%（21／25），mecA陰性菌株占16%（4／25）。在10株mecA陽(yáng)性人葡萄球菌中檢測(cè)到psm－mec基因，其余15株人葡萄球菌未檢測(cè)到psm－mec基因。

2.2 多重PCR檢測(cè)人葡萄球菌SCCmec分型

多重PCR凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，21株耐甲氧西林人葡萄球菌中，3株只擴(kuò)增出A位點(diǎn)，暫定為SCCmec類(lèi)I型，1株為SCCmecⅢA型，1株為SCCmecⅢB型，4株擴(kuò)增出C和E或F位點(diǎn)，暫定為SCCmec類(lèi)IIIA型，1株只擴(kuò)增出A和C位點(diǎn)，暫定為SCCmec類(lèi)IIIB型，3株只擴(kuò)增出mecA，暫定為SCCmec類(lèi)Ⅳ，剩下8株無(wú)法分型，暫定為SCCmec新型別（見(jiàn)表2）。

2.3 psm－mec在人葡萄球菌SCCmec的分布

分析mecA、psm－mec和SCCmec型別的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)psm－mec基因主要分布在耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec III、類(lèi)III型和SCCmec新型別上，其中1株分布于SCCmecⅢA，1株分布于SCCmecⅢB，4株分布于SCCmec類(lèi)IIIA，1株分布于SCCmec類(lèi)IIIB，3株分布于SCCmec新型別。而在11株耐甲氧西林人葡萄球菌和（3株SCCmecIV－dcs，3株SCCmec I－dcs，5株SCCmec新型別）4株甲氧西林敏感人葡萄球菌中不存在psm－mec基因（見(jiàn)表3）。

表2 多重PCR檢測(cè)耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec型別

表3 psm－mec在人葡萄球菌SCCmec上的分布

圖2 多重PCR擴(kuò)增SCCmec的凝膠電泳結(jié)果

3 討論

人葡萄球菌可感染嬰幼兒和免疫力低下患者，F(xiàn)ajardo Olivares等［11］報(bào)道耐甲氧西林人葡萄球菌的分離率在凝固酶陰性葡萄球菌感染患兒中占第二位。Garza－González等［12］研究顯示：臨床分離的人葡萄球菌中，絕大部分都是甲氧西林耐藥株。Mendoza－Olazarán等［13］發(fā)現(xiàn)血培養(yǎng)分離菌株中，81%為攜帶mecA的人葡萄球菌。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)血液來(lái)源的84%人葡萄球菌攜帶mecA，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

甲氧西林耐藥主要與mecA有關(guān)，其為編碼低親和力青霉素結(jié)合蛋白的外源性DNA以復(fù)合體的形式存在于可移動(dòng)性SCCmec上。SCCmec由mec復(fù)合體和染色體盒重組復(fù)合體（ccr）兩部分組成，根據(jù)mec和ccr同源性重組不同，可將SCCmec分為不同的類(lèi)型。文獻(xiàn)報(bào)道，絕大多數(shù)臨床分離的耐甲氧西林人葡萄球菌屬于不可分型SCCmec型別。2002年Oliveira等［10］以各型獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)建立的多重PCR是目前應(yīng)用最為廣泛的SCCmec分型技術(shù)，本研究應(yīng)用Oliveira多重PCR對(duì)21株mecA陽(yáng)性人葡萄球菌分型，結(jié)果顯示：1株屬于SCCmec IIIA型，1株屬于SCCmec IIIB型，19株無(wú)法分型。在無(wú)法分型的SCCmec多重PCR結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)3株只擴(kuò)增出pls位點(diǎn)，暫定為SCCmec類(lèi)I型（SCCmec I－dcs），4株擴(kuò)增出C和E或F位點(diǎn)，暫定為SCCmec類(lèi)IIIA型（3株SCCmecIIIA－Tn554／orfX，1株SCCmecIIIA－pI258／Tn544），1株擴(kuò)增出A和C位點(diǎn)，暫定為SCCmec類(lèi)IIIB型（SCCmecIIIB＋pls），3株只擴(kuò)增出mecA，暫定為SCCmec類(lèi)Ⅳ（SCCmecIV－dcs），剩下8株無(wú)法分型，暫定為SCCmec新型別。分型結(jié)果提示人葡萄球菌中SCCmec具有多樣性，與國(guó)外報(bào)道［5］相似。

psm－mec基因是位于SCCmec上的一段DNA片段，一端與mecR1基因相連，另一端與xylR基因相連，主要存在于院內(nèi)感染的SCCmec II型和III型中，研究顯示，在金黃色葡萄球菌中，psm－mec具有調(diào)控MRSA毒力和生物被膜的能力，且psm－mec可存在于人葡萄球菌中［2－6］。為了探討psm－mec在血液來(lái)源人葡萄球菌中的分布，在深入分析人葡萄球菌SCCmec型別的基礎(chǔ)上，筆者通過(guò)PCR擴(kuò)增psm－mec基因片段，分析其與SCCmec型別的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：血液分離的47.6%耐甲氧西林人葡萄球菌攜帶psm－mec基因，而在 MRSA中，大約10% 菌株攜帶psm－mec基因，MRSE中約68%攜帶此基因［6］，說(shuō)明血液來(lái)源的耐甲氧西林人葡萄球菌psm－mec 的攜帶率與 MRSE相當(dāng)，遠(yuǎn)高于MRSA的攜帶率。psm－mec陽(yáng)性菌株中，70%菌株分布于SCCmecⅢ（IIIA和IIIB）和類(lèi)III型（SCCmecIIIA－Tn554／orfX， SCCmecIIIA－pI258／Tn544，SCCmecIIIB＋pls），30%分布于SCCmec新型別。在psm－mec陽(yáng)性的SCCmec新型別中，1株含 mec I、dcs和IS431／pUB110區(qū)域，1株含pls、kdp、mecI和pI258／Tn554區(qū)域，1株含pls、mecI和Tn554／orfX區(qū)域，接下來(lái)研究將進(jìn)一步分析SCCmec新型別。

綜上所述，本研究證實(shí)了psm－mec基因在血液來(lái)源的人葡萄球菌中分布廣泛，主要存在于SCCmec III型、類(lèi)III型和SCCmec新型別中，對(duì)了解人葡萄球菌的分子特征具有重要意義。

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